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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die offene Suche ermöglicht die Identifizierung von Glykopeptiden, die mit bisher unbekannten Glykanzusammensetzungen verziert sind. In diesem Artikel wird ein optimierter Ansatz für die Durchführung einer offenen Suche und anschließende Glykan-fokussierte Glykopeptidsuche für Bakterienproben unter Verwendung von Acinetobacter baumannii als Modell vorgestellt.

Zusammenfassung

Die Proteinglykosylierung wird zunehmend als häufige Modifikation in bakteriellen Organismen anerkannt, die zur prokaryotischen Physiologie und optimalen Infektiosität pathogener Spezies beiträgt. Aus diesem Grund steigt das Interesse an der Charakterisierung der bakteriellen Glykosylierung und der Bedarf an Hochdurchsatz-Analysewerkzeugen zur Identifizierung dieser Ereignisse. Obwohl die Bottom-up-Proteomik leicht die Generierung reichhaltiger Glykopeptiddaten ermöglicht, machen die Breite und Vielfalt der in prokaryotischen Spezies beobachteten Glykane die Identifizierung bakterieller Glykosylierungsereignisse äußerst schwierig.

Traditionell machte die manuelle Bestimmung von Glykanzusammensetzungen in bakteriellen Proteomdatensätzen dies zu einer weitgehend maßgeschneiderten Analyse, die auf feldspezifische Experten beschränkt war. In jüngster Zeit haben sich offene suchbasierte Ansätze als leistungsfähige Alternative zur Identifizierung unbekannter Modifikationen herauskristallisiert. Durch die Analyse der Häufigkeit einzigartiger Modifikationen, die an Peptidsequenzen beobachtet wurden, ermöglichen offene Suchtechniken die Identifizierung von gewöhnlichen Glykanen, die an Peptide in komplexen Proben gebunden sind. Dieser Artikel stellt einen optimierten Workflow für die Interpretation und Analyse von glykoproteomischen Daten vor und zeigt, wie offene Suchtechniken verwendet werden können, um bakterielle Glykopeptide ohne Vorkenntnisse der Glykanzusammensetzungen zu identifizieren.

Mit diesem Ansatz können Glykopeptide in Proben schnell identifiziert werden, um Glykosylierungsunterschiede zu verstehen. Am Beispiel von Acinetobacter baumannii ermöglichen diese Ansätze den Vergleich von Glykanzusammensetzungen zwischen Stämmen und die Identifizierung neuartiger Glykoproteine. Zusammengenommen demonstriert diese Arbeit die Vielseitigkeit offener Datenbanksuchtechniken zur Identifizierung der bakteriellen Glykosylierung, wodurch die Charakterisierung dieser sehr unterschiedlichen Glykoproteome einfacher als je zuvor ist.

Einleitung

Die Proteinglykosylierung, der Prozess der Bindung von Kohlenhydraten an Proteinmoleküle, ist eine der häufigsten posttranslationalen Modifikationen (PTMs) in der Natur 1,2. In allen Bereichen des Lebens hat sich eine Reihe komplexer Maschinen entwickelt, die sich der Erzeugung von Glykoproteinen widmen, die eine Vielzahl von zellulären Funktionen beeinflussen 1,3,4,5. Während die Proteinglykosylierung auf einer Reihe von Aminosäuren6,7 auftritt, sind N-verknüpfte und O-verknüpfte Glykosylierungsereignisse zwei dominante Formen, die in der Natur beobachtet werden. Bei der N-verknüpften Glykosylierung werden Glykane an ein Stickstoffatom von Asparaginresten (Asn) gebunden, während bei der O-verknüpften Glykosylierung Glykane an ein Sauerstoffatom aus Serin (Ser), Threonin (Thr) oder Tyrosin (Tyr) -Rückständengebunden sind 7. Trotz der Ähnlichkeiten in den Rückständen, auf die Glykosylierungssysteme abzielen, führen die Unterschiede innerhalb der an Proteine gebundenen Glykane dazu, dass die Glykosylierung die chemisch vielfältigste Klasse von PTMs ist, die in der Natur vorkommen.

Während eukaryotische Glykosylierungssysteme eine Glykandiversität besitzen, sind diese Systeme typischerweise in der Anzahl der verwendeten einzigartigen Kohlenhydrate begrenzt. Die resultierende Vielfalt ergibt sich aus der Art und Weise, wie diese Kohlenhydrate in Glykanen 8,9,10,11,12 angeordnet sind. Im Gegensatz dazu besitzen bakterielle und archaeale Arten aufgrund der schieren Auswahl an einzigartigen Zuckern, die in diesen Systemen erzeugt werden, eine praktisch unbegrenzte Glykanvielfalt 2,10,13,14,15,16,17. Diese Unterschiede in der Glykandiversität, die über Lebensbereiche hinweg beobachtet werden, stellen eine bedeutende analytische Herausforderung für die Charakterisierung und Identifizierung von Glykosylierungsereignissen dar. Für die eukaryotische Glykosylierung hat die Fähigkeit, Glykanzusammensetzungen zu antizipieren, das wachsende Interesse an der Glykobiologie erleichtert; Gleiches gilt jedoch nicht für die bakterielle Glykosylierung, die immer noch weitgehend auf die Untersuchung durch spezialisierte Labors beschränkt ist. Da die Zugänglichkeit von Instrumenten der Massenspektrometrie (MS) in den Biowissenschaften zugenommen hat, sind MS-basierte Ansätze heute die primäre Methode für die glykoproteomische Analyse.

MS hat sich als das wichtigste Werkzeug für die Charakterisierung der Glykosylierung herausgestellt, wobei sowohl Top-down- als auch Bottom-up-Ansätze heute häufig zur Charakterisierung von Glykoproteinenverwendet werden 6. Während Top-down-Proteomik verwendet wird, um globale Glykosylierungsmuster spezifischer Proteine18,19 zu bewerten, werden Bottom-up-Ansätze verwendet, um die glykanspezifische Charakterisierung von Glykopeptiden zu ermöglichen, selbst aus komplexen Mischungen6,20,21,22,23. Für die Analyse von Glykopeptiden ist die Generierung von informativen Fragmentierungsinformationen für die Charakterisierung von Glykosylierungsereignissenessentiell 24,25. Eine Reihe von Fragmentierungsansätzen ist jetzt routinemäßig auf Instrumenten zugänglich, darunter die auf Resonanzionenfallen basierende kollisionsinduzierte Dissoziation (IT-CID), die kollisionsinduzierte Dissoziation vom Strahltyp (CID) und die Elektronentransferdissoziation (ETD). Jeder Ansatz besitzt unterschiedliche Stärken und Schwächen für die Glykopeptidanalyse 25,26, mit signifikanten Fortschritten in den letzten zehn Jahren bei der Anwendung dieser Fragmentierungsansätze zur Analyse der Glykosylierung 6,20. Für die bakterielle Glykosylierungsanalyse war die entscheidende Einschränkung jedoch nicht die Fähigkeit, Glykopeptide zu fragmentieren, sondern die Unfähigkeit, die potenziellen Glykanzusammensetzungen in Proben vorherzusagen. Innerhalb dieser Systeme schränkt die unbekannte Natur verschiedener bakterieller Glykane die Identifizierung von Glykopeptiden ein, selbst mit Glykosylierungs-fokussierten Suchwerkzeugen, die heute für die Analyse eukaryotischer Glykopeptide wie O-Pair27, GlycopeptideGraphMS 28 und GlycReSoft29 üblich sind. Um dieses Problem zu lösen, ist eine alternative Suchmethode erforderlich, wobei sich der Einsatz offener Suchwerkzeuge als leistungsfähiger Ansatz für die Untersuchung der bakteriellen Glykosylierungherausstellt 30.

Die offene Suche, auch Blind- oder Wildcard-Suche genannt, ermöglicht die Identifizierung von Peptiden mit unbekannten oder unerwarteten PTMs 21,30,31,32. Offene Suchen verwenden eine Vielzahl von Berechnungstechniken, einschließlich kuratierter Modifikationssuchen, mehrstufiger Datenbanksuchen oder massentoleranter Suche 33,34,35,36,37. Obwohl die offene Suche ein großes Potenzial hat, wurde ihre Verwendung typischerweise durch die signifikante Zunahme der Analysezeiten und den Verlust der Empfindlichkeit des Nachweises von unmodifizierten Peptiden im Vergleich zu eingeschränkten Suchenbehindert 31,32. Die Abnahme des Nachweises von unmodifizierten Peptid-Spektral-Matches (PSMs) ist ein Ergebnis der erhöhten falsch-positiven PSM-Raten, die mit diesen Techniken verbunden sind, was eine erhöhte strenge Filterung erfordert, um die gewünschten Falscherkennungsraten (FDRs) aufrechtzuerhalten 33,34,35,36,37 . In letzter Zeit sind mehrere Tools verfügbar, die die Zugänglichkeit der offenen Suche erheblich verbessern, darunter Byonic 31,38, Open-pFind 39, ANN-SoLo 40 und MSFragger21,41. Diese Werkzeuge ermöglichen die robuste Identifizierung von Glykosylierungsereignissen, indem sie die Analysezeiten erheblich reduzieren und Ansätze zur Handhabung heterogener Glykanzusammensetzungen implementieren.

Dieser Artikel stellt eine optimierte Methode zur Identifizierung bakterieller Glykopeptide durch offene Suche am Beispiel des gramnegativen nosokomialen Erregers Acinetobacter baumannii vor. A. baumannii besitzt ein konserviertes O-verknüpftes Glykosylierungssystem, das für die Modifikation mehrerer Proteinsubstrate verantwortlich ist, bekannt als das PglL-Proteinglykosylierungssystem42,43,44. Während ähnliche Proteine auf die Glykosylierung zwischen Stämmen abzielen, ist das PglL-Glykosylierungssystem aufgrund der Biosynthese des Glykans, das für die Proteinglykosylierung verwendet wird, sehr variabel, da es vom Kapselort (bekannt als K-Locus) abgeleitet ist44,45,46. Dies führt dazu, dass verschiedene Glykane (auch bekannt als K-Einheit), die aus einzelnen oder begrenzten polymerisierten K-Einheiten abgeleitet sind, zu Proteinsubstraten 30,44,46 hinzugefügt werden. Innerhalb dieser Arbeit wird die Verwendung des offenen Suchwerkzeugs MSfragger innerhalb der Software FragPipe verwendet, um Glykane über A. baumannii-Stämme zu identifizieren. Durch die Kombination von offener Suche und manueller Kuration können "glykanfokussierte Suchen" durchgeführt werden, um die Identifizierung bakterieller Glykopeptide weiter zu verbessern. Zusammen ermöglicht dieser mehrstufige Identifikationsansatz die Identifizierung von Glykopeptiden ohne umfangreiche Erfahrung in der Charakterisierung neuartiger Glykosylierungsereignisse.

Protokoll

HINWEIS: Die Vorbereitung und Analyse von bakteriellen Glykopeptidproben kann in vier Abschnitte unterteilt werden (Abbildung 1). Für diese Studie wurde die Glykosylierung von drei sequenzierten A. baumannii-Stämmen untersucht (Tabelle 1). Proteome FASTA-Datenbanken von jedem dieser Stämme sind über Uniprot zugänglich. Die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Puffer finden Sie in Tabelle 2.

1. Aufbereitung von Proteinproben für die Proteomanalyse

  1. Isolierung von Proteomproben von Interesse
    1. Wenn Sie ganze Zellen verwenden, stellen Sie sicher, dass die Zellen mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) gewaschen wurden, um potenzielle Proteinverunreinigungen in den Medien zu entfernen. Ganze Zellen nach dem Waschen einfrieren und bei -80 °C lagern, bis sie benötigt werden.
    2. Wenn fraktionierte Proben verwendet werden (z. B. Membranpräparate), stellen Sie sicher, dass die verwendeten Reagenzien die nachgeschaltete Flüssigkeitschromatographie-MS-Analyse (LC-MS)50 nicht beeinträchtigen.
    3. Wenn Reinigungsmittel wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Triton X-100, NP-40 oder Lauroylsarcosin verwendet wurden, entfernen Sie diese Reinigungsmittel mit Acetonfällung, SP3-Probenvorbereitungsmethoden51 oder kommerziellen proteomischen Reinigungssäulen wie S-Fallen52. Alternativ können Sie inkompatible Reinigungsmittel durch ein MS-kompatibles oder entfernbares Reinigungsmittel wie Natriumdesoxycholat (SDC) oder Octylglucopyranosid ersetzen.
    4. Stellen Sie sicher, dass alle Kunststoffwaren und Glaswaren, die für die Probenvorbereitung verwendet werden sollen, nicht autoklaviert wurden. Autoklavierte Glaswaren und Kunststoffe sind typischerweise stark mit Verbindungen mit kleinem Molekulargewicht wie Polymeren kontaminiert, die in der MS leicht nachgewiesen werden können.
  2. Solubilisierung von Ganzzellproben
    1. Resuspendieren Sie ~ 10 mg gewaschene, schockgefrorene Zellen in 200 μL frisch zubereitetem Natriumdesoxycholat-Lysepuffer (SDC-Lysepuffer: 4% SDC in 100 mM Tris, pH 8,5).
      HINWEIS: Proteasehemmer können dem SDC-Lysepuffer hinzugefügt werden, um den Proteinabbau zu begrenzen.
    2. Kochen Sie die Proben für 10 min bei 95 °C mit Schütteln (2000 U / min auf einem Thermomixer) und lassen Sie sie dann für 10 min auf Eis. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, um eine effiziente Lyse und Solubilisierung der Proben zu gewährleisten.
      HINWEIS: Proben können an dieser Stelle langfristig bei -80 °C gelagert werden. Bei Lagerung vor der weiteren Verarbeitung durch Erhitzen auf 95 °C resolubilisieren.
  3. Quantifizierung der Probenproteinkonzentrationen mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Proteinassay53. Lagern Sie Proben auf Eis, während Sie eine Quantifizierung durchführen, um den Proteinabbau zu begrenzen.
    HINWEIS: Für die Gesamtproteomanalyse sind 20-100 μg Protein mehr als ausreichend für Nano-LC-MS, die typischerweise weniger als 2 μg Proteinaufschluss pro Analyse erfordert. Die Herstellung von überschüssigem Peptid ermöglicht eine Replikationsanalyse oder eine weitere Fraktionierung, wenn eine tiefe proteomische Abdeckung erforderlich ist. Für die auf Glykopeptidanreicherung basierende Analyse mittels hydrophiler Interaktionschromatographie (HILIC) werden 100-500 μg Protein benötigt.
  4. Proben reduzieren und alkylatieren.
    1. 1/10 des Volumensdes 10-fachen Reduktions-/Alkylierungspuffers (100 mM Tris 2-carboxyethylphosphinhydrochlorid; 400 mM 2-chloracetamid in 1 M Tris, pH 8,5) zu den Proben für eine Endkonzentration von 1x geben und Proben im Dunkeln für 30 min bei 45 °C mit Schütteln bei 1.500 U/min inkubieren.
      HINWEIS: Überprüfen Sie den pH-Wert des 10-fachen Reduktions-/Alkylierungspuffers, um einen pH-Wert von ca. 7,0-8,0 sicherzustellen, bevor Sie den Proben hinzufügen, da ein niedrigerer pH-Wert dazu führt, dass die DEZA ausfällt.
  5. Drehen Sie die Proben kurz nach unten und fügen Sie die Proteasen Trypsin / Lys-C (~ 10 μL, resuspendiert in 100 mM Tris, pH 8,5) für ein endgültiges Protease: Protein-Verhältnis von 1: 100 hinzu. Inkubieren Sie die Digests über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 1.500 U/min (bis zu 18 h). Um eine vollständige Proteinverdauung zu gewährleisten, verwenden Sie ein Trypsin / Lys-C-Protease: Protein-Verhältnis von 1: 50 bis 1: 200.
  6. Quench Digests durch Zugabe von 1,25 Volumen 100% Isopropanol zu den Proben. Wirbeln Sie die Proben für 1 Minute auf, um sie zu mischen und kurz nach unten zu drehen.
    HINWEIS: Proben können bei -20 °C gelagert werden, um später weiterverarbeitet zu werden.
  7. Ansäuern Sie die Proben durch Zugabe von 0,115 Volumina von 10% Trifluoressigsäure (TFA; Endkonzentration von ~ 1% TFA), wirbeln Sie die Proben ein und drehen Sie sie kurz nach unten.

2. Verarbeitung von Proteomproben

  1. Peptidreinigung von Proteomproben
    1. Bereiten Sie eine Styrol-Vinylbenzol-Umkehrphasensulfonat (SDB-RPS) Stop-and-Go-Extraktion (Stage) Spitze für jede Probe wie zuvor beschriebenvor 54.
      1. Empirisch werden zur Bindung von 50 μg Peptid drei SDB-RPS-Bandscheiben aus einer 47 mm2 SDB-RPS-Membran mit einer stumpfen Nadel (14 G) herausgeschnitten. Für größere Peptidmengen erhöhen Sie die Anzahl der Bandscheiben entsprechend.
    2. Bereiten Sie vor der Verwendung von SDB-RPS Stage Tips die Spitzen vor, indem Sie nacheinander mindestens zehn Bettvolumen der folgenden Puffer hinzufügen und entweder den Puffer durch Zentrifugation (25 °C, 3 min, 500 × g) durch die Säule drehen oder indem Sie den Puffer durch sanftes Druckanlegen mit einer Spritze durch die Säule drücken.
      1. Befeuchten Sie die Spitzen mit 150 μL 100% Acetonitril.
      2. Waschen Sie die Spitzen mit 150 μL 30% Methanol, 1% TFA in 18,2 MΩ H2O.
      3. Equilibrieren Sie die Spitzen mit 150 μL 90% Isopropanol, 1% TFA ausgeglichen mit 18,2 MΩ H2O.
    3. Die Proben (mit 50 % Isopropanol, 1 % TFA) werden durch Zentrifugation (25 °C, 3 min, 500 × g) oder durch sanftes Ausüben von Druck mit einer Spritze auf die SDB-RPS Stage Tips geladen.
    4. Waschen Sie die SDB-RPS Stage Tips mit den folgenden Puffern durch Zentrifugation (25 °C, 3 min, 500 × g) oder durch sanftes Druckaufbringen mit einer Spritze.
      HINWEIS: Zusätzliche Waschungen oder alternative Puffer können verwendet werden, um Nicht-Peptid-Verunreinigungen zu entfernen, wie z. B. die Verwendung von Ethylacetat anstelle von Isopropanol55.
      1. Waschen Sie die Spitzen mit 150 μL 90% Isopropanol, 1% TFA.
      2. Waschen Sie die Spitzen mit 150 μL 1% TFA in 18,2 MΩ H2O.
    5. Eluieren Sie die Peptide aus den SDB-RPS Stage Tips mit 150 μL 5% Ammoniumhydroxid in 80% Acetonitril durch Zentrifugation oder durch sanftes Druckanlegen mit einer Spritze. Sammeln Sie die Proben in einzelnen Röhrchen.
      HINWEIS: Bereiten Sie 5% Ammoniumhydroxid in 80% Acetonitril in einem Kunststoffbehälter unmittelbar vor der Verwendung in einem Abzug vor.
    6. Die eluierten Peptide werden durch Vakuumzentrifugation bei 25 °C getrocknet.
      HINWEIS: Bei einer HILIC-Anreicherung können an dieser Stelle 1-10% der Peptideluate entfernt, getrocknet und als Gesamtproteom-Eingangskontrollen verwendet werden.
  2. Anreicherung von Glykopeptidproben
    1. Vorbereiten von Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (ZIC-HILIC) Stage Tips wie zuvor beschrieben54,56.
      1. Kurz gesagt, entfernen Sie eine C 8-Disc mit einer stumpfen Nadel (14 G) aus einer 47 mm2 C8-Membran und packen Sie die Disc in eine P200-Spitze, um eine Fritte zu erzeugen. Etwa 5 mm ZIC-HILIC-Material, resuspendiert in 50% Acetonitril, 50% 18,2 MΩH2O, auf die Fritte geben, indem Sie vorsichtig Druck mit einer Spritze ausüben.
    2. Bevor Sie ZIC-HILIC Stage Tips verwenden, konditionieren Sie das Harz, indem Sie nacheinander die folgenden Puffer hinzufügen und vorsichtig Druck mit einer Spritze ausüben.
      HINWEIS: Um die Integrität der Pseudowasserschicht auf der Oberfläche des ZIC-HILIC-Harzes (erforderlich zur Anreicherung von Glykopeptiden) zu gewährleisten, muss das Harz immer nass bleiben. Lassen Sie beim Waschen des Harzes immer ~ 10 μL Lösungsmittel über dem Harz und stellen Sie sicher, dass die Waschungen / Proben direkt in dieses Restlösungsmittel pipettiert werden.
      1. Das Harz wird mit 20 Bettvolumina (200 μL) ZIC-HILIC-Elutionspuffer (0,1 % TFA in 18,2 MΩ H2O) ausgeglichen.
      2. Waschen Sie das Harz mit 20 Bettvolumen (200 μL) ZIC-HILIC-Zubereitungspuffer (95% Acetonitril in 18,2 MΩ H2O).
      3. Waschen Sie das Harz mit 20 Bettvolumen (200 μL) ZIC-HILIC-Lade-/Waschpuffer (80% Acetonitril, 1% TFA ausgeglichen mit 18,2 MΩ H2O).
    3. Die getrockneten verdauten Proben (ab Schritt 2.1.6) im ZIC-HILIC-Lade-/Waschpuffer auf eine Endkonzentration von 4 μg/μL resuspendieren (z. B. für 200 μg Peptid in 50 μL ZIC-HILIC-Lade-/Waschpuffer). Wirbeln Sie kurz für 1 Minute vor, um sicherzustellen, dass die Proben resuspendiert sind, und drehen Sie sie für 1 Minute bei 2.000 × g bei 25 ° C nach unten.
    4. Laden Sie die resuspendierte Peptidprobe auf eine konditionierte ZIC-HILIC-Säule.
      1. Dreimal waschen Sie mit 20 Bettvolumen (200 μL) ZIC-HILIC-Lade-/Waschpuffer (für insgesamt 60 Bettvolumenwäschen), indem Sie vorsichtig Druck mit einer Spritze ausüben.
      2. Elute Glykopeptide mit 20 Bettvolumina (200 μL) ZIC-HILIC-Elutionspuffer werden durch sanftes Druckanlassen mit einer Spritze in ein 1,5-ml-Röhrchen umgewandelt und anschließend das Eluat durch Vakuumzentrifugation bei 25 °C trocknen.

3. LC-MS von Proteom/Glykopeptid-angereicherten Proben

  1. Resuspendieren Sie die Proben in Puffer A* (2% Acetonitril, 0,1% TFA) auf eine Endkonzentration von 1 μg/μL (z. B. für 50 μg Peptid in 50 μL Puffer A*).
  2. Laden Sie die Proben auf eine HPLC/UPLC, die mit einer MS gekoppelt ist, um die Trennung und Identifizierung von Glykopeptiden zu ermöglichen.
    HINWEIS: Die Säulenparameter, einschließlich Innendurchmesser, Länge, Durchflussraten, Art des Chromatographieharzes und erforderliche Peptidinjektionsmengen, sollten für den analytischen Aufbau und die zu verwendende Gradientenlänge optimiert werden. Ein Beispiel für die Optimierung analytischer Setups finden Sie unter57.
  3. Überwachen Sie die Erfassung der resultierenden MS-Daten, um sicherzustellen, dass die Daten mit den gewünschten Parametern gesammelt werden.
    HINWEIS: Für die Kompositionsanalyse ist die CID-Fragmentierung ausreichend. Aufgrund der Zugabe von Glykanen zu Glykopeptiden werden Glykopeptidionen typischerweise mit einer höheren m/z und geringerer Ladungsdichte beobachtet als unglykosylierte Peptide. Um sicherzustellen, dass diese Ionen beobachtbar sind, lassen Sie einen MS1-Massenbereich von 400 bis 2.000 m/z zu.
  4. Fragmentieren Sie ausgewählte Ionen mit CID, um die Sammlung von Fragmentionen mit niedrigem m/z-Gehalt zu gewährleisten, die Oxoniumionen enthalten, die für die Charakterisierung von Glykanen wichtig sind.
    HINWEIS: Die Fragmentierung von Glykopeptiden unter Verwendung von CID wird sowohl von der Peptid- als auch von der Glykansequenz sowie von der während der Fragmentierung aufgewendeten Energie beeinflusst 25,58,59. Während eine Reihe verschiedener Kollisionsenergien verwendet werden kann, ist eine optimale Strategie zur Fragmentierung von Glykopeptiden die Verwendung von abgestuften Kollisionsenergien, die die Verwendung mehrerer Kollisionsenergien 25,59,60 kombinieren.
  5. Verwenden Sie alternative Fragmentierungsmethoden, falls verfügbar, z. B. ETD für die Standortlokalisierung oder IT-CID, um die Bestimmung von Glykanzusammensetzungen zu unterstützen.
    HINWEIS: Keiner dieser Fragmentierungsansätze ist für die Zusammensetzungsanalyse unerlässlich, kann jedoch gesammelt werden, um eine weitere Abfrage von Glykopeptiden von Interesse zu ermöglichen.

4. Analyse von Proteom/Glykopeptid-angereicherten Proben

  1. Vorfiltern von Datendateien, um die Suche in FragPipe zu ermöglichen
    1. Wenn ETD- oder IT-CID-Scans innerhalb von Datensätzen erfasst wurden, filtern Sie diese Scanereignisse mit MSConvert61 aus den Datendateien, bevor Sie mit FragPipe suchen.
      HINWEIS: Für die unten beschriebenen offenen Suchparameter sind nur strahlartige CID-Daten erforderlich.
  2. Offene Suchen in FragPipe durchführen
    1. Öffnen Sie FragPipe, und klicken Sie auf die Registerkarte Workflow. Wählen Sie im Pulldown-Menü Workflow die Option Suche öffnen aus, und klicken Sie auf Dateien hinzufügen , um die zu durchsuchenden Datendateien in FragPipe zu importieren (Abbildung 2A).
    2. Klicken Sie auf die Registerkarte Datenbank und starten Sie den Download-Manager, indem Sie auf Herunterladen klicken. Auf diese Weise können Proteomdatenbanken mit einer Uniprot Proteome-ID von Uniprot heruntergeladen werden. Klicken Sie im Download-Manager auf die Option Lockvögel und Verunreinigungen hinzufügen, um Lockvögel und Schadstoffproteine in Datenbanken zu integrieren.
    3. Für strengere FDR-Schwellenwerte klicken Sie auf die Registerkarte Validierung , und ändern Sie den Filter- und Berichtswert von 0,01 in den erforderlichen FDR.
      HINWEIS: Die Standardeinstellungen für FragPipe gewährleisten einen FDR von 1% auf Proteinebene.
    4. Klicken Sie auf die Registerkarte MSfragger . Erhöhen Sie im Feld Peak-Übereinstimmung die Massentoleranz des Vorläufers von den Standardwerten 500 Da auf 2.000 Da, um die Identifizierung großer Modifikationen zu ermöglichen (Abbildung 2A).
    5. Klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen und definieren Sie die Position der Ausgaben von FragPipe. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um die Suche zu starten.
  3. Identifizieren Sie unter Verwendung der PSMs, die in Datensätzen identifiziert wurden (die in den psm.tsv-Ausgaben von FragPipe enthalten sind), potenzielle Glykane, indem Sie die Häufigkeit der beobachteten Deltamassen in Datensätzen aufzeichnen (Abbildung 3). Erstellen Sie Delta-Massenplots aus MSfragger-Ausgaben mit den R-Skripten, auf die über den PRIDE-Beitritt PXD027820 zugegriffen werden kann.
    HINWEIS: Innerhalb dieser Skripte wird nur eine minimale Nachbearbeitung der offenen Suchergebnisse durchgeführt, da der Hauptzweck dieser Skripte darin besteht, die Visualisierung von Delta-Massenprofilen zu unterstützen. Wichtig ist, dass die Beobachtung von reichlich vorhandenen Deltamassen allein kein Beweis dafür ist, dass eine Modifikation ein potenzielles Glykan ist, da die Zuweisung von Deltamassen als Glykane eine weitere Analyse der entsprechenden MS2-Ereignisse erfordert.
  4. Um die Charakterisierung von Glykopeptiden innerhalb von Proben zu ermöglichen, konzentrieren Sie sich auf Delta-Massenidentifikationen mit hoher Zuverlässigkeit, die Zuweisungen mit hohen Hyperscores entsprechen.
    1. Um bei der Beurteilung von Glykopeptidspektren zu helfen, verwenden Sie Peptidannotationswerkzeuge wie den Interactive Peptide Spectral Annotator63, der die Zuordnung von peptidassoziierten Ionen innerhalb von Spektren ermöglicht und die manuelle Identifizierung der Glykan-assoziierten Ionen ermöglicht (Abbildung 4).
      HINWEIS: Innerhalb der hier vorgestellten Datensätze gelten Hyperscores von >30 als High Scoring, da diese Scores innerhalb der oberen 50% aller identifizierten Glykopeptide entsprechen (Abbildung 5).
  5. Identifizieren Sie bei hochsicheren Glykopeptiden die häufig beobachteten Glykan-assoziierten Ionen (Abbildung 4), um die Identifizierung von Glykopeptiden zu verbessern.
    HINWEIS: Durch die Einbeziehung von Glykan-assoziierten Ionen in Suchanfragen, die als Glykan-fokussierte Suchen bekannt sind, kann die Qualität der Glykopeptid-Zuweisungen verbessert werden.
    1. Klicken Sie auf die Registerkarte MSfragger von FragPipe, und integrieren Sie die ermittelten Deltamassen der beobachteten Glykane in die Abschnitte Variable modifications und Mass Offsets . Fügen Sie diese Massen hinzu, indem Sie Werte in die Abschnitte Variable modifications und Mass Offsets eingeben, wobei einzelne Massen durch ein / getrennt sind. Fügen Sie die Glykan-assoziierten Fragmentmassen dieser Glykane in den Glyco/Labile Mods-Abschnitt von MSFragger hinzu.
      HINWEIS: Abbildung 2B zeigt die wichtigsten Informationen, die für eine glykanfokussierte Suche des A. baumannii-Stammes AB307-0294 erforderlich sind.
  6. Laden Sie alle MS-Daten, die mit Proteomik-Studien verknüpft sind, in zentralisierte Proteomic-Repositories wie die PRIDE- oder MASSIVE-Repositories hoch.
    HINWEIS: Alle mit dieser Studie verbundenen Daten wurden im proteomischen PRIDE-Repository hinterlegt und können über den PRIDE-Beitritt abgerufen werden: PXD027820.

Ergebnisse

Um den Nutzen der offenen Suche nach bakterieller Glykopeptidanalyse zu veranschaulichen, wurde die chemische Vielfalt von O-verknüpften Glykanen innerhalb von drei Stämmen von A. baumannii-AB307-0294, ACICU und D1279779-bewertet. Die O-verknüpften Glykoproteome sind zwischen den Stämmen von A. baumannii sehr variabel, da die für die Glykosylierung verwendeten Glykane von den hochvariablen Kapselloci44,45,46

Diskussion

Open Search ist eine effektive und systematische Methode zur Identifizierung unbekannter Modifikationen. Während die Identifizierung unbekannter Glykane in bakteriellen Proteomproben traditionell ein zeitaufwendiges und technisch spezialisiertes Unterfangen war, ermöglichen die jüngsten Entwicklungen von Werkzeugen wie MSfragger 21,41 und Byonic 31,38 nun die schnelle und effektive Identifizierung von Deltamassen zur weiteren Charakterisierung als potenzielle Glykane

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

N.E.S wird durch ein Australian Research Council Future Fellowship (FT200100270) und ein ARC Discovery Project Grant (DP210100362) unterstützt. Wir danken der Melbourne Mass Spectrometry and Proteomics Facility des Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute für den Zugang zu MS-Instrumenten.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
14 G Kel-F Hub point style 3Hamilton companyhanc90514
2-ChloroacetamideSigma Aldrich Pty LtdC0267-100G
AcetonitrileSigma Aldrich Pty Ltd34851-4L
Ammonium hydroxide (28%)Sigma Aldrich Pty Ltd338818-100ML
BCA Protein Assay Reagent APierce23228
BCA Protein Assay Reagent BPierce23224
C8 Empore SPESigma Aldrich Pty Ltd66882-UAn alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Formic acidSigma Aldrich Pty Ltd5.33002
IsopropanolSigma Aldrich Pty Ltd650447-2.5L
MethanolFisher ChemicalM/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate)Sigma Aldrich Pty Ltd66886-UAn alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium DeoxycholateSigma Aldrich Pty LtdD6750-100G
ThermoMixer CEppendorf2232000083
trifluoroacetic acidSigma Aldrich Pty Ltd302031-10X1ML
Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochlorideSigma Aldrich Pty LtdC4706-2G
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma Aldrich Pty Ltd252859-500G
Trypsin/Lys-C protease mixturePromegaV5073
Vacuum concentratorLabconco7810040
ZIC-HILIC materialMerck1504580001Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin

Referenzen

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