Nachweis der postreplizierenden Lückenakkumulation und -reparatur in menschlichen Zellen mit dem DNA-Faser-Assay

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir zwei Modifikationen des DNA-Faserassays zur Untersuchung einzelsträngiger DNA-Lücken bei der Replikation von DNA nach Läsionsinduktion. Der S1-Faserassay ermöglicht die Detektion von postreplizierenden Lücken mit der ssDNA-spezifischen S1-Endonuklease, während der lückenfüllende Assay die Visualisierung und Quantifizierung der Spaltreparatur ermöglicht.

Zusammenfassung

Der DNA-Faser-Assay ist eine einfache und robuste Methode zur Analyse der Replikationsgabeldynamik, basierend auf dem Immunnachweis von Nukleotidanaloga, die während der DNA-Synthese in menschliche Zellen eingebaut werden. Diese Technik hat jedoch eine begrenzte Auflösung von einigen tausend Kilobasen. Folglich sind postreplizierte einzelsträngige DNA-Lücken (ssDNA), die so klein wie einige hundert Basen sind, mit dem Standardassay nicht nachweisbar. Hier beschreiben wir eine modifizierte Version des DNA-Faserassays, der die S1-Nuklease verwendet, ein Enzym, das speziell ssDNA spaltet. In Gegenwart von postreplizierenden ssDNA-Lücken zielt die S1-Nuklease auf die Lücken ab und spaltet sie, wodurch kürzere Traktate erzeugt werden, die als Auslesevorgang für ssDNA-Lücken auf laufenden Gabeln verwendet werden können. Diese postreplizierenden ssDNA-Lücken entstehen, wenn beschädigte DNA diskontinuierlich repliziert wird. Sie können über Mechanismen repariert werden, die von der Genomreplikation entkoppelt sind, in einem Prozess, der als lückenfüllende oder postreplizierte Reparatur bekannt ist. Da lückenfüllende Mechanismen eine DNA-Synthese unabhängig von der S-Phase beinhalten, können auch Änderungen im DNA-Fasermarkierungsschema verwendet werden, um lückenfüllende Ereignisse zu überwachen. Insgesamt sind diese Modifikationen des DNA-Faser-Assays mächtige Strategien, um zu verstehen, wie postreplizierende Lücken im Genom menschlicher Zellen gebildet und gefüllt werden.

Einleitung

Bahnbrechende Arbeiten haben Hinweise auf die Anhäufung von postreplizierenden einzelsträngigen (ssDNA) Lücken bei der Behandlung mit DNA-schädigenden Wirkstoffen in Bakterien 1 und menschlichen Zellen ^2,3 geliefert. Während der Replikation beschädigter DNA-Vorlagen kann die DNA-Synthese-Maschinerie die Läsionen umgehen, indem sie spezifische Transläsionssynthese-DNA-Polymerasen oder durch Template-Switching-Mechanismen verwendet. Alternativ kann das Replisom auch einfach die Läsion überspringen und eine ssDNA-Lücke hinterlassen, die später repariert werden soll. In jüngerer Zeit zeigte....

Protokoll

Da die Studie menschliche Zellen verwendet, wurde die Arbeit von der Ethikkommission des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften an der Universität von São Paulo (ICB-USP, Zulassungsnummer # 48347515.3.00005467) für die Forschung mit menschlichen Proben genehmigt.

HINWEIS: Die hier beschriebenen Protokolle wurden in früheren Veröffentlichungen mit geringfügigen Änderungen^14,16,28 verwendet. Hier liegt der Fokus auf der Verwendung von ultraviolettem Licht C (UVC) als DNA-schädigendes Mittel. Aber auch andere DNA-schädigende Mittel wie Cisplatin....

Ergebnisse

Wenn im S1-Faser-Assay die Behandlung mit einem genotoxischen Wirkstoff zu postreplizierenden ssDNA-Lücken führt, sind die Gesamtlängen der DNA-Fasern aus S1-behandelten Kernen bei der Behandlung mit DNA-Schäden kürzer als bei unbehandelten Proben sowie bei Proben, die mit dem genotoxischen Mittel behandelt wurden, aber keiner S1-Spaltung unterzogen wurden (Abbildung 1).

Alternativ, wenn die Behandlung mit der S1-Nuklease die Länge der DNA-Fasern im Vergleic.......

Diskussion

Kritische Schritte des Standard-DNA-Faser-Assay-Protokolls wurden in einer früheren Publikation^{diskutiert 32}. Hier beschreiben wir modifizierte Versionen des Standard-DNA-Faser-Assays, um das Vorhandensein von postreplizierenden ssDNA-Lücken sowie deren Reparatur durch Lückenfüllung zu untersuchen, die ursprünglich in¹⁴ beschrieben wurden. Im Zusammenhang mit der postreplizierenden Präsenz von ssDNA-Lücken wäre die Verwendung der S1-Nuklease im S1-Faserprotokoll hö.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid, Glacial	Synth	64-19-7	Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100
Ammonium hydroxide	Synth	1336-21-6	Or similar
Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11005	-
Antibody anti-rat Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21470	-
Antibody Mouse anti-BrdU	Becton Disckson	347580	-
Antibody Rat anti-BrdU	Abcam	Ab6326	-
Biological security hood	Pachane	PA 410	Use hood present in the laboratory
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma-Aldrich	A3294	Or similar
Cell scraper	Thermo Scientific	179693	Or similar
CldU	Millipore-Sigma	C6891	-
Cloridric acid	Synth	7647-01-0	Or similar
Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9)	Zeiss	-	Or similar
Cover glass (or coverslips)	Thermo Scientific	152460	Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460
DMEM - High Glucose	LGC/Gibco	BR30211-05/12100046	Use culture media specific for the cell line used.
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)	Sigma-Aldrich	E5314	Or similar
Epifluorescence Microscope Axiovert 200	Zeiss	-	Or similar
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	12657-029	Or similar
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific 3110	13-998-074	Use cell incubator present in the laboratory
Glass slide jar	Sigma-Aldrich	S5516	Or similar
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5	Or similar
Idu	Millipore-Sigma	I7125	-
Magnesium Chloride	Synth	7791-18-6	Or similar
Methanol	Merck	67-56-1	Or similar
Microscope slides	Denville	M1021	Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1
MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico)	Synth	1132-61-2	Or similar
Nocodazole	Sigma-Aldrich	31430-18-9	-
PBS (Phosphate Buffer Saline)	Life Thechnologies	3002	Or similar
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Or similar
ProLong Gold AntiFade Mountant	Invitrogen	P36930	Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used
S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae	Invitrogen	18001-016	Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	BioRad	161-0302	Or similar
Sodium Acetate Trihydrate	Sigma-Aldrich	6131-90-4	Or similar
Sodium Chloride	Synth	7647-14-5	Or similar
Sucrose	Sigma-Aldrich	57-50-1	Or similar
Tris Base	West Lab Research	BP152-1	Or similar
Triton X-100	Synth	9002-93-1	Or similar
Trypsin	Gibco	25200072	Or similar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	Or similar
UVC Lamp	Non Specific	-	Essential: emission lenght of 254 nm
VLX-3W UV Radiometer	Vilber Loumart	-	Or similar
Zinc Acetate	Sigma-Aldrich	557-34-6	Or similar