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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Infrapatellare Fettpolster mesenchymale Stammzellen (IFP-MSCs) können leicht aus dem infrapatellaren Fettpolster des Kniegelenks isoliert werden. Sie vermehren sich gut in vitro, bilden CFU-F-Kolonien und differenzieren sich in adipogene, chondrogene und osteogene Linien. Hierin wird die Methodik für die Isolierung, Expansion und Differenzierung von IFP-MSCs aus dem Ziegenstielgelenk bereitgestellt.

Zusammenfassung

Das IFP, das im Kniegelenk vorhanden ist, dient als vielversprechende Quelle für MSCs. Das IFP ist ein leicht zugängliches Gewebe, da es routinemäßig bei arthroskopischen Eingriffen und Kniegelenkersatzoperationen reseziert und verworfen wird. Darüber hinaus ist seine Entfernung mit einer minimalen Morbidität an der Spenderstelle verbunden. Neuere Studien haben gezeigt, dass IFP-MSCs während der In-vitro-Expansion ihre Proliferationsfähigkeit nicht verlieren und ein altersunabhängiges osteogenes Differenzierungspotenzial aufweisen. IFP-MSCs besitzen ein überlegenes chondrogenes Differenzierungspotenzial im Vergleich zu Knochenmark-abgeleiteten MSCs (BMSCs) und adipösen Stammzellen (ADSCs). Obwohl diese Zellen von älteren und kranken Patienten leicht zu erhalten sind, ist ihre Wirksamkeit begrenzt. Daher ist die Verwendung von IFP-MSCs von gesunden Spendern wichtig, um ihre Wirksamkeit in biomedizinischen Anwendungen zu bestimmen. Da der Zugang zu einem gesunden menschlichen Spender schwierig ist, könnten Tiermodelle eine bessere Alternative sein, um ein grundlegendes Verständnis zu ermöglichen. Großtiere wie Hunde, Pferde, Schafe und Ziegen spielen in der translationalen Forschung eine entscheidende Rolle. Unter diesen könnte die Ziege ein bevorzugtes Modell sein, da das Würgegelenk der Ziege die Anatomie hat, die dem menschlichen Kniegelenk am nächsten kommt. Darüber hinaus kann Ziegen-IFP die höheren MSC-Werte erfüllen, die für Geweberegenerationsanwendungen benötigt werden. Niedrige Kosten, Verfügbarkeit und die Einhaltung der 3R-Prinzipien für Tierversuche machen sie zudem zu einem attraktiven Modell. Diese Studie demonstriert ein einfaches Protokoll zur Isolierung von IFP-MSCs aus dem Würgegelenk von Ziegen und In-vitro-Kulturbedingungen für ihre Expansion und Differenzierung. Das aseptisch isolierte IFP aus der Ziege wurde gewaschen, zerkleinert und enzymatisch verdaut. Nach der Filtration und Zentrifugation wurden die gesammelten Zellen kultiviert. Diese Zellen waren adhärent, hatten eine MSCs-ähnliche Morphologie und zeigten bemerkenswerte klonogene Fähigkeiten. Darüber hinaus differenzierten sie sich in adipogene, chondrogene und osteogene Linien und demonstrierten ihre Multipotenz. Zusammenfassend zeigt die Studie die Isolierung und Ausbreitung von MSCs, die Potenzial für Anwendungen im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin zeigen.

Einleitung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind ein attraktiver Kandidat für zellbasierte Therapien in der regenerativen Medizin 1,2. Sie können aus einer Vielzahl von Gewebequellen wie Knochenmark, Nabelschnur, Plazenta, Zahnpulpa und subkutanem Fettgewebe gewonnen werden3. Da die Verfügbarkeit von Stammzellen bei Erwachsenen jedoch begrenzt ist und ihr Isolationsverfahren oft invasiv ist (was zu Morbidität an der Spenderstelle führt), ist es wünschenswert, eine alternative Stammzellquelle zu haben, die diese Herausforderungen umgehen könnte.

Das Kniegelenk ist ein Dep....

Protokoll

Das Protokoll basiert auf der Isolierung von IFP-MSCs aus Ziegen. Ziegen-IFP und Blut wurden in einem örtlichen Schlachthof gesammelt. Da solche Gewebeentnahmen nicht in den Zuständigkeitsbereich einer institutionellen Tierethikkommission fallen, war eine ethische Genehmigung nicht erforderlich.

1. Isolierung von IFP-MSCs aus dem Femorotibialgelenk des Ziegenknies

  1. Sammeln Sie ein Femorotibialgelenk (Probe) der Ziege, das jeweils ~15 cm der Oberschenkel- und Tibiaregionen der Hinterbeine umfasst. Legen Sie die Probe sofort in eine sterilisierte Probensammelbox und lagern Sie sie bei 4 °C, um sie zur weiteren Verarb....

Ergebnisse

Isolierung von IFP-MSCs aus dem Femorotibialgelenk einer Ziege
Die Schritte bei der Isolierung von IFP-MSCs aus dem Würgegelenk einer Ziege sind in Abbildung 1 dargestellt. Das Fettpolster, das in der inneren nicht artikulierten Oberfläche der Patella vorhanden war, wurde entfernt, zerkleinert und enzymatisch verdaut. Die IFP-MSCs wurden erfolgreich isoliert und in vitro kultiviert (Abbildung 2A).

Diskussion

Im vorliegenden Protokoll wurde eine einfache, zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Isolierung von MSCs aus Ziegen-IFP bereitgestellt. Zellen, die mit dieser Methode isoliert wurden, wurden in unseren früheren Studien erfolgreich zur In-vitro-Geweberegeneration eingesetzt. Es wurde beobachtet, dass die isolierten Zellen proliferativ waren, auf verschiedene Wachstumsfaktoren ansprachen und ihre biologische Aktivität behielten, wenn sie auf elektrogesponnenen Fasern und Gerüsten ausgesät wurden

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Danksagungen

SH bedankt sich für die Unterstützung durch das Postdoktorandenstipendium des Instituts des IIT Kanpur und das SYST-Stipendium der DST (SEED Division) (SP / YO / 618 / 2018). AM dankt dem Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) für ein Institutsstipendium. DSK dankt der Gireesh Jankinath Chair Professur und dem Department of Biotechnology, Indien, für die Finanzierung (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH und DSK danken dem Mehta Family Centre for Engineering in Medicine am IIT-Kanpur für ihre großzügige Unterstützung.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
β-glycerophosphateSigma-AldrichG9422-10G10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTAHi-MediaTCL049
15-mL centrifuge tubeCorning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma49752-10G50 µg/mL
2-PropanolSigma-AldrichI9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)HiMediaTCL021-50ml10 mM
50-mL centrifuge tubeCorning
Alcian BlueHi-MediaRM471For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red SS D Fine-Chem Limited26048-25GFor calcium deposition
Amphotericin BHiMediaA0112.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF)Sino Biologicals10014-HNAE5 ng/mL
BCIP/NBT ALP SubstrateSigmaB5655-5TABFor ALP staining
Biological safety cabinet
BSAHiMediaMB-083Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainerHiMediaTCP-18270 µm
CentrifugeREMI
CiprofloxacinRANBAXY LAB. LimitedB17407T12.5 µg/mL
Crystal VioletS D Fine-Chem Limited42555
D(+)-glucoseMerck1.94925.052125 mM
DexamethasoneSigma-AldrichD29151 µM
DMEM LGSIGMAD5523Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
EthanolMerck100983
FBSGibco10270Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41%Merck61780805001730
IndomethacinSigma-AldrichI7378100 µM
InsulinSigma-AldrichI927810 µg/mL
Inverted microscopeNikon Eclipse TS 100
ITS + 1Sigma-AldrichI2521-5mLLong name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-ProlineHiMediaTO-109-25G1 mM
Magnesium chlorideMerck61751605001730For lysis buffer
MethanolMeck1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)Thermoscientific
MUSE Cell analyserMerck MilliporeFor cell counting
OCT compoundTissue-Tek4583Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dyeS D Fine-Chem Limited54304For lipid vacuole staining
Penicillin-StreptomycinHiMediaA007100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm)NEST
Safranin OS D Fine-Chem Limited50240For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrateSigma-AldrichC34343.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpelsFor isolation of IFP-MSC
SucroseMerck1.94953.052135 % (w/v)
TGF-β1Sino BiologicalsLong name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2Thermoscientific
Tris bufferMerck61771405001730For lysis buffer
Triton X100S D Fine-Chem Limited40632For lysis buffer
Type II collagenaseGibco171010151.5 mg/mL
Vitamin D3SigmaC9756-1G10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP)NEST

Referenzen

  1. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
  2. Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regenerative ....

Nachdrucke und Genehmigungen

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