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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Infrapatellare Fettpolster mesenchymale Stammzellen (IFP-MSCs) können leicht aus dem infrapatellaren Fettpolster des Kniegelenks isoliert werden. Sie vermehren sich gut in vitro, bilden CFU-F-Kolonien und differenzieren sich in adipogene, chondrogene und osteogene Linien. Hierin wird die Methodik für die Isolierung, Expansion und Differenzierung von IFP-MSCs aus dem Ziegenstielgelenk bereitgestellt.

Zusammenfassung

Das IFP, das im Kniegelenk vorhanden ist, dient als vielversprechende Quelle für MSCs. Das IFP ist ein leicht zugängliches Gewebe, da es routinemäßig bei arthroskopischen Eingriffen und Kniegelenkersatzoperationen reseziert und verworfen wird. Darüber hinaus ist seine Entfernung mit einer minimalen Morbidität an der Spenderstelle verbunden. Neuere Studien haben gezeigt, dass IFP-MSCs während der In-vitro-Expansion ihre Proliferationsfähigkeit nicht verlieren und ein altersunabhängiges osteogenes Differenzierungspotenzial aufweisen. IFP-MSCs besitzen ein überlegenes chondrogenes Differenzierungspotenzial im Vergleich zu Knochenmark-abgeleiteten MSCs (BMSCs) und adipösen Stammzellen (ADSCs). Obwohl diese Zellen von älteren und kranken Patienten leicht zu erhalten sind, ist ihre Wirksamkeit begrenzt. Daher ist die Verwendung von IFP-MSCs von gesunden Spendern wichtig, um ihre Wirksamkeit in biomedizinischen Anwendungen zu bestimmen. Da der Zugang zu einem gesunden menschlichen Spender schwierig ist, könnten Tiermodelle eine bessere Alternative sein, um ein grundlegendes Verständnis zu ermöglichen. Großtiere wie Hunde, Pferde, Schafe und Ziegen spielen in der translationalen Forschung eine entscheidende Rolle. Unter diesen könnte die Ziege ein bevorzugtes Modell sein, da das Würgegelenk der Ziege die Anatomie hat, die dem menschlichen Kniegelenk am nächsten kommt. Darüber hinaus kann Ziegen-IFP die höheren MSC-Werte erfüllen, die für Geweberegenerationsanwendungen benötigt werden. Niedrige Kosten, Verfügbarkeit und die Einhaltung der 3R-Prinzipien für Tierversuche machen sie zudem zu einem attraktiven Modell. Diese Studie demonstriert ein einfaches Protokoll zur Isolierung von IFP-MSCs aus dem Würgegelenk von Ziegen und In-vitro-Kulturbedingungen für ihre Expansion und Differenzierung. Das aseptisch isolierte IFP aus der Ziege wurde gewaschen, zerkleinert und enzymatisch verdaut. Nach der Filtration und Zentrifugation wurden die gesammelten Zellen kultiviert. Diese Zellen waren adhärent, hatten eine MSCs-ähnliche Morphologie und zeigten bemerkenswerte klonogene Fähigkeiten. Darüber hinaus differenzierten sie sich in adipogene, chondrogene und osteogene Linien und demonstrierten ihre Multipotenz. Zusammenfassend zeigt die Studie die Isolierung und Ausbreitung von MSCs, die Potenzial für Anwendungen im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin zeigen.

Einleitung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind ein attraktiver Kandidat für zellbasierte Therapien in der regenerativen Medizin 1,2. Sie können aus einer Vielzahl von Gewebequellen wie Knochenmark, Nabelschnur, Plazenta, Zahnpulpa und subkutanem Fettgewebe gewonnen werden3. Da die Verfügbarkeit von Stammzellen bei Erwachsenen jedoch begrenzt ist und ihr Isolationsverfahren oft invasiv ist (was zu Morbidität an der Spenderstelle führt), ist es wünschenswert, eine alternative Stammzellquelle zu haben, die diese Herausforderungen umgehen könnte.

Das Kniegelenk ist ein Depot verschiedener Zelltypen, wie z.B. infrapatellare Fettpolster-abgeleitete MSCs, Synovialmembran-abgeleitete MSCs, Synovialflüssigkeits-abgeleitete MSCs, Ligament-Fibroblasten, artikuläre Chondrozyten usw. 4,5,6. Diese Zellen haben das Potenzial, in der muskuloskelettalen Tissue Engineering-basierten Forschung umfassend erforscht zu werden. Daher könnte das Kniegelenk eine mögliche und zuverlässige Quelle für mehrere Arten von MSCs sein. Das im Kniegelenk befindliche Fettdepot, das als infrapatelläres Fettpolster (IFP) oder Hoffa-Fettpolster bekannt ist, ist eine vielversprechende und alternative Wahl des MSC-Depots. Das IFP ist eine relativ leicht zugängliche und klinisch erhältliche Quelle für MSCs, da es routinemäßig reseziert und als chirurgischer Abfall während einer Kniearthroskopie oder einer Operation am offenen Knie entsorgt wird. Die Entfernung des IFP ist mit einer minimalen Morbidität an der Spenderstelle verbunden, was es auch zu einer attraktiven Gewebequelle macht. Obwohl sie ein ähnliches phänotypisches Profil aufweisen, haben MSCs aus IFP (IFP-MSCs) ein erhöhtes klonogenes Potenzial im Vergleich zu mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark (BM-MSCs)6 und eine bessere Proliferationskapazität im Vergleich zu subkutanen Fettstammzellen (ADSCs)7. Interessanterweise verlieren IFP-MSCs im Vergleich zu Synovialflüssigkeits-abgeleiteten MSCs (SF-MSCs) weder ihre Proliferationskapazität bei späten Passagen, noch erhöht sich die Verdopplungszeit bei späten Passagen. Dies deutet darauf hin, dass IFP-MSCs während der Zellexpansion eine ausreichend große Anzahl von Zellen für In-vitro-Tissue-Engineering-Anwendungen erreichen können, ohne ihre Proliferationsrate zu beeinträchtigen8. Neuere Studien deuten auch darauf hin, dass IFP-MSCs ein überlegenes chondrogenes Differenzierungspotenzial im Vergleich zu Knochenmark-abgeleiteten MSCs (BMSCs) und adipositas-abgeleiteten MSCs (ADSCs) besitzen, wahrscheinlich aufgrund ihrer anatomischen Nähe zum Gelenkknorpel, was auf ihre Eignung für das Knorpelgewebe-Engineering hinweist 6,7,9,10. Darüber hinaus besitzen sie auch ein altersunabhängiges osteogenes Differenzierungspotenzial11. Es wurde gezeigt, dass die intraartikuläre Injektion von IFP-MSCs bei Patienten mit Osteoarthritis (OA) Schmerzen lindert und die Kniegelenksfunktionen verbessert12,13. Darüber hinaus wurde auch über starke immunsuppressive Reaktionen und verbesserte immunmodulatorische Eigenschaften von IFP-MSCs in Gegenwart von inflammatorischen Zytokinen unter pathologischen Zuständen berichtet6.

IFP-MSCs sind eine vielversprechende und alternative Quelle für MSCs; Ihr therapeutischer Nutzen im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin ist jedoch relativ wenig erforscht. Die bestehenden Studien zu IFP-MSCs haben hauptsächlich Zellen von menschlichen Spendern verwendet. Unter diesen haben einige neuere Studien IFP-MSCs von gesunden menschlichen Spendern (nicht-arthritische Patienten im Alter von 17-60 Jahren) untersucht6,14, während die meisten Studien IFP-MSCs von älteren Patienten verwendet haben, die sich einer Kniegelenkersatzoperation unterzogen haben (erkrankte Patienten im Alter von 70-80 Jahren). Da bekannt ist, dass sowohl das Alter als auch die Krankheit die normale Funktion der Stammzellen verändern (reduzierte Anzahl und Verlust des funktionellen Potenzials), könnte dies möglicherweise zu Inkonsistenzen in den Ergebnissen der MSC-basierten Studienführen 7,15,16,17. Darüber hinaus stellt die Verwendung von IFP-MSCs von Patienten mit pathophysiologischen Zuständen (z. B. Arthritis und Adipositas) auch Schwierigkeiten dar, die grundlegenden Eigenschaften gesunder Zellen in vitro zu verstehen, was als limitierender Faktor bei der Entwicklung von MSCs-basierten Therapien wirkt. Um diese Probleme zu überwinden, ist die Verwendung von IFP-MSCs von gesunden Spendern von entscheidender Bedeutung. Da der Zugang zu einem gesunden menschlichen Spender eine Herausforderung darstellt, könnten Tiermodelle eine bessere Alternative sein. In diesem Zusammenhang gibt es einige Studien, in denen IFP aus Mäusen isoliert wurde18. Aufgrund der geringen Größe des Fettpolsters bei normalen Mäusen wurde jedoch Fettgewebe von mehreren Tieren kombiniert, um genügend Gewebe für die Durchführung aufwendiger experimenteller Verfahren zu erhalten19. Daher besteht ein Bedarf an einem großen Tiermodell, das die Anforderung an die höhere Anzahl von Zellen erfüllen und gleichzeitig die 3R-Prinzipien (verfeinern, ersetzen und reduzieren) im Tierversuch erfüllenkönnte 20. Die Verwendung von Großtieren hat erhebliche Auswirkungen auf die translationale Forschung. Insbesondere im Bereich des muskuloskelettalen Tissue Engineering wurde eine Reihe von Großtieren wie Hunden, Schweinen, Schafen, Ziegen und Pferden untersucht21. Die Ziege (Capra aegagrus hircus) ist eine ausgezeichnete Wahl für große Tiere, da ihr Würgegelenk die Anatomie hat, die dem menschlichen Kniegelenk am nächsten kommt22,23,24. Die subchondrale Knochentrabekelstruktur und die subchondrale Knochendicke von Ziegen ähneln denen des Menschen, und auch das Verhältnis von Knorpel zu Knochen wird dem des Menschen nahe gebracht21. Darüber hinaus wurden Ziegen auf der ganzen Welt domestiziert, so dass sie leicht verfügbar sind, wenn sie skelettreif sind. Darüber hinaus haben die geringen Wartungskosten und die einfache Handhabung sie zu einem attraktiven Tiermodell für die Forschung gemacht22.

In der vorliegenden Studie werden ein einfaches Protokoll für die Isolierung von IFP-MSCs aus dem Stifle-Gelenk von Capra aegagrus hircus (Ziege ) und in vitro Kulturbedingungen für ihre Expansion und Differenzierung demonstriert. Die isolierten Zellen sind adhärent, haben eine MSC-ähnliche Morphologie, bilden CFU-F-Kolonien (koloniebildende Einheitsfibroblasten) und besitzen ein adipogenes, chondrogenes und osteogenes Differenzierungspotential. Daher zeigen IFP-MSCs Potenzial als alternative Quelle für MSCs für biomedizinische Anwendungen.

Protokoll

Das Protokoll basiert auf der Isolierung von IFP-MSCs aus Ziegen. Ziegen-IFP und Blut wurden in einem örtlichen Schlachthof gesammelt. Da solche Gewebeentnahmen nicht in den Zuständigkeitsbereich einer institutionellen Tierethikkommission fallen, war eine ethische Genehmigung nicht erforderlich.

1. Isolierung von IFP-MSCs aus dem Femorotibialgelenk des Ziegenknies

  1. Sammeln Sie ein Femorotibialgelenk (Probe) der Ziege, das jeweils ~15 cm der Oberschenkel- und Tibiaregionen der Hinterbeine umfasst. Legen Sie die Probe sofort in eine sterilisierte Probensammelbox und lagern Sie sie bei 4 °C, um sie zur weiteren Verarbeitung ins Labor zu transportieren. Verarbeiten Sie die Proben aseptisch in einer Biosicherheitswerkbank unter Verwendung sterilisierter chirurgischer Instrumente während des gesamten Eingriffs (Abbildung 1, Schritt 1).
  2. Legen Sie die Probe auf eine 150-mm-Petrischale und spülen Sie sie gründlich mit autoklavierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die mit Antibiotika (5 μg/ml Amphotericin B, 200 U/ml Penicillin-Streptomycin und 50 μg/ml Ciprofloxacin) ergänzt ist, um eine Kontamination zu vermeiden. Stellen Sie immer sicher, dass die Probe mit PBS hydratisiert wird.
  3. Untersuchen Sie sorgfältig die anatomischen Regionen der Probe. Um den Zugang zur Gelenkkapsel zu erleichtern, stellen Sie sicher, dass das zusätzliche Gewebe von beiden langen Knochen vollständig entfernt wird (Abbildung 1, Schritt 2).
  4. Um dies zu erreichen, halten Sie zunächst die Stirnfläche des Oberschenkelknochens mit einer Hand fest und schneiden Sie mit einer scharfen Schere längs in Richtung Gelenk. Entfernen Sie während des Prozesses die umgebenden Muskeln und das Fettgewebe aus dem Knochen. Achten Sie darauf, dass das Gewebe, das die unmittelbare Gelenkkapsel umgibt, zunächst ungestört bleibt.
  5. Machen Sie einen weiteren Schnitt am Tibiaende der Probe und entfernen Sie die Muskeln und das Fettgewebe aus dem Tibiaknochen. Stellen Sie sicher, dass beide langen Knochen vollständig freigelegt sind und die Gelenkkapsel nach diesem Schritt deutlich sichtbar ist (Abbildung 1, Schritt 3).
  6. Als nächstes machen Sie einen Schnitt von beiden Seiten der Synoviummembran, um das Gelenk aufzuschneiden (Abbildung 1, Schritt 4). Schneiden Sie die Patella sowohl von der Synoviummembran als auch von den Patellabändern mit einer frischen Charge sterilisierter Schere und Pinzette ab. Bewahren Sie die abgetrennte Patella sofort in einer PBS-haltigen Petrischale auf (Abbildung 1, Schritt 5).
  7. Entfernen Sie das gesamte Fettpolster auf der Innenseite der Kniescheibe mit Schere und Pinzette und sammeln Sie das Fettpolster in einer anderen frischen Petrischale (Abbildung 1, Schritt 6). Zerkleinern Sie das gesammelte Fettpolster mit einem Skalpell. Fügen Sie bei Bedarf andere chirurgische Instrumente (z. B. Scheren oder chirurgische Klingen) hinzu, um möglichst kleine Fettstücke/-segmente von ~2-3 mm zu erhalten.
    HINWEIS: Gutes Zerkleinern ist entscheidend, um eine gute Ausbeute an Zellen zu erzielen. Halten Sie das Gewebe immer hydratisiert und lassen Sie es in keinem Stadium des Isolationsverfahrens trocknen.
  8. Das zerkleinerte Gewebe wird mit einem Spatel in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und mit PBS, ergänzt mit Antibiotika, bei Raumtemperatur (RT) für 15 min in einem Reagenzglasmischer gewaschen. Wiederholen Sie den Waschschritt 3x, jeweils 15 Minuten.
  9. Für die enzymatische Verdauung wird das Hackfleisch (~ 5 g) in Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM low glucose) inkubiert, das 1,5 mg/ml Typ-II-Kollagenase (20 ml) enthält und mit 2% FBS bei 37 °C für 12-16 h ergänzt wird.
    HINWEIS: Führen Sie den Aufschluss in einem Reagenzglasmischer mit ~15 Umdrehungen pro Minute (U/min) durch.
  10. Das verdaute Gewebe wird vorsichtig abgesaugt und durch ein Zellsieb (70 μm) filtriert, um unverdautes Gewebe zu entfernen. Das Filtrat wird in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen bei 150 x g für 5 min zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mindestens 2x mit DMEM-niedriger Glukose.
    HINWEIS: Gießen Sie das verdaute Gewebe langsam in das Sieb, um ein Verschütten zu vermeiden. Verwenden Sie ein Zentrifugenröhrchen mit niedrigem Volumen (15 ml), um ein gutes Pellet zu erhalten.
  11. Resuspendieren Sie das erhaltene Zellpellet in vollständigen DMEM-Medien (DMEM-niedrige Glukose, ergänzt mit 10% FBS und Antibiotika [2,5 μg/ml Amphotericin, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin und 25 μg/ml Ciprofloxacin]), die im Protokoll in den folgenden Schritten als Expansionsmedien bezeichnet werden.
  12. Die Zellen werden auf 150 mm Petrischalen gesät und in den Expansionsmedien kultiviert, die mit 5 ng/ml basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) und 50 μg/mL 2-Phospho-L-Ascorbinsäuretrinatriumsalz ergänzt werden. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator, damit die Zellen anhaften und sich vermehren können. Überwachen Sie täglich die Anheftung und das Wachstum der Zellen.

2. Erhaltung und Expansion isolierter Zellen

  1. Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage, bis die Zellen konfluent werden. Bei jedem Medienwechsel frische 5 ng/ml bFGF und 50 μg/mL 2-Phospho-L-ascorbinsäure-Trinatriumsalz direkt in die Petrischale geben. Nachdem die Zellen zu 80% -90% konfluent geworden sind, subkulturieren Sie die Zellen.
    HINWEIS: Entfernen Sie die nicht haftenden Entitäten bei jedem Medienwechsel. Falls nach 3 Tagen Inkubation Öltröpfchen zu sehen sind, waschen Sie die Zellen mit PBS 1x und geben Sie dann frisches Medium in die Petrischale. Fahren Sie vor jedem Medienwechsel mit der PBS-Wäsche fort, bis die Öltröpfchen vollständig entfernt sind.
  2. Subkulturierung von Zellen: Entfernen Sie die Expansionsmedien aus der Petrischale und waschen Sie die Zellen 1x mit PBS. Geben Sie 4 ml 0,25% Trypsin/EDTA in die Schale und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator für 4 min.
    HINWEIS: Die Konfluenz (80%-90%) wird innerhalb von 7 Tagen erreicht. Verteilen Sie die Trypsin/EDTA-Lösung während der Trypsinisierung gleichmäßig über die gesamte Oberfläche der Petrischale.
  3. Entfernen Sie die Zellen, indem Sie auf die Platte an der Seite klopfen und unter einem Mikroskop beobachten, um zu bestätigen, dass alle Zellen abgelöst sind. Neutralisieren Sie das Trypsin nach Zugabe eines gleichen Volumens (4 ml) Expansionsmedium.
  4. Die dissoziierten Zellen werden mit einer Pipette in einem frischen 15-ml-Polypropylenröhrchen gesammelt und bei 150 x g für 5 min bei RT zentrifugiert.
  5. Zählen Sie die Zellen mit der Standard-Zellzählungsmethode und Subkultur in 150 mm Petrischalen mit einer Aussaatdichte von 1 x 104 Zellen/cm2 für die weitere Expansion. Für alle Assays ist eine konfluierende Monoschicht von Zellen der Passage P2-P5 zu verwenden.
    HINWEIS: Kryokonservieren Sie die überschüssigen Zellen.

3. Bewertung der klonogenen Fähigkeit von IFP-MSCs mittels Koloniebildungstest (CFU-F)

  1. Für den CFU-F-Assay werden die Zellen in Expansionsmedien in einer 6-Well-Gewebekulturplatte mit einer Impfdichte von 50-100 Zellen/cm2 ausgesät. Fügen Sie Medien hinzu, um ein Endvolumen von 3 ml zu erhalten.
    HINWEIS: Optimieren Sie die Zellkonzentration für Assays und Behandlungen.
  2. Die Zellen werden 12 Tage lang bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator unter Standardkulturbedingungen kultiviert, damit die Zellen Kolonien bilden können. Wechseln Sie die Medien alle 3 Tage. Seien Sie vorsichtig beim Wechseln der Medien.
  3. Nach 12 Tagen spülen Sie die Kolonien 1x mit PBS und fixieren Sie sie mit 20% Methanol für 20 min bei RT. Färben Sie die Kolonien mit kristallviolettem Farbstoff (0,5% [w/v] in 20% Methanol) für 20 min bei RT. Zählen Sie die einzelnen Kolonien mit einem inversen Mikroskop.
    HINWEIS: Eine Kolonie ist definiert als ein Cluster von mehr als 50 Zellen.

4. Differenzierungspotenzial von IFP-MSCs

  1. Induktion der adipogenen Differenzierung von IFP-MSCs
    1. Um die Adipogenese zu induzieren, säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 25 x 103 Zellen / cm2 in einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Geben Sie ein Medium hinzu, um ein Endvolumen von 500 μL zu erhalten. Die Zellen werden bei 37 °C in einem 5%igen CO2-Inkubator kultiviert.
    2. Ersetzen Sie das Expansionsmedium einen Tag nach der Konfluenz durch 500 μL adipogene Differenzierungsmedien. Es dauert ungefähr 2 Tage, bis die Zellen Konfluenz erreichen.
    3. Bereiten Sie das adipogene Differenzierungsmedium vor, indem Sie Expansionsmedien (DMEM + 10% FBS + 2,5 μg/ml Amphotericin, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin und 25 μg/ml Ciprofloxacin) mit 25 mM D (+)-Glucose, 10 μg/ml Insulin, 1 μM Dexamethason und 100 μM Indomethacin ergänzen.
      HINWEIS: Differenzierungsmedien sind bei 4 °C nach 1 Monat instabil; Bereiten Sie daher die Medien nach Bedarf vor.
    4. Betrachten Sie die Zellen, die in den Expansionsmedien kultiviert wurden, die mit 25 mM D (+) Glukose ergänzt wurden, als nicht induzierte Kontrollen. Wechseln Sie die Medien alle 3 Tage für 14 Tage. Am Ende der 14 Tage waschen Sie die Zellen 1x mit PBS. Die Zellen werden mit neutralgepuffertem Formalin (NBF; 4 % Formaldehyd in PBS) für 15 min bei 4 °C fixiert.
    5. Nach der Fixierung die Vertiefungen 1x mit destilliertem Wasser waschen und dann die Zellen mit 60% Isopropanol für 5 min bei RT inkubieren. Nach dem Entfernen von Isopropanol färben Sie die Lipidtröpfchen ab, indem Sie die Zellen mit 500 μL der Arbeitslösung des Ölroten O-Farbstoffs für 5 min bei RT inkubieren. Waschen Sie die Vertiefungen 1x mit destilliertem Wasser, um den ungebundenen Farbstoff zu entfernen, und bilden Sie die Zellen mit einem inversen Mikroskop ab.
      HINWEIS: Bereiten Sie die Stammlösung von Oil Red O (ORO) vor, indem Sie 300 mg ORO in 100 ml 99% Isopropanol lösen. Um die Arbeitslösung vorzubereiten, mischen Sie drei Teile Stamm-ORO und zwei Teile destilliertes Wasser und lassen Sie es 10 Minuten lang bei RT mischen. Das Gemisch wird mit 0,2 μm Filterpapier filtriert. Die funktionierende Lösung ist einsatzbereit. Die Stammlösung kann bei RT für 1 Monat im Dunkeln vorbereitet und gelagert werden, während die Arbeitslösung vor jeder Verwendung/Färbung frisch zubereitet werden muss.
  2. Induktion der chondrogenen Differenzierung von IFP-MSCs
    1. Isolierung von Ziegenplasma:
      1. Bereiten Sie 3,4% (w/v) Natriumcitrat in destilliertem Wasser zu. Fügen Sie 5 ml der vorbereiteten Natriumcitratlösung in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen hinzu.
      2. Sammeln Sie 45 ml des frisch isolierten Ziegenblutes im selben Röhrchen. Kippen Sie das Röhrchen sofort, um das Blut gründlich mit Natriumcitrat zu mischen, um eine Gerinnung zu verhindern, und transportieren Sie es bei 4 °C ins Labor.
      3. Das gesammelte Ziegenblut wird bei 1000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert. Den Überstand (Plasma) in ein frisches Röhrchen in einer Biosicherheitswerkbank überführen. Das Plasma wird durch 0,2-μm-Filter filtriert, aliquot und zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.
        HINWEIS: Halten Sie die Temperatur von 2-8 °C während der Handhabung der Proben. Es ist wichtig, die Gefrier-Tau-Zyklen des Plasmas zu minimieren.
    2. Kulturen Sie die expandierten Zellen auf 80%-90% Konfluenz, dissoziieren Sie die Zellen mit Trypsin / EDTA-Lösung und pelletieren Sie die Zellen bei 150 x g für 5 min in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Das Pellet wird in Ziegenplasma mit einer Dichte von 2 x 106 Zellen pro 50 μl Plasmalösung resuspendiert.
    3. Geben Sie einen Tropfen plasmahaltiger Zellen (50 μL) auf eine sterilisierte 90-mm-Petrischale und fügen Sie dann Calciumchlorid in einer Endkonzentration von 0,3% (w/v) hinzu. Gut mischen, um vernetztes Plasma-Hydrogel herzustellen.
    4. Das hergestellte Hydrogel wird bei 37 °C 40 min inkubiert. Nach der Inkubation werden die Hydrogele auf 24-Well-Gewebekulturplatten übertragen, die chondrogene Medien enthalten.
    5. Herstellung von chondrogenen Medien durch Supplementierung von DMEM-niedriger Glukose mit 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 1,25 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 1 mM Prolin, 50 μg/ml 2-Phospho-L-Ascorbinsäuretrinatriumsalz, 100 nM Dexamethason, 1x Insulin, Transferrin, Natriumselenit + Linolsäure-BSA (ITS+1), Antibiotika (2,5 μg/ml Amphotericin, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin und 25 μg/ml Ciprofloxacin), und 10 ng / ml transformierender Wachstumsfaktor β1 (TGF-β1).
    6. Die Hydrogele, die in vollständigen DMEM-Medien (DMEM-niedrige Glukose mit 10% FBS und Antibiotika [2,5 μg/ml Amphotericin, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin und 25 μg/ml Ciprofloxacin]) ohne TGF-β1 kultiviert wurden, gelten als uninduzierte Kontrollen. Wechseln Sie die Medien alle 3 Tage für 14 Tage.
    7. Nach 14 Tagen chondrogener Differenzierung von Zellen in Plasmahydrogelen waschen Sie die Hydrogele mit PBS 3x für jeweils 5 Minuten und fixieren Sie dann die Proben für 3 h in NBF.
      VORSICHT: Formaldehyd ist ein potentielles Karzinogen und kann beim Einatmen Reizungen der Nase, des Rachens und der Lunge verursachen. Führen Sie alle Verfahren im Zusammenhang mit Formaldehyd in einem Abzug durch.
    8. Entfernen Sie NBF, waschen Sie die Hydrogele mit PBS 3x für jeweils 5 Minuten und inkubieren Sie dann über Nacht in 35% (w/v) Saccharose bei RT, damit die Lösung vollständig in die Proben aufgenommen werden kann. Akklimatisieren Sie die Hydrogele in der Masse mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) für 3 h. Betten Sie die Proben unter Verwendung von Silikonformen unter flüssigem Stickstoff in die OCT-Verbindung ein.
    9. Schneiden Sie die Proben in einer Dicke von 10-12 μm auf gelatinebeschichteten Glasobjektträgern mit einem Kryotom und lagern Sie sie bei -20 °C für die zukünftige Verwendung. Um das Vorhandensein oder die Ablagerung der extrazellulären Matrix nach chondrogener Differenzierung zu untersuchen, färben Sie die Abschnitte mit Alcianblau und Safranin-O-Farbstoff, der an sulfatierte Glykosaminoglykane bindet.
      HINWEIS: Zur Herstellung des Farbstoffs Alcianblau wird 1 g Farbstoff Alcianblau in 100 ml 0,1 N HCl aufgelöst und über Nacht gründlich in einem Reagenzglasmischer gemischt. Die Lösung kann bei RT für 1 Monat im Dunkeln gelagert werden. Zur Herstellung des Safranin-O-Farbstoffs werden 0,1 g Safranin-O-Farbstoff in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und über Nacht in einem Reagenzglasmischer gründlich gemischt.
    10. Für die Alcianblau-Färbung die Hydrogel-Abschnitte 1x mit destilliertem Wasser für 5 min waschen. Um die Abschnitte zu fixieren, geben Sie 4% NBF zu den Objektträgern und inkubieren Sie für 30 Minuten.
    11. Die Abschnitte werden 1x mit destilliertem Wasser für 5 min und dann 2x mit 0,1 N HCl für jeweils 30 s gewaschen. Entfernen Sie die HCl und trocknen Sie die Objektträger vorsichtig mit Seidenpapier ab. Den vorbereiteten Alcianblau-Fleck zu den Schnitten geben und 30 min bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer inkubieren.
    12. Waschen Sie den ungebundenen Farbstoff mit 0,1 N HCl und dann destilliertem Wasser für 3 min. Dehydrieren Sie die Abschnitte in absolutem Ethanol, reinigen Sie sie in Xylol und montieren Sie die gefärbten Abschnitte schließlich in einem harzigen Medium für die Bildgebung.
    13. Für die Safranin-O-Färbung waschen Sie die Hydrogel-Abschnitte mit destilliertem Wasser 1x für 5 min. Um die Abschnitte zu fixieren, geben Sie 4% NBF zu den Objektträgern und inkubieren Sie für 30 Minuten. Die Abschnitte 1x mit destilliertem Wasser für 5 min waschen und dann die Objektträger für 10-15 s in 1%ige Essigsäure tauchen. Trocknen Sie die Objektträger vorsichtig mit Seidenpapier ab.
    14. Fügen Sie den vorbereiteten Safranin-O-Farbstoff zu den Abschnitten hinzu und inkubieren Sie für 10 min bei RT. Waschen Sie den ungebundenen Farbstoff mit 100% Ethanol. Tauchen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in 100% Ethanol. Trocknen Sie die Objektträger an der Luft, reinigen Sie sie in Xylol und montieren Sie die gefärbten Abschnitte schließlich in einem harzigen Medium für die Bildgebung.
  3. Induktion osteogener Differenzierung von IFP-MSCs
    1. Um eine osteogene Differenzierung zu induzieren, trypsinisieren Sie die Zellen, wie zuvor beschrieben (Schritt 2.2.). Die Zellen werden mit einer Dichte von 3 x 103 Zellen/cm2 in einer 24-Well-Gewebekulturplatte ausgesät. Geben Sie ein Medium hinzu, um ein Endvolumen von 500 μL zu erhalten. Die Zellen werden bei 37 °C in einem 5%igen CO2-Inkubator kultiviert. 1 Tag nach der Aussaat das Expansionsmedium durch 500 μL osteogenes Differenzierungsmedium ersetzen.
    2. Bereiten Sie die osteogenen Medien vor, indem Sie Expansionsmedien (DMEM + 10% FBS + 2,5 μg/ml Amphotericin, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin und 25 μg/ml Ciprofloxacin) mit 25 mM D (+)-Glucose, 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml 2-Phospho-L-Ascorbinsäure-Trinatriumsalz und 10 nM Vitamin D3 ergänzen.
      ANMERKUNG: Die Zellen, die in Expansionsmedien kultiviert wurden, die mit 25 mM D (+) Glukose angereichert waren, gelten als nicht induzierte Kontrollen.
    3. Wechseln Sie die osteogenen Medien alle 3 Tage für 14 Tage oder 28 Tage. Messen Sie am Ende von 14 Tagen das Ausmaß der Osteogenese durch alkalische Phosphatase (ALP) -Färbung.
      HINWEIS: Um das Substrat für die ALP-Färbung vorzubereiten, lösen Sie eine 5-Brom-4-Chlor-3-indolylphosphat (BCIP)/Nitroblautetrazolium (NBT)-Tablette in 10 ml destilliertem Wasser in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf. Lassen Sie die Tablette vollständig auflösen. Die Substratlösung ist gebrauchsfertig. Da die Substratlösung je nach Bedarf nicht länger gelagert werden kann, brechen Sie die Tablette in zwei Hälften und lösen Sie sie in 5 ml destilliertem Wasser auf. Zur Herstellung des Permeabilisierungspuffers wird Tris-Puffer (100 mM) und Magnesiumchlorid (5 mM) in destilliertes Wasser gegeben. Triton X100 (0,1%) in die Lösung geben und auflösen lassen. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 9,25-9,75 ein.
    4. Für die ALP-Färbung entfernen Sie nach 14 Tagen Induktion das Medium und waschen Sie die Zellen mit PBS. Fixieren Sie die Zellen mit NBF (4%) für 1 Minute. Waschen Sie die Zellen mit PBS und permeat mit dem vorbereiteten Lysepuffer für 2-3 min.
    5. Geben Sie 500 μL der vorbereiteten Substratlösung in die Zellen und lassen Sie sie je nach Expressionsniveau 15 min bis 1 h inkubieren. Überprüfen Sie die Entwicklung der lila / blauen Farbe dazwischen.
    6. Entfernen Sie die Substratlösung und waschen Sie sie mit destilliertem Wasser. Stellen Sie die gefärbten Zellen mit einem inversen Mikroskop dar.
    7. Messen Sie nach 28 Tagen das Ausmaß der Verkalkung nach osteogener Induktion durch Alizarinrot-S-Färbung.
      HINWEIS: Zur Herstellung der Alizarin Red-S Färbelösung (40 mM) werden 2 g Alizarin Red-S in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert mitHCl oder NH4OHauf 4,1-4,3 eingestellt. Die Lösung wird durch eine 0,22 μm Membran filtriert und bei 4 °C im Dunkeln gelagert. Der pH-Wert der Lösung ist wichtig; Daher wird empfohlen, entweder eine frische Lösung herzustellen oder den pH-Wert der Lösung erneut zu messen, wenn sie älter als 1 Monat ist.
    8. Für die Alizarin-Rot-S-Färbung entfernen Sie nach 28 Tagen Induktion das Medium und waschen Sie die Zellen 1x mit kaltem PBS. Die Zellen werden mit 70%igem Ethanol für 1 h bei 4 °C fixiert.
    9. Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen 2x mit destilliertem Wasser. Entfernen Sie das Wasser vollständig und geben Sie 1 ml Alizarin Red-S-Lösung in jede Vertiefung.
    10. Inkubieren Sie die Zellen mit der Lösung für 1 h bei RT und bilden Sie die Zellen mit einem inversen Mikroskop ab.

Ergebnisse

Isolierung von IFP-MSCs aus dem Femorotibialgelenk einer Ziege
Die Schritte bei der Isolierung von IFP-MSCs aus dem Würgegelenk einer Ziege sind in Abbildung 1 dargestellt. Das Fettpolster, das in der inneren nicht artikulierten Oberfläche der Patella vorhanden war, wurde entfernt, zerkleinert und enzymatisch verdaut. Die IFP-MSCs wurden erfolgreich isoliert und in vitro kultiviert (Abbildung 2A).

Diskussion

Im vorliegenden Protokoll wurde eine einfache, zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Isolierung von MSCs aus Ziegen-IFP bereitgestellt. Zellen, die mit dieser Methode isoliert wurden, wurden in unseren früheren Studien erfolgreich zur In-vitro-Geweberegeneration eingesetzt. Es wurde beobachtet, dass die isolierten Zellen proliferativ waren, auf verschiedene Wachstumsfaktoren ansprachen und ihre biologische Aktivität behielten, wenn sie auf elektrogesponnenen Fasern und Gerüsten ausgesät wurden

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Danksagungen

SH bedankt sich für die Unterstützung durch das Postdoktorandenstipendium des Instituts des IIT Kanpur und das SYST-Stipendium der DST (SEED Division) (SP / YO / 618 / 2018). AM dankt dem Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) für ein Institutsstipendium. DSK dankt der Gireesh Jankinath Chair Professur und dem Department of Biotechnology, Indien, für die Finanzierung (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH und DSK danken dem Mehta Family Centre for Engineering in Medicine am IIT-Kanpur für ihre großzügige Unterstützung.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
β-glycerophosphateSigma-AldrichG9422-10G10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTAHi-MediaTCL049
15-mL centrifuge tubeCorning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma49752-10G50 µg/mL
2-PropanolSigma-AldrichI9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)HiMediaTCL021-50ml10 mM
50-mL centrifuge tubeCorning
Alcian BlueHi-MediaRM471For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red SS D Fine-Chem Limited26048-25GFor calcium deposition
Amphotericin BHiMediaA0112.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF)Sino Biologicals10014-HNAE5 ng/mL
BCIP/NBT ALP SubstrateSigmaB5655-5TABFor ALP staining
Biological safety cabinet
BSAHiMediaMB-083Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainerHiMediaTCP-18270 µm
CentrifugeREMI
CiprofloxacinRANBAXY LAB. LimitedB17407T12.5 µg/mL
Crystal VioletS D Fine-Chem Limited42555
D(+)-glucoseMerck1.94925.052125 mM
DexamethasoneSigma-AldrichD29151 µM
DMEM LGSIGMAD5523Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
EthanolMerck100983
FBSGibco10270Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41%Merck61780805001730
IndomethacinSigma-AldrichI7378100 µM
InsulinSigma-AldrichI927810 µg/mL
Inverted microscopeNikon Eclipse TS 100
ITS + 1Sigma-AldrichI2521-5mLLong name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-ProlineHiMediaTO-109-25G1 mM
Magnesium chlorideMerck61751605001730For lysis buffer
MethanolMeck1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)Thermoscientific
MUSE Cell analyserMerck MilliporeFor cell counting
OCT compoundTissue-Tek4583Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dyeS D Fine-Chem Limited54304For lipid vacuole staining
Penicillin-StreptomycinHiMediaA007100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm)NEST
Safranin OS D Fine-Chem Limited50240For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrateSigma-AldrichC34343.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpelsFor isolation of IFP-MSC
SucroseMerck1.94953.052135 % (w/v)
TGF-β1Sino BiologicalsLong name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2Thermoscientific
Tris bufferMerck61771405001730For lysis buffer
Triton X100S D Fine-Chem Limited40632For lysis buffer
Type II collagenaseGibco171010151.5 mg/mL
Vitamin D3SigmaC9756-1G10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP)NEST

Referenzen

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