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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui descriviamo due modifiche del test della fibra di DNA per studiare le lacune del DNA a singolo filamento nella replicazione del DNA dopo l'induzione della lesione. Il test della fibra S1 consente il rilevamento di lacune post-replicative utilizzando l'endonucleasi S1 specifica per ssDNA, mentre il test di riempimento delle lacune consente la visualizzazione e la quantificazione della riparazione del gap.

Abstract

Il test della fibra di DNA è un metodo semplice e robusto per l'analisi della dinamica della forcella di replicazione, basato sull'immunodetezione di analoghi nucleotidici che vengono incorporati durante la sintesi del DNA nelle cellule umane. Tuttavia, questa tecnica ha una risoluzione limitata di poche migliaia di kilobasi. Di conseguenza, le lacune post-replicative del DNA a singolo filamento (ssDNA) piccole come poche centinaia di basi non sono rilevabili dal test standard. Qui, descriviamo una versione modificata del test della fibra di DNA che utilizza la nucleasi S1, un enzima che scinde specificamente l'ssDNA. In presenza di gap ssDNA post-replicativi, la nucleasi S1 prenderà di mira e fenderà i gap, generando tratti più corti che possono essere utilizzati come read-out per gli ssDNA gaps sulle forche in corso. Queste lacune post-replicative di ssDNA si formano quando il DNA danneggiato viene replicato in modo discontinuo. Possono essere riparati tramite meccanismi disaccoppiati dalla replicazione del genoma, in un processo noto come gap-filling o riparazione post-replicativa. Poiché i meccanismi di riempimento delle lacune coinvolgono la sintesi del DNA indipendentemente dalla fase S, le alterazioni nello schema di etichettatura delle fibre di DNA possono anche essere impiegate per monitorare gli eventi di riempimento delle lacune. Complessivamente, queste modifiche del test delle fibre di DNA sono potenti strategie per capire come si formano e si riempiono le lacune post-replicative nel genoma delle cellule umane.

Introduzione

Lavori seminali hanno fornito prove dell'accumulo di lacune post-replicative a singolo filamento (ssDNA) durante il trattamento con agenti dannosi per il DNA nei batteri1 e nelle cellule umane 2,3. Durante la replicazione di modelli di DNA danneggiati, il meccanismo di sintesi del DNA può bypassare le lesioni impiegando specifiche DNA polimerasi di sintesi translesionale o attraverso meccanismi di commutazione del modello. In alternativa, il replisome può anche semplicemente saltare la lesione lasciando dietro di sé un gap di ssDNA, da riparare in seguito. Più recentemente, uno studio ha mostrato chiaramente che il trattamento con agenti genotossici porta a lacune di ssDNA negli eucarioti utilizzando la microscopia elettronica per visualizzare la struttura specifica degli intermedi di replicazione4. La formazione di queste regioni di lacune post-replicative è stata inizialmente proposta come un semplice risultato della modalità semi-discontinua di replicazione del DNA2. In questo caso, una lesione sul filamento in ritardo può bloccare l'allungamento di un frammento di Okazaki, ma la progressione della forcella viene naturalmente salvata dal successivo frammento di Okazaki, lasciando dietro di sé un gap di ssDNA. Tuttavia, ulteriori studi hanno dimostrato che è anche possibile la formazione di lacune sul filamento principale, come dimostrato per la prima volta nei batteri5. Negli eucarioti, PRIMPOL, una DNA polimerasi unica con attività primasi, ha dimostrato di essere in grado di riavviare la sintesi del DNA a valle di una lesione che blocca la replicazione attraverso la sua attività di rimprovero 6,7,8,9,10,11. Pertanto, l'attività primasi di PRIMPOL può spiegare la formazione di lacune post-replicative di ssDNA nel filamento principale dopo il trattamento con un agente dannoso per il DNA nelle cellule umane12. Tuttavia, il rilevamento di queste lacune e la riparazione delle lacune, fino a poco tempo fa, richiedevano approcci indiretti o dispendiosi in termini di tempo come la microscopia elettronica4 o i saggi basati su plasmidi13. L'uso della nucleasi S1 specifica per ssDNA per rilevare le lacune nelle cellule umane è stato sperimentato dai primi studi più di quarant'anni fa, utilizzando tecniche di gradiente di saccarosio 2,3. Più recentemente, il nostro gruppo ha applicato l'uso di questa nucleasi per rilevare l'ssDNA nella replicazione del DNA (lacune post-replicative) utilizzando altri metodi come la fibra di DNA e i saggi delle comete14. Questi nuovi approcci hanno spianato la strada all'attuale ondata di studi sulle lacune post-replicative. Qui, descriviamo una strategia di utilizzo della nucleasi S1 per rilevare le lacune post-replicative di ssDNA mediante il test della fibra di DNA e spieghiamo come uno schema di etichettatura differenziale nel protocollo della fibra di DNA può consentire lo studio della riparazione di queste lacune.

Il test della fibra di DNA è una tecnica potente che è stata utilizzata da un numero crescente di laboratori e ha fornito preziose informazioni sulle dinamiche della forcella di replicazione e sui meccanismi di risposta allo stress di replicazione. In breve, questa tecnica si basa sull'incorporazione sequenziale di analoghi nucleotidici (come CldU -5-cloro-2'-deossiuridina-, e IdU -5-iodo-2'-deossiuridina) nel DNA replicante. Dopo la raccolta, le cellule vengono lisate e le molecole di DNA si diffondono su un vetrino rivestito positivamente. CldU e IdU vengono quindi rilevati da anticorpi specifici, che possono essere visualizzati in un microscopio fluorescente come fibre bicolori. Infine, le lunghezze dei tratti IdU e CldU vengono misurate per identificare eventuali alterazioni delle dinamiche di replicazione del DNA come conseguenza dell'induzione del danno al DNA. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare diversi fenomeni, come lo stallo della forcella, il rallentamento della forcella, la degradazione del DNA nascente e le variazioni nella frequenza di sparo di origine15,16.

Una limitazione del test della fibra di DNA è la sua risoluzione di poche kilobasi. Poiché le lacune post-replicative di ssDNA possono essere nell'intervallo di centinaia di basi, è impossibile visualizzare queste lacune direttamente dal protocollo standard della fibra di DNA. La presenza di lacune di ssDNA sulla replicazione del DNA in cellule umane trattate con agenti genotossici è stata indirettamente implicata in precedenza. Ad esempio, l'osservazione di ssDNA valutata mediante reclutamento della proteina legante ssDNA, della proteina di replicazione A (RPA), in cellule al di fuori della fase S, o la formazione di ssDNA rilevata dallo svolgimento del DNA alcalino combinata con l'assenza di stallo prolungato della forcella mediante test della fibra di DNA 12,17,18,19,20,21 è stato attribuito all'accumulo di lacune ssDNA. Inoltre, le lacune post-replicative di ssDNA inducono un checkpoint di fase G2/M dipendente dall'ATR e arrestano le cellule trattate con veleni replicanti 18,19,20,21,22.

La nucleasi S1 degrada gli acidi nucleici a singolo filamento rilasciando 5'-fosforile mono- o oligonucleotidi e ha un'affinità 5 volte superiore all'ssDNA rispetto all'RNA. Gli acidi nucleici a doppio filamento (DNA:DNA, DNA:RNA o RNA:RNA) sono resistenti alla nucleasi S1 tranne se usati in concentrazioni estremamente elevate. La nucleasi S1 fende anche il DNA a doppio filamento nella regione a singolo filamento causato da un nick, gap, mismatch o loop. La nucleasi S1 è quindi un'endonucleasi specifica per ssDNA in grado di scindere le lacune ssDNA, generando infine rotture a doppio filamento23,24. Pertanto, l'aggiunta di passaggi per la digestione della nucleasi S1 al protocollo della fibra di DNA consente indirettamente il rilevamento di lacune post-replicative di ssDNA. In presenza di lacune, il trattamento dei nuclei esposti con la nucleasi S1 prima della diffusione del DNA genererà tratti più corti come conseguenza della scissione S1 di ssDNA intrinsecamente presente nelle lacune14. Di conseguenza, l'accorciamento del tratto è la lettura per le lacune ssDNA utilizzando questo approccio. Rispetto al protocollo standard della fibra di DNA, la fibra di DNA con la nucleasi S1 richiede solo due passaggi aggiuntivi: l'esposizione ai nuclei (permeabilizzazione cellulare) e il trattamento con la nucleasi S1. È importante notare che sono obbligatori controlli appropriati, come i campioni trattati con l'agente genotossico ma senza la nucleasi S1 e i campioni trattati con la nucleasi S1 senza l'agente genotossico. Il protocollo stesso, compresa l'incorporazione di analoghi, il trattamento S1 e la diffusione, può essere eseguito in un giorno e non richiede materiale eccezionale. Richiede solo gli analoghi della timidina, la nucleasi S1 purificata, gli anticorpi primari e secondari appropriati e un microscopio fluorescente. Nel complesso, la fibra di DNA che impiega la nucleasi S1 rileva le lacune di ssDNA sulle forche di replicazione in corso utilizzando un approccio relativamente semplice.

Le lacune post-replicative di ssDNA formate come conseguenza dei meccanismi di risposta allo stress di replicazione possono essere riparate (o riempite) da diversi meccanismi, tra cui la sintesi del DNA translesionale o la commutazione del modello, in un processo chiamato gap-filling o post-replication repair (PRR)25. Questi processi avvengono dietro le forche che avanzano, coinvolgendo la sintesi del DNA indipendente dalla replicazione 14,26,27. Sulla base di questi risultati, è possibile eseguire uno schema di etichettatura distinto dal test standard della fibra di DNA per visualizzare gli eventi di riempimento delle lacune nella fase G2 direttamente 14,16,26,28. In particolare, un analogo della timidina può essere utilizzato per etichettare la forcella di replicazione al momento del trattamento genotossico e della formazione post-replicativa del gap ssDNA, mentre un altro analogo della timidina può essere utilizzato per etichettare gli eventi di riempimento del gap. In questo protocollo, le cellule vengono etichettate con un primo analogo della timidina (IdU, ad esempio) immediatamente dopo o in concomitanza con un trattamento genotossico per 1 ora, in modo che il DNA nascente sia etichettato al momento della formazione del gap. Nocodazolo viene aggiunto durante il trattamento per un periodo compreso tra 12-24 ore per arrestare le cellule in G2 / M, prevenendo la successiva fase S. Per le ultime 4 ore di trattamento con nocodazolo, un secondo analogo della timidina (CldU, ad esempio) viene aggiunto al mezzo da incorporare durante il riempimento del gap. È importante sottolineare che questo test può essere utilizzato solo per rilevare eventi di riempimento del gap in G2 perché il segnale di riempimento del gap da CldU non può essere distinto da un segnale a causa dell'incorporazione di CldU nel DNA replicante nella fase S. Pertanto, per ridurre al minimo il segnale di fondo, i tempi di incorporazione di CldU dopo l'induzione del danno dovrebbero coincidere con quando la maggior parte della popolazione cellulare sta entrando nella fase G214. Pertanto, questa tempistica varierà a seconda della linea cellulare e delle condizioni di trattamento. Si consiglia di ottimizzare la progressione del ciclo cellulare prima di utilizzare questo test. La co-colorazione di questi analoghi della timidina consente la visualizzazione di tratti di riempimento del gap (PRR) (cerotti CldU) sopra il DNA nascente (tratti IdU) sintetizzato durante il trattamento genotossico quando sono stati generati spazi vuoti di ssDNA.

Protocollo

Poiché lo studio utilizza cellule umane, il lavoro è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo (ICB-USP, numero di approvazione #48347515.3.00005467) per la ricerca con campioni umani.

NOTA: I protocolli qui descritti sono stati utilizzati in precedenti pubblicazioni con piccole modifiche 14,16,28. Qui l'attenzione si concentra sull'uso della luce ultravioletta C (UVC) come agente dannoso per il DNA. Tuttavia, anche altri agenti dannosi per il DNA come il cisplatino e l'idrossiurea sono stati impiegati con successo28. Questo protocollo può essere eseguito in una serie di linee cellulari, tra cui U2OS, HEK293T, fibroblasti umani e altri 14,28,29. È essenziale determinare la domanda sperimentale prima di eseguire questo protocollo. Il test della fibra di DNA con la nucleasi S1 (chiamata S1 Fiber di seguito) viene utilizzato per rilevare la presenza di lacune ssDNA post-replicative, mentre il test di riempimento del gap (o PRR) viene eseguito per quantificare gli eventi di riempimento del gap nella fase G2. Pertanto, se si analizza la presenza di lacune post-replicative di ssDNA, lo sperimentatore dovrebbe eseguire la sezione 2 (configurazione sperimentale della fibra S1) e procedere direttamente alla sezione 4 (preparazione della fibra di DNA mediante diffusione) del protocollo. Se si analizzano gli eventi di riempimento delle lacune, lo sperimentatore deve procedere direttamente alla sezione 3 (Configurazione sperimentale del riempimento del vuoto (PRR)."

1. Reagenti e configurazione

  1. Analoghi della timidina: 5-iodo-2'-deossiuridina (IdU) e 5-cloro-2'-deossiuridina (CldU) in 1 N NH4OH fino a una concentrazione finale di 100 mM. Filtrare gli analoghi attraverso un filtro a siringa sterile (0,2 μm), aliquota, e conservarli a -20 C.
  2. Anticorpi: Primari - ratto anti-BrdU (Biorad) e topo anti-BrdU (BD); Secondari - anti-ratto Alexa Fluor 488 e anti-mouse Alexa Fluor 594.
  3. Tampone di permeabilizzazione cellulare CSK100 per la fibra S1: aggiungere 100 mM NaCl, 10 mM MOPS [pH 7], 3 mM MgCl2 [pH 7,2], 300 mM saccarosio e 0,5% Triton X-100 in H2O distillato.
  4. Tampone nucleasi S1 [pH 4.6]: Aggiungere 30 mM di acetato di sodio [pH 4.6], 10 mM di acetato di zinco, 50 mM NaCl e 5% di glicerolo in H2O.
    NOTA: Il tampone per nucleasi S1 deve avere un pH finale di 4,6, poiché l'attività S1 scende del 50% a pH > 4,9.
  5. Aliquota e conservare a -20 °C la nucleasi S1 purificata da A. oryzae pre-diluita in tampone di diluizione per nucleasi S1 fornito dal fabbricante.
  6. Ricostituire il nocodazolo in DMSO ad una concentrazione finale di 2 mM per il riempimento delle lacune. Saggio.
  7. Tampone di lisi: aggiungere 200 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM EDTA e 0,5 % SDS in H2O.
  8. Preparare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
  9. Preparare PBS-T aggiungendo lo 0,1% di Tween-20 in PBS.
  10. Preparare il 5% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS.
  11. Preparare lo 0,1% di BSA in PBS.
  12. Preparare PBS-T-BSA aggiungendo l'1% di BSA in PBS-T.
    NOTA: utilizzare un microscopio epifluorescente con una lampada al mercurio o allo xeno con una lunghezza d'onda di 510 nm e un filtro di emissione GFP (FITC, Alexa Fluor 488) a 42 nm e un filtro di emissione Texas Red (Alexa Fluor 594) a lunghezza d'onda di 624 nm e larghezza di banda di 40 nm o un microscopio confocale con un laser a linea (blu) a 488 nm per rilevare la fluorescenza verde (rilevata tra 510 e 560 nm) e un laser a linea (giallo) a 561 nm per rilevare la fluorescenza rossa ( rilevato tra 575 e 680 nm). Obiettivo di immersione (40x, 63x o 100x).

2. Configurazione sperimentale della fibra S1 (2 giorni)

  1. Giorno 1: Piastra 4 pozzetti per ogni linea cellulare: ± NUC UVC e ± nucleasi S1 con cellule al 70-90% di confluenza.
    NOTA: l'esperimento può essere eseguito in un formato piccolo come una piastra a 12 pozzetti. In questo caso, tutte le soluzioni vengono utilizzate a 0,5 ml / pozzetto.
  2. Giorno 2: Preparare IdU fresco a 20 μM e CldU a 200 μM in terreni di coltura cellulare preriscaldati (37 °C).
  3. Aspirare il terreno di coltura e aggiungere immediatamente il mezzo con 20 μM IdU e incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 (incubatore cellulare) per esattamente 20 minuti.
  4. Lavare rapidamente le celle con PBS preriscaldato (37 °C) due volte.
  5. Irradiare le cellule con 20 J/m2 UVC. Utilizzare cellule non trattate come controlli.
  6. Aggiungere immediatamente il mezzo con 200 μM CldU e incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 (incubatore cellulare) per esattamente 60 minuti.
    NOTA: l'etichettatura IdU e CldU può essere intercambiata, ma la concentrazione del secondo analogo deve essere 5-10 volte superiore al primo analogo. I tempi di incubazione analogica possono essere adattati all'agente genotossico utilizzato, ma il tempo della seconda incubazione analogica dovrebbe essere abbastanza lungo da garantire un tempo sufficiente per la formazione di gap14,16. Se si utilizza un farmaco dannoso per il DNA, aggiungere il farmaco insieme a CldU 28,29,30.
  7. Lavare le celle con PBS preriscaldato (37 °C) due volte.
  8. Permeabilizzare le celle con il tampone CSK100 per 8-10 min a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: la permeabilizzazione riuscita può essere controllata al microscopio a campo luminoso in cui solo i nuclei devono essere osservabili
  9. Lavare accuratamente i nuclei con PBS (versare 0,5 ml lungo il lato di ciascun pozzetto, solo per pochi secondi).
  10. Lavare accuratamente i nuclei con tampone S1 (versare 0,5 ml lungo il lato di ciascun pozzetto, solo per pochi secondi).
  11. Incubare i nuclei con tampone S1 con nucleasi S1 (20 U/mL) o senza (come controllo) per 30 min a 37 °C (incubatore cellulare).
  12. Aspirare il tampone S1 e aggiungere lo 0,1% di BSA in PBS.
  13. Raschiare i nuclei e trasferirli in un tubo da 1,5 ml opportunamente annotato. Tieni i tubi sul ghiaccio tutto il tempo.
    NOTA: Il successo del distacco dei nuclei può essere controllato al microscopio a campo luminoso.
  14. Pellet i nuclei: centrifugare a ~4600 x g per 5 min, a 4 °C.
    NOTA: A differenza del test standard delle fibre di DNA, i nuclei non possono essere contati, quindi considera il numero iniziale di cellule placcate. In alternativa, un pozzo extra che non è stato sottoposto a permeabilizzazione può essere utilizzato per stimare il conteggio cellulare utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare.
  15. Risospesare bene i pellet in PBS ad una concentrazione di ~ 1500 cellule / μL, posizionare i tubi sul ghiaccio e procedere alla preparazione della fibra di DNA diffondendo immediatamente (sezione 4) il protocollo

3. Configurazione sperimentale del gap-filling (PRR) (3 giorni)

  1. Giorno 1: Piastra 2 pozzetti per ogni linea cellulare: ± UVC con cellule a ~ 70 % di confluenza.
  2. Giorno 2: Preparare IdU fresco a 20 μM in terreni di coltura cellulare preriscaldati (37 °C).
  3. Irradiare le cellule con 20 J/m2 UVC.
  4. Aggiungere immediatamente il mezzo con 20 μM IdU e incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 (incubatore cellulare) per esattamente 60 minuti.
  5. Lavare le celle con PBS preriscaldato (37 °C) due volte.
  6. Aggiungere immediatamente il mezzo con 200 ng/mL di nocodazolo e incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 (incubatore cellulare) per 12-24 ore (i tempi di questa fase devono essere mantenuti coerenti tra gli esperimenti).
    NOTA: Potrebbe essere necessario adattare la concentrazione di nocodazolo in base alla linea cellulare utilizzata. Se si utilizza un farmaco genotossico, incubare le cellule con IdU ± farmaco28.
  7. Giorno 3: Aspirare il terreno di coltura, aggiungere il terreno con 20 μM CldU + nocodazolo e incubare per le ultime 4 ore di trattamento con nocodazolo, a 37 °C, 5% CO2 (incubatore cellulare).
  8. Lavare le celle con PBS preriscaldato (37 °C).
  9. Aggiungere tripsina e incubare per 1-2 minuti a 37 °C, 5% CO2 (incubatore cellulare) per staccare le cellule.
  10. Aggiungere lo stesso volume di terreni di coltura cellulare e raccogliere le cellule (media + tripsina) in un tubo da 1,5 ml opportunamente annotato. Tenere i tubi sul ghiaccio tutto il tempo.
  11. Contare le cellule usando un emocitometro o un contatore di cellule.
  12. Pellet le celle: centrifugare a ~350 x g per 5 min, a 4 °C.
  13. Rimuovere il surnatante e risospese le cellule in PBS a ~ 1500 cellule / μL. Mantenere le cellule sul ghiaccio e iniziare la preparazione della fibra di DNA diffondendo immediatamente il protocollo (Giorno 3 o 4).

4. Preparazione della fibra di DNA mediante diffusione (~ 1 ora per 12 diapositive)

  1. Annotare i vetrini del microscopio con una matita di carbonio e posizionarli su un vassoio.
  2. Toccare il fondo del tubo per garantire l'omogeneizzazione.
  3. Aggiungere 2 μL di celle nella parte superiore della diapositiva corrispondente.
    NOTA: è possibile aggiungere due gocce, una nella parte superiore della diapositiva e un'altra al centro della diapositiva.
  4. Aggiungere 6 μL del tampone di lisi e lisare le cellule tubando su e giù circa 5 volte (evitare di fare bolle).
  5. Tirare un po 'la goccia verso il fondo della diapositiva con la punta della pipetta (per guidare il percorso della diffusione della goccia).
  6. Incubare per 5 minuti a RT per lisare i nuclei.
    NOTA: il volume del tampone di lisi e il tempo di lisi possono essere regolati se il lisato si asciuga troppo rapidamente o, in alternativa, non si asciuga abbastanza. Il volume del tampone di lisi può variare da 5-7 μL e la temporizzazione può variare tra 4-10 min.
  7. Inclinare la slitta a circa 20-40 ° e consentire alla goccia di diffondersi sul fondo della diapositiva a una velocità costante e bassa.
  8. Lasciare asciugare la diapositiva a RT al buio (10-15 min).
  9. Preparare al momento la soluzione fissante: Mescolare metanolo: acido acetico glaciale in un rapporto 3:1.
  10. Immergere i vetrini in un barattolo contenente la soluzione fissante e incubare per 5 minuti a RT per fissare il DNA sui vetrini.
    ATTENZIONE: il metanolo è altamente tossico e deve essere tenuto sotto un cappuccio chimico. Scartare in un contenitore appropriato.
  11. Asciugare i vetrini a RT al buio e conservare a 4 °C al riparo dalla luce fino alla colorazione.

5. Immunocolorazione delle fibre di DNA (~6 h)

  1. Lavare le diapositive con PBS due volte per 5 minuti.
  2. Denatura il DNA con 2,5 M HCl appena preparato per 40-60 minuti a RT.
    ATTENZIONE: Per preparare 2,5 M HCl, versare acido in acqua e mai il contrario. Questa è una reazione esotermica, quindi si scalderà leggermente.
  3. Lavare le diapositive con PBS tre volte per 5 minuti.
  4. Blocco con BSA al 5% (può essere conservato a 20 °C per un massimo di tre usi) precedentemente riscaldato a 37 °C per 30-60 minuti a 37 °C.
  5. Rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini picchiettando delicatamente su un foglio.
  6. Aggiungere 30 μL di anticorpi primari (anti-BrdU 1/20 di topo (per IdU) e anti-BrdU di ratto 1/100 (per CldU) diluiti in PBS-T-BSA) alle diapositive verso il basso e posizionare un coperchio sopra. Incubare per 1-1,5 ore a RT in una camera buia e umida.
  7. Posizionare le diapositive in un barattolo con PBS per 1-2 minuti, quindi rimuovere con cura le coperture.
  8. Lavare con PBS-T in un barattolo tre volte per 5 minuti, quindi posizionare i vetrini in PBS.
  9. Rimuovere il liquido in eccesso picchiettando delicatamente su una carta.
  10. Aggiungere 30 μL di anticorpi secondari (anti-mouse Alexa Fluor 594 e anti-ratto Alexa Fluor 488 diluito a 1/75 in PBS-T-BSA.) alle diapositive dropwise e posizionare un coverslip sopra. Incubare per 45-60 minuti a RT in una camera buia e umida.
  11. Posizionare le diapositive in un barattolo con PBS per 1-2 minuti, quindi rimuovere con cura le coperture.
  12. Lavare con PBS-T in un barattolo tre volte per 5 minuti, quindi posizionare i vetrini in PBS.
  13. Rimuovere il liquido in eccesso picchiettando delicatamente su una carta.
  14. Aggiungere 20 μL del reagente di montaggio a goccia alle diapositive e posizionare un coperchio sopra. Evita le bolle.
  15. Lasciare asciugare i vetrini a RT al buio, quindi conservare a 4 °C (o -20 °C per una conservazione più lunga).

6. Acquisizione e analisi delle immagini (~ 1 ora per campione)

NOTA: Un microscopio a epifluorescenza può essere utilizzato per entrambi i protocolli. Tuttavia, per il test di gap-filling (PRR), l'utilizzo di un microscopio confocale è altamente raccomandato per l'aumento della risoluzione delle immagini.

  1. Posiziona una goccia di olio ad immersione (specifico del microscopio) vicino alla parte superiore del vetrino in cui le cellule sono state lisate e trova la messa a fuoco usando il canale verde cercando punti verdi sullo sfondo (è possibile utilizzare obiettivi 40x, 63x e 100x).
  2. Trova la concentrazione principale di fibre e spostati sui bordi per trovare singole fibre non sovrapposte ben diffuse utilizzando un solo canale per selezionare le regioni per le immagini ed evitare potenziali distorsioni.
  3. Scatta circa 15-20 foto per diapositiva accanto all'intera diapositiva nei canali verde e rosso e unisci i due canali per ottenere fibre di DNA bicolore.
    NOTA: se si utilizza un microscopio confocale, scattare foto ad alta risoluzione (1024 x 1024 pixel) e utilizzare valori stenopeici vicini a 1 per la fluorescenza rossa e verde.
  4. Usa ImageJ (software gratuito fornito dal NIH, https://imagej.nih.gov/ij/) per le misurazioni della lunghezza del tratto IdU e CldU.
    1. Aprire un'immagine trascinandola nella casella ImageJ.
    2. Utilizzare la barra della scala generata dal software del microscopio (opportunamente calibrata) per convertire la lunghezza in micrometri. Utilizzare lo strumento Linea retta selezionando la5a icona da sinistra a destra nella casella ImageJ per misurare la barra della scala nei micrometri forniti nell'immagine fornita e ottenere una misurazione in pixel. Fare clic su Analizza > Imposta scala e sostituire la "distanza in pixel" con il numero appropriato e l'"unità di lunghezza" a μm.
    3. Nella casella ImmagineJ selezionare lo strumento Linea segmentata facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sulla5a icona da sinistra a destra, quindi selezionando la seconda opzione dall'alto verso il basso.
    4. Disegnate il tracciato esatto del tratto rosso (IdU) o verde (CldU) facendo clic con il pulsante sinistro del mouse e interrompete il disegno facendo clic con il pulsante destro del mouse. Premere il pulsante M sulla tastiera per misurare la lunghezza.
    5. Per la fibra S1, analizzare solo il rosso-verde (fibre bicolore)16. Misura le lunghezze dei tratti rossi e verdi da almeno 150 fibre da immagini diverse tenendo traccia delle misurazioni dei tratti rossi e verdi per ogni singola fibra.
    6. Per il test di riempimento delle lacune, misurare solo la lunghezza dei tratti IdU (rossi) che contengono almeno 1 cerotto CldU (verde) ma nessuna colorazione CldU continua. Segna almeno 10-15 tratti IdU da immagini diverse con almeno 1 patch CldU.
      NOTA: per le analisi è possibile utilizzare altri software, ad esempio Zeiss LSM Image Browser.
  5. Per le fibre S1, tracciare la lunghezza dei tratti IdU, la lunghezza dei tratti CldU e i rapporti (CldU/IdU o viceversa) in grafici separati come grafici a punti scatter con mediane.
  6. Misurare gli eventi di riempimento del gap come unità di "densità per kilobase", dividere il numero totale di patch CldU (PRR, verde) su una data lunghezza di tratto IdU (rosso) per la lunghezza totale del tratto rosso in kilobasi (considerando 1 μm = 2,59 kilobasi31). Quindi traccia i dati come grafici a punti a dispersione con mediane.
  7. In entrambi gli esperimenti, eseguire analisi statistiche tra due campioni utilizzando Mann-Whitney (test non parametrico) e tra più di due campioni utilizzando Kruskal-Wallis seguito dal test di confronti multipli di Dunn.

Risultati

Nel test S1 Fiber, se il trattamento con un agente genotossico porta a lacune post-replicative di ssDNA, le lunghezze complessive delle fibre di DNA dai nuclei trattati con S1 saranno più brevi dopo il trattamento con danno al DNA rispetto ai campioni non trattati e ai campioni che sono stati trattati con l'agente genotossico ma non sono stati sottoposti a scissione S1 (Figura 1).

In alternativa, se il trattamento con nucleasi S1 non influisce in modo significati...

Discussione

I passaggi critici del protocollo standard di analisi delle fibre di DNA sono stati discussi in una precedente pubblicazione32. Qui, descriviamo le versioni modificate del test standard delle fibre di DNA per studiare la presenza di lacune post-replicative di ssDNA e la loro riparazione mediante gap-filling, inizialmente descritto in14. Nel contesto della presenza post-replicativa di ssDNA gap, l'uso della nucleasi S1 nel protocollo S1 Fiber sarebbe molto probabilmente adat...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Il lavoro nel laboratorio C.F.M.M. è supportato dalla Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brasile, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 e 2017/05680-0) nell'ambito dell'International Collaboration Research di FAPESP e The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO, Paesi Bassi); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brasile, Grants # 308868/2018-8] e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brasile, Finance Code 001).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acid, GlacialSynth64-19-7Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100
Ammonium hydroxideSynth1336-21-6Or similar
Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594InvitrogenA11005-
Antibody anti-rat Alexa Fluor 488InvitrogenA21470-
Antibody Mouse anti-BrdUBecton Disckson347580-
Antibody Rat anti-BrdUAbcam Ab6326-
Biological security hoodPachanePA 410Use hood present in the laboratory
BSA (Bovine Serum Albumin)Sigma-AldrichA3294Or similar
Cell scraperThermo Scientific179693Or similar
CldUMillipore-SigmaC6891-
Cloridric acidSynth7647-01-0Or similar
Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9)Zeiss-Or similar
Cover glass (or coverslips)Thermo Scientific152460Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460
DMEM - High GlucoseLGC/GibcoBR30211-05/12100046Use culture media specific for the cell line used.
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)Sigma-AldrichE5314Or similar
Epifluorescence Microscope Axiovert 200Zeiss-Or similar
FBS (Fetal Bovine Serum)Gibco12657-029Or similar
Forma Series II Water Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific 311013-998-074Use cell incubator present in the laboratory
Glass slide jarSigma-AldrichS5516Or similar
GlycerolSigma-Aldrich56-81-5Or similar
IduMillipore-SigmaI7125-
Magnesium ChlorideSynth7791-18-6Or similar
MethanolMerck67-56-1Or similar
Microscope slidesDenvilleM1021Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1
MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico)Synth1132-61-2Or similar
NocodazoleSigma-Aldrich31430-18-9-
PBS (Phosphate Buffer Saline)Life Thechnologies3002Or similar
Penicillin-StreptomycinGibco15140122Or similar
ProLong Gold AntiFade MountantInvitrogenP36930Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used
S1 nuclease purified from Aspergillus oryzaeInvitrogen18001-016Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)BioRad161-0302Or similar
Sodium Acetate TrihydrateSigma-Aldrich6131-90-4Or similar
Sodium ChlorideSynth 7647-14-5Or similar
SucroseSigma-Aldrich57-50-1Or similar
Tris BaseWest Lab ResearchBP152-1Or similar
Triton X-100Synth9002-93-1Or similar
TrypsinGibco25200072Or similar
Tween 20Sigma-AldrichP1379Or similar
UVC LampNon Specific-Essential: emission lenght of 254 nm
VLX-3W UV RadiometerVilber Loumart-Or similar
Zinc AcetateSigma-Aldrich557-34-6Or similar

Riferimenti

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