JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La ricerca aperta consente l'identificazione di glicopeptidi decorati con composizioni di glicani precedentemente sconosciute. All'interno di questo articolo, viene presentato un approccio semplificato per intraprendere la ricerca aperta e le successive ricerche di glicopeptidi focalizzate sul glicano per campioni batterici utilizzando Acinetobacter baumannii come modello.

Abstract

La glicosilazione proteica è sempre più riconosciuta come una modifica comune all'interno degli organismi batterici, contribuendo alla fisiologia procariotica e all'infettività ottimale delle specie patogene. A causa di ciò, vi è un crescente interesse per la caratterizzazione della glicosilazione batterica e la necessità di strumenti analitici ad alto rendimento per identificare questi eventi. Sebbene la proteomica bottom-up consenta prontamente la generazione di ricchi dati glicopeptidici, l'ampiezza e la diversità dei glicani osservati nelle specie procariotiche rendono estremamente difficile l'identificazione degli eventi di glicosilazione batterica.

Tradizionalmente, la determinazione manuale delle composizioni glicani all'interno di set di dati proteomici batterici ha reso questa analisi in gran parte su misura limitata agli esperti specifici del campo. Recentemente, gli approcci aperti basati sulla ricerca sono emersi come una potente alternativa per l'identificazione di modifiche sconosciute. Analizzando la frequenza delle modifiche uniche osservate sulle sequenze peptidiche, le tecniche di ricerca aperta consentono l'identificazione di glicani comuni attaccati ai peptidi all'interno di campioni complessi. Questo articolo presenta un flusso di lavoro semplificato per l'interpretazione e l'analisi dei dati glicoproteomici, dimostrando come le tecniche di ricerca aperta possono essere utilizzate per identificare i glicopeptidi batterici senza una precedente conoscenza delle composizioni glicaniche.

Utilizzando questo approccio, i glicopeptidi all'interno dei campioni possono essere rapidamente identificati per comprendere le differenze di glicosilazione. Utilizzando Acinetobacter baumannii come modello, questi approcci consentono il confronto delle composizioni glicaniche tra ceppi e l'identificazione di nuove glicoproteine. Nel complesso, questo lavoro dimostra la versatilità delle tecniche di ricerca di database aperti per l'identificazione della glicosilazione batterica, rendendo la caratterizzazione di questi glicoproteomi altamente diversi più facile che mai.

Introduzione

La glicosilazione proteica, il processo di attaccamento dei carboidrati alle molecole proteiche, è una delle modificazioni post-traduzionali (PTM) più comuni in natura 1,2. In tutti i domini della vita, si è evoluta una gamma di macchinari complessi dedicati alla generazione di glicoproteine che influenzano una miriade di funzioni cellulari 1,3,4,5. Mentre la glicosilazione proteica si verifica su una gamma di amminoacidi 6,7, gli eventi di glicosilazione legata all'N e all'O sono due forme dominanti osservate in natura. La glicosilazione legata all'N comporta l'attaccamento dei glicani a un atomo di azoto di residui di asparagina (Asn), mentre nella glicosilazione legata all'O, i glicani sono attaccati a un atomo di ossigeno di serina (Ser), treonina (Thr) o tirosina (Tyr) residui7. Nonostante le somiglianze nei residui presi di mira dai sistemi di glicosilazione, le differenze all'interno dei glicani attaccati alle proteine fanno sì che la glicosilazione sia la classe chimicamente più diversificata di PTM presenti in natura.

Mentre i sistemi di glicosilazione eucariotica possiedono la diversità dei glicani, questi sistemi sono in genere limitati nel numero di carboidrati unici utilizzati. La diversità risultante deriva da come questi carboidrati sono disposti in glicani 8,9,10,11,12. Al contrario, le specie batteriche e arcaiche possiedono una diversità glicana praticamente illimitata a causa della vasta gamma di zuccheri unici generati all'interno di questi sistemi 2,10,13,14,15,16,17. Queste differenze nella diversità glicanica osservata tra i domini della vita rappresentano una sfida analitica significativa per la caratterizzazione e l'identificazione degli eventi di glicosilazione. Per la glicosilazione eucariotica, la capacità di anticipare le composizioni glicaniche ha facilitato il crescente interesse per la glicobiologia; tuttavia, lo stesso non è vero per la glicosilazione batterica, che è ancora in gran parte limitata allo studio da parte di laboratori specializzati. Poiché l'accessibilità della strumentazione di spettrometria di massa (MS) è aumentata nelle bioscienze, gli approcci basati sulla SM sono ora il metodo principale per l'analisi glicoproteomica.

La SM è emersa come lo strumento per eccellenza per la caratterizzazione della glicosilazione, con approcci sia top-down che bottom-up ora comunemente usati per caratterizzare le glicoproteine6. Mentre la proteomica top-down viene utilizzata per valutare i modelli di glicosilazione globale di proteine specifiche18,19, vengono utilizzati approcci bottom-up per consentire la caratterizzazione glicano-specifica dei glicopeptidi, anche da miscele complesse 6,20,21,22,23. Per l'analisi dei glicopeptidi, la generazione di informazioni informative sulla frammentazione è essenziale per la caratterizzazione degli eventi di glicosilazione24,25. Una serie di approcci di frammentazione è ora abitualmente accessibile sugli strumenti, tra cui la dissociazione indotta da collisioni basata sulla trappola ionica di risonanza (IT-CID), la dissociazione indotta da collisioni di tipo fascio (CID) e la dissociazione a trasferimento di elettroni (ETD). Ogni approccio possiede diversi punti di forza e di debolezza per l'analisi dei glicopeptidi25,26, con progressi significativi nell'ultimo decennio nell'applicazione di questi approcci di frammentazione per analizzare la glicosilazione 6,20. Tuttavia, per l'analisi della glicosilazione batterica, la limitazione critica non è stata la capacità di frammentare i glicopeptidi, ma piuttosto l'incapacità di prevedere le potenziali composizioni di glicani all'interno dei campioni. All'interno di questi sistemi, la natura sconosciuta di diversi glicani batterici limita l'identificazione dei glicopeptidi, anche con strumenti di ricerca focalizzati sulla glicosilazione ormai comuni per l'analisi dei glicopeptidi eucariotici, come O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28 e GlycReSoft29. Per superare questo problema, è necessario un metodo di ricerca alternativo, con l'uso di strumenti di ricerca aperti che emergono come un potente approccio per lo studio della glicosilazione batterica30.

La ricerca aperta, nota anche come ricerca cieca o jolly, consente l'identificazione di peptidi con PTMsconosciuti o inaspettati 21,30,31,32. Le ricerche aperte utilizzano una varietà di tecniche computazionali, tra cui ricerche di modifica curate, ricerche di database in più passaggi o ricerche tolleranti ad ampia massa 33,34,35,36,37. Sebbene la ricerca aperta abbia un grande potenziale, il suo uso è stato tipicamente ostacolato dal significativo aumento dei tempi di analisi e dalla perdita di sensibilità del rilevamento di peptidi non modificati rispetto alle ricerche limitate31,32. La diminuzione del rilevamento di corrispondenze peptidico-spettrali non modificate (PSM) è il risultato dell'aumento dei tassi di PSM falsi positivi associati a queste tecniche, che richiede un maggiore filtraggio rigoroso per mantenere i tassi di falsa scoperta (FDR) desiderati)33,34,35,36,37 . Recentemente, sono stati resi disponibili diversi strumenti che migliorano significativamente l'accessibilità della ricerca aperta, tra cui Byonic 31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40 e MSFragger21,41. Questi strumenti consentono la robusta identificazione degli eventi di glicosilazione riducendo significativamente i tempi di analisi e implementando approcci per gestire composizioni glicane eterogenee.

Questo articolo presenta un metodo semplificato per l'identificazione dei glicopeptidi batterici mediante ricerca aperta, utilizzando come modello il patogeno nosocomiale Gram-negativo, Acinetobacter baumannii. A. baumannii possiede un sistema di glicosilazione legato all'O conservato responsabile della modifica di più substrati proteici, noto come sistema di glicosilazione della proteina PglL 42,43,44. Mentre proteine simili sono mirate per la glicosilazione tra ceppi, il sistema di glicosilazione PglL è altamente variabile a causa della biosintesi del glicano utilizzato per la glicosilazione proteica derivata dal locus della capsula (noto come K-locus)44,45,46. Ciò si traduce in diversi glicani (noti anche come unità K), derivati da unità K polimerizzate singole o limitate, aggiunti ai substrati proteici 30,44,46. All'interno di questo lavoro, l'uso dello strumento di ricerca aperto, MSfragger, all'interno del software FragPipe, viene utilizzato per identificare i glicani attraverso i ceppi di A. baumannii. Combinando la ricerca aperta e la cura manuale, è possibile intraprendere "ricerche focalizzate sui glicani" per migliorare ulteriormente l'identificazione dei glicopeptidi batterici. Insieme, questo approccio di identificazione in più fasi consente l'identificazione di glicopeptidi senza una vasta esperienza nella caratterizzazione di nuovi eventi di glicosilazione.

Protocollo

NOTA: La preparazione e l'analisi di campioni di glicopeptide batterico possono essere suddivise in quattro sezioni (Figura 1). Per questo studio, è stata valutata la glicosilazione di tre ceppi di A. baumannii sequenziati (Tabella 1). I database Proteome FASTA di ciascuno di questi ceppi sono accessibili tramite Uniprot. Fare riferimento alla Tabella 2 per la composizione dei buffer utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione di campioni proteici per analisi proteomica

  1. Isolamento di campioni di proteoma di interesse
    1. Se si utilizzano cellule intere, assicurarsi che le cellule siano state lavate con una soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere potenziali contaminanti proteici presenti nel mezzo. Congelare a scatto le cellule intere dopo il lavaggio e conservarle a -80 °C fino a quando non è necessario.
    2. Se vengono utilizzati campioni frazionati (come i preparati a membrana), assicurarsi che i reagenti utilizzati non interferiscano con l'analisi della cromatografia liquida MS (LC-MS) a valle50.
    3. Se sono stati utilizzati detergenti, come il dodecil-solfato di sodio (SDS), Triton X-100, NP-40 o lauroilsarcosina, rimuovere questi detergenti utilizzando la precipitazione dell'acetone, i metodi di preparazione del campione SP351 o le colonne di pulizia proteomica commerciale come le trappole S52. In alternativa, sostituire i detergenti incompatibili con un detergente compatibile con la SM o rimovibile come il desossicolato di sodio (SDC) o l'ottil glucopiranoside.
    4. Assicurarsi che tutti gli articoli in plastica e vetro da utilizzare per la preparazione dei campioni non siano stati autoclavati. I vetri e le materie plastiche autoclavati sono in genere fortemente contaminati da composti di piccolo peso molecolare, come i polimeri, che sono facilmente rilevabili all'interno della SM.
  2. Solubilizzazione di campioni di cellule intere
    1. Riespendare ~10 mg di cellule lavate e congelate a scatto in 200 μL di tampone di lisi del desossicolato di sodio appena preparato (tampone di lisi SDC: 4% SDC in 100 mM Tris, pH 8,5).
      NOTA: gli inibitori della proteasi possono essere aggiunti al tampone di lisi SDC per limitare la degradazione delle proteine.
    2. Far bollire i campioni per 10 minuti a 95 °C con agitazione (2000 giri/min su un bimbyxer), quindi lasciare sul ghiaccio per 10 minuti. Ripetere questo processo due volte per garantire una lisi e una solubilizzazione efficienti dei campioni.
      NOTA: i campioni possono essere conservati a lungo termine a questo punto a -80 °C. Se conservato, risolubilizzare riscaldando a 95 °C prima di un'ulteriore lavorazione.
  3. Quantificare le concentrazioni proteiche del campione utilizzando un saggio proteico dell'acido bicinchoninico (BCA)53. Conservare i campioni sul ghiaccio mentre si esegue la quantificazione per limitare la degradazione delle proteine.
    NOTA: per l'analisi del proteoma totale, 20-100 μg di proteine sono più che sufficienti per nano LC-MS, che in genere richiede meno di 2 μg di digest proteico per analisi. La preparazione del peptide in eccesso consente l'analisi replicata o un ulteriore frazionamento se è richiesta una copertura proteomica profonda. Per l'analisi basata sull'arricchimento dei glicopeptidi mediante cromatografia di interazione idrofila (HILIC), sono necessari 100-500 μg di proteine.
  4. Ridurre e alchilare i campioni.
    1. Aggiungere 1/10 del volume del tampone di riduzione/alchilazione 10x (100 mM Tris 2-carbossietilfosfina cloridrato; 400 mM 2-cloroacetammide in 1 M Tris, pH 8,5) ai campioni per una concentrazione finale di 1x e incubare i campioni al buio per 30 min a 45 °C con agitazione a 1.500 giri/min.
      NOTA: Controllare il pH del tampone di riduzione/alchilazione 10x per assicurarsi un pH di circa 7,0-8,0 prima di aggiungerlo ai campioni, poiché un pH più basso causerà la precipitazione della DSC.
  5. Abbassare brevemente i campioni e aggiungere le proteasi Tripsina/Lys-C (~10 μL, risospese in 100 mM Tris, pH 8,5) per un rapporto proteasi finale:proteine di 1:100. Incubare i digest durante la notte a 37 °C con agitazione a 1.500 giri/min (fino a 18 ore). Per garantire la completa digestione delle proteine, utilizzare un rapporto proteasi/proteina di Tripsina/Lys-C compreso tra 1:50 e 1:200.
  6. Quench digerisce aggiungendo 1,25 volumi di isopropanolo al 100% ai campioni. Ruotare i campioni per 1 minuto per mescolarli e farli girare brevemente verso il basso.
    NOTA: i campioni possono essere conservati a -20 °C per essere ulteriormente elaborati in seguito.
  7. Acidificare i campioni aggiungendo 0,115 volumi di acido trifluoroacetico al 10% (TFA; concentrazione finale di ~ 1% TFA), ruotare i campioni e ruotarli brevemente verso il basso.

2. Elaborazione di campioni di proteoma

  1. Pulizia peptidica di campioni di proteoma
    1. Preparare una punta di estrazione stop-and-go (Stage) stirrenedivinylbenzene-reverse-phase sulfonate (SDB-RPS) per ciascun campione come descritto in precedenza54.
      1. Empiricamente, per legare 50 μg di peptide, asportare tre dischi SDB-RPS da una membrana SDB-RPS da 47 mm2 utilizzando un ago smussato (14 G). Per quantità maggiori di peptidi, aumentare il numero di dischi di conseguenza.
    2. Prima di utilizzare SDB-RPS Stage Tips, preparare le punte aggiungendo in sequenza almeno dieci volumi di letto dei seguenti buffer e facendo ruotare il buffer attraverso la colonna mediante centrifugazione (25 °C, 3 min, 500 × g) o spingendo il buffer attraverso la colonna applicando delicatamente pressione utilizzando una siringa.
      1. Bagnare le punte con 150 μL di acetonitrile al 100%.
      2. Lavare le punte con 150 μL di metanolo al 30%, TFA all'1% in 18,2 MΩ H2O.
      3. Equilibrare le punte con 150 μL di isopropanolo al 90%, TFA all'1% bilanciato con 18,2 MΩ H2O.
    3. Caricare i campioni (contenenti il 50% di isopropanolo, l'1% di TFA) sulle punte dello stadio SDB-RPS mediante centrifugazione (25 °C, 3 min, 500 × g) o applicando delicatamente la pressione utilizzando una siringa.
    4. Lavare le punte dello stadio SDB-RPS con i seguenti tamponi mediante centrifugazione (25 °C, 3 min, 500 × g) o applicando delicatamente pressione utilizzando una siringa.
      NOTA: ulteriori lavaggi o tamponi alternativi possono essere utilizzati per rimuovere contaminanti non peptidici, come l'uso di acetato di etile invece di isopropanolo55.
      1. Lavare le punte con 150 μL di isopropanolo al 90%, TFA all'1%.
      2. Lavare le punte con 150 μL di TFA all'1% in 18,2 MΩ H2O.
    5. Eluire i peptidi dalle punte dello stadio SDB-RPS con 150 μL di idrossido di ammonio al 5% in acetonitrile all'80% mediante centrifugazione o applicando delicatamente la pressione utilizzando una siringa. Raccogliere i campioni in singoli tubi.
      NOTA: Preparare il 5% di idrossido di ammonio in acetonitrile all'80% in un contenitore di plastica immediatamente prima dell'uso all'interno di una cappa aspirante.
    6. Asciugare i peptidi eluiti mediante centrifugazione sotto vuoto a 25 °C.
      NOTA: Se si intraprende l'arricchimento HILIC, l'1-10% degli eluati peptidici può essere rimosso a questo punto, essiccato e utilizzato come controlli di ingresso del proteoma totale.
  2. Arricchimento di campioni di glicopeptide
    1. Preparare zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography (ZIC-HILIC) Stage Tips come precedentemente descritto 54,56.
      1. In breve, asportare un disco C8 da una membrana 47 mm2 C8 usando un ago smussato (14 G) e imballare il disco in una punta P200 per creare una fritta. Aggiungere circa 5 mm di materiale ZIC-HILIC, risospeso in acetonitrile al 50%, 50% 18,2 MΩ H2O, sulla fritta applicando delicatamente la pressione utilizzando una siringa.
    2. Prima di utilizzare ZIC-HILIC Stage Tips, condizionare la resina aggiungendo in sequenza i seguenti tamponi e applicando delicatamente la pressione utilizzando una siringa.
      NOTA: Per garantire l'integrità dello strato di pseudo-acqua sulla superficie della resina ZIC-HILIC (necessaria per arricchire i glicopeptidi), la resina deve rimanere sempre bagnata. Quando si lava la resina, lasciare sempre ~ 10 μL di solvente sopra la resina e assicurarsi che i lavaggi / campioni siano pipettati direttamente in questo solvente residuo.
      1. Equilibrare la resina con 20 volumi di letto (200 μL) di tampone di eluizione ZIC-HILIC (0,1% TFA in 18,2 MΩ H2O).
      2. Lavare la resina con 20 volumi di letto (200 μL) di tampone di preparazione ZIC-HILIC (acetonitrile al 95% in 18,2 MΩ H2O).
      3. Lavare la resina con 20 volumi letto (200 μL) di tampone di carico/lavaggio ZIC-HILIC (80% acetonitrile, 1% TFA bilanciato con 18,2 MΩ H2O).
    3. Sospendere i campioni essiccati digeriti (dal punto 2.1.6) nel tampone di carico/lavaggio ZIC-HILIC fino a una concentrazione finale di 4 μg/μL (ad esempio, per 200 μg di peptide, risospendere in 50 μL di tampone di carico/lavaggio ZIC-HILIC). Vortice brevemente per 1 minuto per garantire che i campioni siano risospesi e rotazione per 1 minuto a 2.000 × g a 25 °C.
    4. Caricare il campione di peptide risospeso su una colonna ZIC-HILIC condizionata.
      1. Lavare tre volte con 20 volumi di letto (200 μL) di tampone di carico/lavaggio ZIC-HILIC (per 60 lavaggi totali di volume del letto) applicando delicatamente la pressione utilizzando una siringa.
      2. Glicopeptidi eluiti con 20 volumi di letto (200 μL) di tampone di eluizione ZIC-HILIC in un tubo da 1,5 mL applicando delicatamente la pressione usando una siringa e quindi asciugare l'eluato mediante centrifugazione sotto vuoto a 25 °C.

3. LC-MS di campioni arricchiti con proteoma/glicopeptide

  1. Sospendere i campioni nel tampone A* (2% acetonitrile, 0,1% TFA) ad una concentrazione finale di 1 μg/μL (ad esempio, per 50 μg di peptide, risospendare in 50 μL di tampone A*).
  2. Caricare i campioni su un HPLC/UPLC accoppiato a un MS per consentire la separazione e l'identificazione dei glicopeptidi.
    NOTA: i parametri della colonna, tra cui diametro interno, lunghezza, portate, tipo di resina per cromatografia e quantità di iniezione peptidica richieste, devono essere ottimizzati per la configurazione analitica e la lunghezza del gradiente da utilizzare; per un esempio di come intraprendere l'ottimizzazione delle configurazioni analitiche, vedere57.
  3. Monitorare la raccolta dei dati MS risultanti assicurandosi che i dati vengano raccolti con i parametri desiderati.
    NOTA: per l'analisi composizionale, è sufficiente la frammentazione del CID. A causa dell'aggiunta di glicani ai glicopeptidi, gli ioni glicopeptide sono tipicamente osservati con un m / z più alto e una densità di carica inferiore rispetto ai peptidi non glicosilati. Per garantire che questi ioni siano osservabili, consentire un intervallo di massa MS1 da 400 a 2.000 m/z.
  4. Frammentare ioni selezionati utilizzando CID, garantendo la raccolta di ioni frammento m/z bassi che contengono ioni ossonio importanti per la caratterizzazione dei glicani.
    NOTA: La frammentazione dei glicopeptidi utilizzando CID è influenzata sia dalle sequenze peptidiche e glicaniche, sia dall'energia applicata durante la frammentazione 25,58,59. Mentre è possibile utilizzare una gamma di diverse energie di collisione, una strategia ottimale per la frammentazione dei glicopeptidi è l'uso di energie di collisione a gradini che combinano l'uso di più energie di collisione 25,59,60.
  5. Utilizzare metodi di frammentazione alternativi, se disponibili, come ETD per la localizzazione del sito o IT-CID per aiutare nella determinazione delle composizioni glicaniche.
    NOTA: Nessuno di questi approcci di frammentazione è essenziale per l'analisi composizionale, ma può essere raccolto per consentire un'ulteriore interrogazione dei glicopeptidi di interesse.

4. Analisi di campioni arricchiti con proteoma/glicopeptide

  1. Prefiltro dei file di dati per consentire la ricerca in FragPipe
    1. Se le scansioni ETD o IT-CID sono state acquisite all'interno di set di dati, filtrare questi eventi di scansione dai file di dati utilizzando MSConvert61 prima di eseguire la ricerca con FragPipe.
      NOTA: per i parametri di ricerca aperti descritti di seguito, sono necessari solo i dati CID di tipo beam.
  2. Esecuzione di ricerche aperte in FragPipe
    1. Aprire FragPipe e fare clic sulla scheda Flusso di lavoro . Nel menu a discesa del flusso di lavoro, selezionare l'opzione Apri ricerca e fare clic su Aggiungi file per importare i file di dati da cercare in FragPipe (Figura 2A).
    2. Fare clic sulla scheda Database e avviare il download manager facendo clic su Download. Ciò consente di scaricare i database dei proteomi da Uniprot utilizzando un ID Proteoma Uniprot. Fare clic sull'opzione Aggiungi esche e contaminanti all'interno del download manager per incorporare proteine esca e contaminanti nei database.
    3. Per soglie FDR più rigorose, fare clic sulla scheda Convalida e modificare il valore Filtro e report da 0,01 a FDR richiesto.
      NOTA: le impostazioni predefinite di FragPipe garantiranno un FDR dell'1% a livello proteico.
    4. Fare clic sulla scheda MSfragger . All'interno della casella di corrispondenza Picco , aumentare la tolleranza di massa del precursore dal valore predefinito 500 Da a 2.000 Da per consentire l'identificazione di modifiche di grandi dimensioni (Figura 2A).
    5. Fare clic sulla scheda Esegui e definire la posizione degli output di FragPipe. Fare clic sul pulsante Esegui per iniziare la ricerca.
  3. Utilizzando i PSM identificati tra i set di dati (contenuti negli output psm.tsv di FragPipe), identificare i potenziali glicani tracciando la frequenza delle masse delta osservate all'interno dei set di dati (Figura 3). Crea grafici di massa delta da output MSfragger utilizzando gli script R accessibili tramite l'adesione PRIDE PXD027820.
    NOTA: la post-elaborazione minima dei risultati della ricerca aperta viene effettuata all'interno di questi script, poiché lo scopo principale di questi script è quello di aiutare nella visualizzazione dei profili di massa delta. È importante sottolineare che l'osservazione di masse delta abbondanti da sola non è la prova che una modifica sia un potenziale glicano, poiché l'assegnazione di masse delta come glicani richiede un'ulteriore analisi dei corrispondenti eventi MS2.
  4. Per consentire la caratterizzazione dei glicopeptidi all'interno dei campioni, concentrarsi sulle identificazioni di massa delta ad alta confidenza, corrispondenti a assegnazioni con iperpunti elevati.
    1. Per aiutare a valutare gli spettri di glicopeptide, utilizzare strumenti di annotazione peptidica, come l'Interactive Peptide Spectral Annotator63, che consente l'assegnazione di ioni associati ai peptidi all'interno degli spettri, consentendo l'identificazione manuale degli ioni glicani associati (Figura 4).
      NOTA: All'interno dei set di dati qui presentati, gli iperpunteggi di >30 sono considerati punteggi elevati, in quanto corrispondono a punteggi all'interno del 50% superiore di tutti i glicopeptidi identificati (Figura 5).
  5. Con i glicopeptidi ad alta confidenza assegnati, identificare gli ioni comunemente osservati associati ai glicani (Figura 4) per migliorare l'identificazione dei glicopeptidi.
    NOTA: Incorporando ioni associati al glicano all'interno delle ricerche, note come ricerche focalizzate sul glicano, è possibile migliorare la qualità delle assegnazioni di glicopeptidi.
    1. Fate clic sulla scheda MSfragger di FragPipe, incorporate le masse delta determinate dei glicani osservati nelle sezioni Modifiche variabili e Offset di massa . Aggiungete queste masse digitando i valori nelle sezioni Modifiche variabili e Offset di massa con singole masse separate da /. Aggiungere le masse di frammenti associati al glicano di questi glicani nella sezione Glyco/Labile mods di MSFragger.
      NOTA: La Figura 2B delinea le informazioni chiave necessarie per una ricerca focalizzata sul glicano del ceppo AB307-0294 di A. baumannii .
  6. Carica tutti i dati MS associati agli studi proteomici su repository proteomici centralizzati come i repository PRIDE o MASSIVE.
    NOTA: Tutti i dati associati a questo studio sono stati depositati nel repository proteomico PRIDE e sono accessibili tramite l'adesione PRIDE: PXD027820.

Risultati

Per illustrare l'utilità della ricerca aperta per l'analisi dei glicopeptidi batterici, è stata valutata la diversità chimica dei glicani legati all'O all'interno di tre ceppi di A. baumannii-AB307-0294, ACICU e D1279779-. I glicoproteomi legati all'O sono altamente variabili tra i ceppi di A. baumannii poiché i glicani utilizzati per la glicosilazione derivano dai loci della capsula altamente variabili 44,45,46....

Discussione

La ricerca aperta è un metodo efficace e sistematico per l'identificazione di modifiche sconosciute. Mentre l'identificazione di glicani sconosciuti all'interno di campioni di proteoma batterico è stata tradizionalmente un'impresa dispendiosa in termini di tempo e tecnicamente specializzata, i recenti sviluppi di strumenti come MSfragger21,41 e Byonic 31,38 ora consentono l'identificazione rapida ed eff...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Riconoscimenti

N.E.S è supportato da una Future Fellowship dell'Australian Research Council (FT200100270) e da una ARC Discovery Project Grant (DP210100362). Ringraziamo la Melbourne Mass Spectrometry and Proteomics Facility del Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute per l'accesso alla strumentazione MS.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
14 G Kel-F Hub point style 3Hamilton companyhanc90514
2-ChloroacetamideSigma Aldrich Pty LtdC0267-100G
AcetonitrileSigma Aldrich Pty Ltd34851-4L
Ammonium hydroxide (28%)Sigma Aldrich Pty Ltd338818-100ML
BCA Protein Assay Reagent APierce23228
BCA Protein Assay Reagent BPierce23224
C8 Empore SPESigma Aldrich Pty Ltd66882-UAn alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Formic acidSigma Aldrich Pty Ltd5.33002
IsopropanolSigma Aldrich Pty Ltd650447-2.5L
MethanolFisher ChemicalM/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate)Sigma Aldrich Pty Ltd66886-UAn alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium DeoxycholateSigma Aldrich Pty LtdD6750-100G
ThermoMixer CEppendorf2232000083
trifluoroacetic acidSigma Aldrich Pty Ltd302031-10X1ML
Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochlorideSigma Aldrich Pty LtdC4706-2G
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma Aldrich Pty Ltd252859-500G
Trypsin/Lys-C protease mixturePromegaV5073
Vacuum concentratorLabconco7810040
ZIC-HILIC materialMerck1504580001Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin

Riferimenti

  1. Varki, A., et al. . Essentials of glycobiology. , (2015).
  2. Schaffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Reviews. 41 (1), 49-91 (2017).
  3. Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N. Not just for Eukarya anymore: Protein glycosylation in bacteria and archaea. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 544-550 (2008).
  4. Szymanski, C. M., Yao, R., Ewing, C. P., Trust, T. J., Guerry, P. Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Molecular Microbiology. 32 (5), 1022-1030 (1999).
  5. Koomey, M. O-linked protein glycosylation in bacteria: snapshots and current perspectives. Current Opinion in Structural Biology. 56, 198-203 (2019).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100029 (2020).
  7. Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).
  8. Hu, H., Khatri, K., Klein, J., Leymarie, N., Zaia, J. A review of methods for interpretation of glycopeptide tandem mass spectral data. Glycoconjugate Journal. 33 (3), 285-296 (2016).
  9. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: Diversity, synthesis and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 448-462 (2012).
  10. Bohm, M., et al. Glycosciences.DB: An annotated data collection linking glycomics and proteomics data (2018 update). Nucleic Acids Research. 47, 1195-1201 (2019).
  11. Kawano, S., Hashimoto, K., Miyama, T., Goto, S., Kanehisa, M. Prediction of glycan structures from gene expression data based on glycosyltransferase reactions. Bioinformatics. 21 (21), 3976-3982 (2005).
  12. McDonald, A. G., Tipton, K. F., Davey, G. P. A knowledge-based system for display and prediction of O-glycosylation network behaviour in response to enzyme knockouts. PLOS Computational Biology. 12 (4), 1004844 (2016).
  13. Eichler, J., Koomey, M. Sweet new roles for protein glycosylation in prokaryotes. Trends in Microbiology. 25 (8), 662-672 (2017).
  14. Scott, N. E., et al. Simultaneous glycan-peptide characterization using hydrophilic interaction chromatography and parallel fragmentation by CID, higher energy collisional dissociation, and electron transfer dissociation MS applied to the N-linked glycoproteome of Campylobacter jejuni. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 10 (2), (2011).
  15. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii strain 307-0294 is a major virulence factor. Infection and Immunity. 78 (9), 3993-4000 (2010).
  16. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Reviews Microbiology. 3 (3), 225-237 (2005).
  17. Imperiali, B. Bacterial carbohydrate diversity - a brave new world. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 1-8 (2019).
  18. Caval, T., Buettner, A., Haberger, M., Reusch, D., Heck, A. J. R. Discrepancies between high-resolution native and glycopeptide-centric mass spectrometric approaches: A case study into the glycosylation of erythropoietin variants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2099-2104 (2021).
  19. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100010 (2020).
  20. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: growing up fast. Current Opinion in Structural Biology. 68, 18-25 (2020).
  21. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  22. Cao, W., et al. Recent advances in software tools for more generic and precise intact glycopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. , (2021).
  23. Yu, A., et al. Advances in mass spectrometry-based glycoproteomics. Electrophoresis. 39 (24), 3104-3122 (2018).
  24. Reiding, K. R., Bondt, A., Franc, V., Heck, A. J. R. The benefits of hybrid fragmentation methods for glycoproteomics. Trends in Analytical Chemistry. 108, 260-268 (2018).
  25. Riley, N. M., Malaker, S. A., Driessen, M., Bertozzi, C. R. Optimal dissociation methods differ for N- and O-glycopeptides. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3286-3301 (2020).
  26. Mao, Y., et al. Systematic evaluation of fragmentation methods for unlabeled and isobaric mass tag-labeled O-glycopeptides. Analytical Chemistry. 93 (32), 11167-11175 (2021).
  27. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  28. Choo, M. S., Wan, C., Rudd, P. M., Nguyen-Khuong, T. GlycopeptideGraphMS: Improved glycopeptide detection and identification by exploiting graph theoretical patterns in mass and retention time. Analytical Chemistry. 91 (11), 7236-7244 (2019).
  29. Maxwell, E., et al. GlycReSoft: a software package for automated recognition of glycans from LC/MS data. PLoS One. 7 (9), 45474 (2012).
  30. Ahmad Izaham, A. R., Scott, N. E. Open database searching enables the identification and comparison of bacterial glycoproteomes without defining glycan compositions prior to searching. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 19 (9), 1561-1574 (2020).
  31. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: Advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , (2012).
  32. Na, S., Bandeira, N., Paek, E. Fast multi-blind modification search through tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 11 (4), 010199 (2012).
  33. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Error tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data. Proteomics. 2 (10), 1426-1434 (2002).
  34. Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: Matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
  35. Ahrné, E., Nikitin, F., Lisacek, F., Müller, M. QuickMod: A tool for open modification spectrum library searches. Journal of Proteome Research. 10 (7), 2913-2921 (2011).
  36. Shortreed, M. R., et al. Global identification of protein post-translational modifications in a single-pass database search. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4714-4720 (2015).
  37. Chick, J. M., et al. A mass-tolerant database search identifies a large proportion of unassigned spectra in shotgun proteomics as modified peptides. Nature Biotechnology. 33 (7), 743-749 (2015).
  38. Roushan, A., et al. Peak filtering, peak annotation, and wildcard search for glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100011 (2020).
  39. Chi, H., et al. Comprehensive identification of peptides in tandem mass spectra using an efficient open search engine. Nature Biotechnology. , (2018).
  40. Bittremieux, W., Laukens, K., Noble, W. S. Extremely fast and accurate open modification spectral library searching of high-resolution mass spectra using feature hashing and graphics processing units. Journal of Proteome Research. 18 (10), 3792-3799 (2019).
  41. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nature Methods. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  42. Harding, C. M., et al. Acinetobacter strains carry two functional oligosaccharyltransferases, one devoted exclusively to type IV pilin, and the other one dedicated to O-glycosylation of multiple proteins. Molecular Microbiology. 96 (5), 1023-1041 (2015).
  43. Iwashkiw, J. A., et al. Identification of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter baumannii and its role in virulence and biofilm formation. PLoS Pathogens. 8 (6), 1002758 (2012).
  44. Scott, N. E., et al. Diversity within the O-linked protein glycosylation systems of Acinetobacter species. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2354-2370 (2014).
  45. Kenyon, J. J., Hall, R. M. Variation in the complex carbohydrate biosynthesis loci of Acinetobacter baumannii genomes. PLoS One. 8 (4), 62160 (2013).
  46. Lees-Miller, R. G., et al. A common pathway for O-linked protein-glycosylation and synthesis of capsule in Acinetobacter baumannii. Molecular Microbiology. 89 (5), 816-830 (2013).
  47. Iacono, M., et al. Whole-genome pyrosequencing of an epidemic multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strain belonging to the European clone II group. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (7), 2616-2625 (2008).
  48. Hamidian, M., et al. Insights from the revised complete genome sequences of Acinetobacter baumannii strains AB307-0294 and ACICU belonging to global clones 1 and 2. Microbial Genomics. 5 (10), 000298 (2019).
  49. Farrugia, D. N., et al. The complete genome and phenome of a community-acquired Acinetobacter baumannii. PLoS One. 8 (3), 58628 (2013).
  50. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  51. Batth, T. S., et al. Protein aggregation capture on microparticles enables multipurpose proteomics sample preparation. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (5), 1027-1035 (2019).
  52. HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
  53. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  54. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  55. Harney, D. J., et al. Proteomic analysis of human plasma during intermittent fasting. Journal of Proteome Research. 18 (5), 2228-2240 (2019).
  56. Scott, N. E. Characterizing glycoproteins by mass spectrometry in Campylobacter jejuni. Methods in Molecular Biology. 1512, 211-232 (2017).
  57. Bian, Y., et al. Robust microflow LC-MS/MS for proteome analysis: 38000 runs and counting. Analytical Chemistry. 93 (8), 3686-3690 (2021).
  58. Diedrich, J. K., Pinto, A. F., Yates, J. R. Energy dependence of HCD on peptide fragmentation: stepped collisional energy finds the sweet spot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1690-1699 (2013).
  59. Liu, M. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
  60. Hinneburg, H., et al. The art of destruction: Optimizing collision energies in quadrupole-time of flight (Q-TOF) instruments for glycopeptide-based glycoproteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 507-519 (2016).
  61. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  62. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2020).
  63. Brademan, D. R., Riley, N. M., Kwiecien, N. W., Coon, J. J. Interactive peptide spectral annotator: A versatile web-based tool for proteomic applications. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18, 193-201 (2019).
  64. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide from Acinetobacter baumannii is a potential therapeutic target via passive immunization. Infection and Immunity. 81 (3), 915-922 (2013).
  65. Senchenkova, S. N., et al. Structure of the capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii ACICU containing di-N-acetylpseudaminic acid. Carbohydrate Research. 391, 89-92 (2014).
  66. Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 5 (4), 397-409 (1988).
  67. Harvey, D. J., Dwek, R. A., Rudd, P. M. Determining the structure of glycan moieties by mass spectrometry. Current Protocols in Protein Science. , (2006).
  68. Medzihradszky, K. F., Kaasik, K., Chalkley, R. J. Characterizing sialic acid variants at the glycopeptide level. Analytical Chemistry. 87 (5), 3064-3071 (2015).
  69. Kelstrup, C. D., Frese, C., Heck, A. J., Olsen, J. V., Nielsen, M. L. Analytical utility of mass spectral binning in proteomic experiments by SPectral Immonium Ion Detection (SPIID). Molecular & Cellular Proteomics:MCP. 13 (8), 1914-1924 (2014).
  70. Ahmad Izaham, A. R., et al. What are we missing by using hydrophilic enrichment? Improving bacterial glycoproteome coverage using total proteome and FAIMS analyses. Journal of Proteome Research. 20 (1), 599-612 (2021).
  71. Neue, K., Mormann, M., Peter-Katalinic, J., Pohlentz, G. Elucidation of glycoprotein structures by unspecific proteolysis and direct nanoESI mass spectrometric analysis of ZIC-HILIC-enriched glycopeptides. Journal of Proteome Research. 10 (5), 2248-2260 (2011).
  72. Mysling, S., Palmisano, G., Hojrup, P., Thaysen-Andersen, M. Utilizing ion-pairing hydrophilic interaction chromatography solid phase extraction for efficient glycopeptide enrichment in glycoproteomics. Analytical Chemistry. 82 (13), 5598-5609 (2010).
  73. Escobar, E. E., et al. Precision mapping of O-Linked N-acetylglucosamine sites in proteins using ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 142 (26), 11569-11577 (2020).
  74. Madsen, J. A., et al. Concurrent automated sequencing of the glycan and peptide portions of O-linked glycopeptide anions by ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (19), 9253-9261 (2013).
  75. Lysiak, A., Fertin, G., Jean, G., Tessier, D. Evaluation of open search methods based on theoretical mass spectra comparison. BMC Bioinformatics. 22, 65 (2021).
  76. Pabst, M., et al. A general approach to explore prokaryotic protein glycosylation reveals the unique surface layer modulation of an anammox bacterium. ISME Journal. , (2021).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

BiochimicaNumero 177GlicosilazioneAcinetobacter baumanniiRicerca apertaModificazioni posttraducizionaliProteomica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati