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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Le cellule staminali mesenchimali infrarotulee (IFP-MSC) possono essere isolate facilmente dal cuscinetto adiposo infrarotuleo dell'articolazione del ginocchio. Proliferano bene in vitro, formano colonie CFU-F e si differenziano in linee adipogeniche, condrogeniche e osteogeniche. Qui viene fornita la metodologia per l'isolamento, l'espansione e la differenziazione delle IFP-MSC dall'articolazione del soffocamento della capra.

Abstract

L'IFP, presente nell'articolazione del ginocchio, funge da fonte promettente di MSC. L'IFP è un tessuto facilmente accessibile in quanto viene regolarmente resecato e scartato durante le procedure artroscopiche e gli interventi chirurgici di sostituzione del ginocchio. Inoltre, la sua rimozione è associata a una morbilità minima del sito donatore. Studi recenti hanno dimostrato che le IFP-MSC non perdono la loro capacità di proliferazione durante l'espansione in vitro e hanno un potenziale di differenziazione osteogenica indipendente dall'età. Le IFP-MSC possiedono un potenziale di differenziazione condrogena superiore rispetto alle MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) e alle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC). Sebbene queste cellule siano facilmente ottenibili da pazienti anziani e malati, la loro efficacia è limitata. Pertanto, l'utilizzo di IFP-MSC da donatori sani è importante per determinare la loro efficacia nelle applicazioni biomediche. Poiché l'accesso a un donatore umano sano è difficile, i modelli animali potrebbero essere un'alternativa migliore per consentire la comprensione fondamentale. Grandi animali come cani, cavalli, pecore e capre svolgono un ruolo cruciale nella ricerca traslazionale. Tra questi, la capra potrebbe essere un modello preferito poiché l'articolazione soffocante della capra ha l'anatomia più vicina all'articolazione del ginocchio umano. Inoltre, l'IFP di capra può soddisfare i numeri MSC più elevati necessari per le applicazioni di rigenerazione dei tessuti. Inoltre, il basso costo, la disponibilità e la conformità ai principi 3R per la ricerca sugli animali li rendono un modello attraente. Questo studio dimostra un semplice protocollo per isolare le IFP-MSC dall'articolazione soffocante delle capre e dalle condizioni di coltura in vitro per la loro espansione e differenziazione. L'IFP asettico isolato dalla capra è stato lavato, tritato e digerito enzimaticamente. Dopo la filtrazione e la centrifugazione, le cellule raccolte sono state coltivate. Queste cellule erano aderenti, avevano una morfologia simile alle MSC e dimostravano una notevole capacità clonogenica. Inoltre, si sono differenziati in linee adipogeniche, condrogeniche e osteogeniche, dimostrando la loro multipotenza. In conclusione, lo studio dimostra l'isolamento e l'espansione delle MSC, che mostrano il potenziale nelle applicazioni di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa.

Introduzione

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono un candidato interessante per le terapie cellulari nella medicina rigenerativa 1,2. Possono essere raccolti da una varietà di fonti tissutali come midollo osseo, cordone ombelicale, placenta, polpa dentale e tessuto adiposo sottocutaneo3. Tuttavia, poiché la disponibilità di cellule staminali negli adulti è limitata e la loro procedura di isolamento è spesso invasiva (con conseguente morbilità del sito donatore), è auspicabile avere una fonte alternativa di cellule staminali che potrebbe aggirare queste sfide.

L'articolazione del ginocchio è un deposito di vari tipi di cellule, come MSC derivate da cuscinetti di grasso infrarotuleo, MSC derivate dalla membrana sinoviale, MSC derivate dal liquido sinoviale, fibroblasti legamentosi, condrociti articolari, ecc 4,5,6. Queste cellule hanno il potenziale per essere ampiamente esplorate nella ricerca basata sull'ingegneria dei tessuti muscoloscheletrici. Pertanto, l'articolazione del ginocchio potrebbe essere una fonte possibile e affidabile di più tipi di MSC. Il deposito adiposo situato nell'articolazione del ginocchio, noto come cuscinetto adiposo infrarotuleo (IFP) o cuscinetto adiposo di Hoffa, è una scelta promettente e alternativa del deposito MSC. L'IFP è una fonte relativamente facilmente accessibile e clinicamente ottenibile di MSC, poiché viene regolarmente resecata e scartata come rifiuto chirurgico durante l'artroscopia del ginocchio o la chirurgia del ginocchio aperto. La rimozione dell'IFP è associata a una morbilità minima del sito donatore, che lo rende anche una fonte di tessuto attraente. Pur avendo un profilo fenotipico simile, le MSC da IFP (IFP-MSCs) hanno un potenziale clonogenico aumentato rispetto alle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BM-MSCs)6 e una migliore capacità proliferativa rispetto alle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo sottocutaneo (ADSC)7. È interessante notare che, rispetto alle MSC derivate dal liquido sinoviale (SF-MSCs), le IFP-MSC non perdono la loro capacità proliferativa nei passaggi tardivi, né il tempo di raddoppio aumenta nei passaggi tardivi. Ciò suggerisce che, durante l'espansione cellulare, le IFP-MSC possono raggiungere un numero sufficientemente elevato di cellule per applicazioni di ingegneria tissutale in vitro senza compromettere il loro tasso di proliferazione8. Studi recenti hanno anche suggerito che le IFP-MSC possiedono un potenziale di differenziazione condrogena superiore rispetto alle MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) e alle MSC derivate dal tessuto adiposo (ADSC), probabilmente a causa della loro vicinanza anatomica alla cartilagine articolare, indicando la loro idoneità per l'ingegneria del tessuto cartilagineo 6,7,9,10. Inoltre, possiedono anche un potenziale di differenziazione osteogenica indipendente dall'età11. È stato dimostrato che l'iniezione intra-articolare di IFP-MSCs riduce il dolore e migliora le funzioni articolari del ginocchio nei pazienti con osteoartrite (OA)12,13. Inoltre, sono state riportate anche forti risposte immunosoppressive e migliori proprietà immunomodulatorie delle IFP-MSCs in presenza di citochine infiammatorie durante condizioni patologiche6.

Le IFP-MSC sono una fonte promettente e alternativa di MSC; Tuttavia, il loro beneficio terapeutico nell'ingegneria tissutale e nella medicina rigenerativa è relativamente meno esplorato. Gli studi esistenti sulle IFP-MSC hanno utilizzato principalmente cellule provenienti da donatori umani. Tra questi, alcuni studi recenti hanno indagato IFP-MSC da donatori umani sani (pazienti non artritici, di età compresa tra 17 e 60 anni)6,14, mentre la maggior parte degli studi ha utilizzato IFP-MSC di pazienti anziani sottoposti a chirurgia sostitutiva totale del ginocchio (pazienti malati, età 70-80 anni). Poiché sia l'età che la malattia sono note per alterare il normale funzionamento delle cellule staminali (numero ridotto e perdita di potenziale funzionale), ciò potrebbe potenzialmente portare a incongruenze nei risultati degli studi basati su MSC 7,15,16,17. Inoltre, l'uso di IFP-MSCs da pazienti con condizioni fisiopatologiche (ad esempio, artrite e obesità) pone anche difficoltà per la comprensione delle caratteristiche di base delle cellule sane in vitro, agendo così come fattore limitante nello sviluppo di terapie basate su MSC. Per superare questi problemi, l'uso di IFP-MSC da donatori sani è vitale. Poiché l'accesso a un donatore umano sano è impegnativo, i modelli animali potrebbero essere un'alternativa migliore. A questo proposito, ci sono alcuni studi in cui IFP è stato isolato dai topi18. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni del cuscinetto adiposo nei topi normali, i tessuti grassi di più animali sono stati combinati per ottenere abbastanza tessuto per eseguire elaborate procedure sperimentali19. Quindi, c'è bisogno di un modello animale di grandi dimensioni, che potrebbe soddisfare il requisito per il maggior numero di cellule e contemporaneamente rispettare i principi 3R (perfezionare, sostituire e ridurre) nella ricerca sugli animali20. L'uso di grandi animali ha implicazioni significative nella ricerca traslazionale. In particolare, nell'ingegneria dei tessuti muscoloscheletrici, è stata studiata una serie di animali di grandi dimensioni come cani, maiali, pecore, capre e cavalli21. La capra (Capra aegagrus hircus) è un'ottima scelta di animali di grandi dimensioni poiché la sua articolazione soffocante ha l'anatomia più vicina all'articolazione del ginocchio umano22,23,24. La struttura trabecolare ossea subcondrale e lo spessore osseo subcondrale delle capre sono simili a quelli degli esseri umani, e la proporzione della cartilagine rispetto all'osso è anche segnalata per essere vicina agli esseri umani21. Inoltre, le capre sono state ampiamente addomesticate in tutto il mondo, rendendole facilmente disponibili quando sono scheletricamente mature. Inoltre, i bassi costi di manutenzione e la facilità d'uso li hanno resi un modello animale attraente per la ricerca22.

Nel presente studio viene dimostrato un semplice protocollo per l'isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione soffocante di Capra aegagrus hircus (capra) e le condizioni di coltura in vitro per la loro espansione e differenziazione. Le cellule isolate sono aderenti, hanno morfologia simile alle MSC, formano colonie CFU-F (unità formanti colonie-fibroblasti) e possiedono un potenziale di differenziazione adipogenico, condrogeno e ostegenico. Pertanto, le IFP-MSC mostrano il potenziale come fonte alternativa di MSC per applicazioni biomediche.

Protocollo

Il protocollo si basa sull'isolamento delle IFP-MSC dalle capre. Capra IFP e sangue sono stati raccolti da un mattatoio locale. Poiché tali collezioni di tessuti sono al di fuori della competenza di un comitato etico istituzionale per gli animali, non era richiesta l'approvazione etica.

1. Isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione femorotibiale del ginocchio di capra

  1. Raccogliere l'articolazione femorotibiale della capra (campione) che comprende ~ 15 cm ciascuna delle regioni femorali e tibiali degli arti posteriori. Posizionare immediatamente il campione in una scatola di raccolta del campione sterilizzata e conservarlo a 4 °C per il trasporto al laboratorio per ulteriori elaborazioni. Elaborare i campioni in modo asettico in un armadio di biosicurezza, utilizzando strumenti chirurgici sterilizzati durante tutta la procedura (Figura 1, Fase 1).
  2. Posizionare il campione su una capsula di Petri da 150 mm e sciacquarlo abbondantemente con soluzione salina tamponata con fosfato autoclavata (PBS) integrata con antibiotici (5 μg/mL di amfotericina B, 200 U/mL di penicillina-streptomicina e 50 μg/mL di ciprofloxacina) per evitare la contaminazione. Assicurarsi sempre che il campione sia mantenuto idratato utilizzando PBS.
  3. Esaminare attentamente le regioni anatomiche del campione. Per facilitare l'accesso alla capsula articolare, assicurarsi che i tessuti extra da entrambe le ossa lunghe siano completamente rimossi (Figura 1, Fase 2).
  4. Per ottenere ciò, in primo luogo, tenere la superficie terminale dell'osso del femore con una mano e, con forbici affilate, tagliare longitudinalmente verso l'articolazione. Rimuovere i muscoli circostanti e il tessuto adiposo dall'osso durante il processo. Fare attenzione che il tessuto che circonda la capsula articolare immediata rimanga inizialmente indisturbato.
  5. Allo stesso modo, fare un'altra incisione all'estremità tibiale del campione e rimuovere i muscoli e il tessuto adiposo dall'osso tibiale. Assicurarsi che entrambe le ossa lunghe siano completamente esposte e che la capsula articolare sia chiaramente visibile dopo questo passaggio (Figura 1, Fase 3).
  6. Quindi, praticare un'incisione da entrambi i lati della membrana sinoviale per tagliare l'articolazione articolare (Figura 1, Fase 4). Tagliare la rotula sia dalla membrana sinovivia che dai legamenti rotulei usando un nuovo lotto di forbici e pinze sterilizzate. Conservare immediatamente la rotula separata in una capsula di Petri contenente PBS (Figura 1, Passo 5).
  7. Rimuovere l'intero cuscinetto adiposo presente sulla superficie interna della rotula usando forbici e pinze e raccogliere il cuscinetto adiposo in un'altra capsula di Petri fresca (Figura 1, Passo 6). Tritare il cuscinetto di grasso raccolto usando un bisturi. Includere altri strumenti chirurgici (ad esempio, forbici o lame chirurgiche) come richiesto per ottenere i pezzi / segmenti di grasso più piccoli possibili di ~ 2-3 mm.
    NOTA: Una buona macinazione è fondamentale per ottenere una buona resa di cellule. Mantenere sempre il tessuto idratato e non lasciarlo asciugare in nessuna fase della procedura di isolamento.
  8. Trasferire il tessuto tritato utilizzando una spatola in una provetta da centrifuga da 50 ml e lavarlo con PBS integrato con antibiotici a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti in un miscelatore per provetta. Ripetere la fase di lavaggio 3 volte, 15 minuti ciascuna.
  9. Per la digestione enzimatica, incubare il tessuto tritato (~5 g) nel terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM a basso glucosio) contenente 1,5 mg/ml di collagenasi di tipo II (20 ml) e integrato con FBS al 2% a 37 °C per 12-16 ore.
    NOTA: Eseguire la digestione in un miscelatore per provette a ~ 15 rotazioni al minuto (RPM).
  10. Aspirare con cura il tessuto digerito e filtrarlo attraverso un filtro cellulare (70 μm) per rimuovere qualsiasi tessuto non digerito. Centrifugare il filtrato in una provetta da 15 mL a 150 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con DMEM a basso contenuto di glucosio almeno 2x.
    NOTA: Versare lentamente il tessuto digerito nel filtro per evitare fuoriuscite. Utilizzare un tubo da centrifuga a basso volume (15 ml) per ottenere un buon pellet.
  11. Risospendere il pellet cellulare ottenuto in mezzi DMEM completi (DMEM a basso glucosio integrato con 10% FBS e antibiotici [2,5 μg / mL amfotericina, 100 U / mL penicillina-streptomicina e 25 μg / mL ciprofloxacina]), indicato come mezzo di espansione nel protocollo nelle fasi successive.
  12. Seminare le cellule su piastre di Petri da 150 mm e coltivarle nel mezzo di espansione integrato con 5 ng / mL fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) e 50 μg / mL di sale trisodico dell'acido 2-fosfo-L-ascorbico. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per consentire alle cellule di aderire e proliferare. Monitorare l'attaccamento e la crescita delle cellule su base giornaliera.

2. Mantenimento ed espansione delle cellule isolate

  1. Cambiare il mezzo ogni 3 giorni fino a quando le cellule diventano confluenti. Aggiungere sale trisodico fresco 5 ng/mL bFGF e 50 μg/mL di acido 2-fosfo-L-ascorbico direttamente nella capsula di Petri ogni volta che il mezzo viene cambiato. Dopo che le cellule diventano confluenti all'80% -90%, sottocolture le cellule.
    NOTA: rimuovere le entità non aderenti durante ogni modifica del supporto. Nel caso in cui si vedano goccioline di olio dopo 3 giorni di incubazione, lavare le cellule con PBS 1x e quindi aggiungere nuovi mezzi alla capsula di Petri. Continuare con il lavaggio PBS prima di ogni cambio di fluido fino a completa rimozione delle goccioline d'olio.
  2. Sub-coltura delle cellule: rimuovere il mezzo di espansione dalla piastra di Petri e lavare le cellule 1x con PBS. Aggiungere 4 ml di tripsina/EDTA allo 0,25% al piatto e incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per 4 minuti.
    NOTA: Confluency (80%-90%) viene raggiunto entro 7 giorni. Distribuire uniformemente la soluzione di tripsina/EDTA su tutta la superficie della capsula di Petri durante la tripsinizzazione.
  3. Rimuovere le cellule toccando la piastra sul lato e osservando al microscopio per confermare che tutte le cellule sono staccate. Neutralizzare la tripsina dopo aver aggiunto un volume uguale (4 ml) di mezzo di espansione.
  4. Raccogliere le cellule dissociate utilizzando una pipetta in un tubo di polipropilene fresco da 15 mL e centrifugare a 150 x g per 5 minuti a RT. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet nel volume desiderato di mezzi di espansione.
  5. Contare le cellule utilizzando il metodo standard di conteggio delle cellule e la sottocoltura in piastre di Petri da 150 mm ad una densità di semina di 1 x 104 celle/cm2 per un'ulteriore espansione. Per tutti i test, utilizzare un monostrato confluente di celle di passaggio numero P2-P5.
    NOTA: Crioconservare le cellule in eccesso.

3. Valutazione della capacità clonogenica di IFP-MSCs mediante il saggio formante colonie (CFU-F)

  1. Per il test CFU-F, seminare le cellule in mezzi di espansione in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti ad una densità di semina di 50-100 cellule / cm2. Aggiungere il supporto per ottenere un volume finale di 3 ml.
    NOTA: Ottimizzare la concentrazione cellulare per saggi e trattamenti.
  2. Coltivare le cellule per 12 giorni a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 in condizioni di coltura standard per consentire alle cellule di formare colonie. Cambiare il supporto ogni 3 giorni. Sii gentile mentre cambi i media.
  3. Dopo 12 giorni, sciacquare le colonie 1x con PBS e fissarle usando il 20% di metanolo per 20 minuti a RT. Colorare le colonie con colorante viola cristallino (0,5% [w / v] in 20% di metanolo) per 20 minuti a RT. Contare le singole colonie usando un microscopio invertito.
    NOTA: una colonia è definita come un gruppo di più di 50 cellule.

4. Potenziale di differenziazione delle IFP-MSC

  1. Indurre il differenziamento adipogenico delle IFP-MSC
    1. Per indurre l'adipogenesi, seminare le cellule ad una densità di 25 x 103 cellule/cm2 in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Aggiungere il mezzo per ottenere un volume finale di 500 μL. Coltivare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
    2. Un giorno dopo la confluenza, sostituire il mezzo di espansione con 500 μL di terreno di differenziazione adipogenica. Richiede circa 2 giorni affinché le cellule raggiungano la confluenza.
    3. Preparare i terreni di differenziazione adipogenica integrando i mezzi di espansione (DMEM + 10% FBS + 2,5 μg/mL di amfotericina, 100 U/mL di penicillina-streptomicina e 25 μg/mL di ciprofloxacina) con 25 mM di D (+)-glucosio, 10 μg/mL di insulina, 1 μM di desametasone e 100 μM di indometacina.
      NOTA: Il mezzo di differenziazione è instabile a 4 °C dopo 1 mese; Quindi, preparare i supporti come e quando richiesto.
    4. Considerare le cellule coltivate nel mezzo di espansione integrato con 25 mM D (+) glucosio come controlli non indotti. Cambiare il supporto ogni 3 giorni per 14 giorni. Alla fine dei 14 giorni, lavare le celle 1x con PBS. Fissare le cellule usando formalina tamponata neutra (NBF; 4 % formaldeide in PBS) per 15 minuti a 4 °C.
    5. Dopo la fissazione, lavare i pozzetti 1x con acqua distillata e quindi incubare le cellule con isopropanolo al 60% per 5 minuti a RT. Dopo aver rimosso l'isopropanolo, colorare le goccioline lipidiche incubando le cellule con 500 μL della soluzione di lavoro del colorante Oil Red O per 5 minuti a RT. Lavare i pozzetti 1x con acqua distillata per rimuovere il colorante non legato e visualizzare le cellule usando un microscopio invertito.
      NOTA: Preparare la soluzione madre di Oil Red O (ORO) sciogliendo 300 mg di ORO in 100 mL di isopropanolo al 99%. Per preparare la soluzione di lavoro, mescolare tre parti di brodo ORO e due parti di acqua distillata e lasciare miscelare a RT per 10 minuti. Filtrare la miscela con carta da filtro da 0,2 μm. La soluzione di lavoro è pronta all'uso. La soluzione madre può essere preparata e conservata presso RT per 1 mese al buio, mentre la soluzione di lavoro deve essere preparata al momento prima di ogni utilizzo/colorazione.
  2. Indurre la differenziazione condrogena delle MSC IFP
    1. Isolamento del plasma di capra:
      1. Preparare il 3,4% (p/v) di sodio-citrato in acqua distillata. Aggiungere 5 mL della soluzione di citrato di sodio preparata in una provetta da centrifuga da 50 ml.
      2. Raccogliere 45 ml di sangue di capra appena isolato nello stesso tubo. Inclinare immediatamente il tubo per mescolare accuratamente il sangue con citrato di sodio per evitare la coagulazione e trasportarlo in laboratorio a 4 °C.
      3. Centrifugare il sangue di capra raccolto a 1000 x g per 20 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante (plasma) in un tubo fresco all'interno di un armadio di biosicurezza. Filtrare il plasma attraverso filtri da 0,2 μm, aliquote, e conservare a -20 °C per un ulteriore utilizzo.
        NOTA: Mantenere la temperatura di 2-8 °C durante la manipolazione dei campioni. È importante ridurre al minimo i cicli di congelamento-scongelamento del plasma.
    2. Coltivare le cellule espanse fino alla confluenza dell'80%-90%, dissociare le cellule usando la soluzione di tripsina/EDTA e pellettare le cellule a 150 x g per 5 minuti in una provetta da centrifuga da 15 ml. Risospendere il pellet nel plasma di capra ad una densità di 2 x 106 cellule per 50 μL di soluzione plasmatica.
    3. Aggiungere una goccia di cellule contenenti plasma (50 μL) su una capsula di Petri sterilizzata da 90 mm e quindi aggiungere cloruro di calcio ad una concentrazione finale dello 0,3% (p/v). Mescolare bene per fabbricare idrogel di plasma reticolato.
    4. Incubare l'idrogel fabbricato a 37 °C per 40 minuti. Dopo l'incubazione, trasferire gli idrogel in piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti contenenti mezzi condrogeni.
    5. Preparare i mezzi condrogenici integrando DMEM a basso glucosio con 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES), 1,25 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA), 1 mM di prolina, 50 μg/mL di sale trisodico dell'acido 2-fosfo-L-ascorbico, 100 nM desametasone, 1x insulina, transferrina, selenito di sodio + linoleic-BSA (ITS+1), antibiotici (2,5 μg/mL di amfotericina, 100 U/mL di penicillina-streptomicina e 25 μg/mL di ciprofloxacina), e 10 ng/mL fattore di crescita trasformante- β1 (TGF-β1).
    6. Gli idrogel coltivati in mezzi DMEM completi (DMEM basso glucosio con 10% FBS e antibiotici [2,5 μg / mL amfotericina, 100 U / mL penicillina-streptomicina e 25 μg / mL ciprofloxacina]) senza TGF-β1 sono considerati controlli non indotti. Cambiare il supporto ogni 3 giorni per 14 giorni.
    7. Dopo 14 giorni di differenziazione condrogena delle cellule negli idrogel plasmatici, lavare gli idrogel con PBS 3x per 5 minuti ciascuno e quindi fissare i campioni in NBF per 3 ore.
      ATTENZIONE: La formaldeide è un potenziale cancerogeno e può causare irritazione al naso, alla gola e ai polmoni per inalazione. Eseguire tutte le procedure relative alla formaldeide in una cappa aspirante.
    8. Rimuovere NBF, lavare gli idrogel con PBS 3x per 5 minuti ciascuno, quindi incubare in saccarosio al 35% (p/v) a RT durante la notte per consentire alla soluzione di essere completamente assorbita nei campioni. Acclimatare gli idrogel in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) per 3 ore. Incorporare i campioni nel composto OCT utilizzando stampi in silicone sotto azoto liquido.
    9. Tagliare i campioni ad uno spessore di 10-12 μm su vetrini rivestiti di gelatina utilizzando una criotome e conservarli a -20 °C per un uso futuro. Per esaminare la presenza o la deposizione della matrice extracellulare dopo differenziazione condrogena, colorare le sezioni con blu di Alcian e colorante Safranin-O, che si legano ai glicosaminoglicani solfatati.
      NOTA: Per preparare il colorante Alcian Blue, sciogliere 1 g di colorante Alcian Blue in 100 mL di 0,1 N HCl e mescolare accuratamente in un miscelatore per provette durante la notte. La soluzione può essere conservata presso RT per 1 mese al buio. Per preparare il colorante Safranin-O, sciogliere 0,1 g di colorante Safranin-O in 100 ml di acqua distillata e mescolare accuratamente in un miscelatore per provette durante la notte.
    10. Per la colorazione Alcian Blue, lavare le sezioni di idrogel 1x con acqua distillata per 5 min. Per sistemare le sezioni, aggiungere il 4% di NBF alle diapositive e incubare per 30 minuti.
    11. Lavare le sezioni 1x con acqua distillata per 5 minuti e poi 2x con 0,1 N HCl per 30 s ciascuna. Rimuovere l'HCl e asciugare delicatamente i vetrini con carta velina. Aggiungere la colorazione Alcian Blue preparata alle sezioni e incubare per 30 minuti a 37 °C in una camera umidificata.
    12. Lavare il colorante non legato con 0,1 N HCl e quindi distillare acqua per 3 minuti. Disidratare le sezioni in etanolo assoluto, eliminarle in xilene e infine montare le sezioni colorate in un mezzo resinoso per l'imaging.
    13. Per la colorazione Safranin-O, lavare le sezioni di idrogel con acqua distillata 1x per 5 min. Per sistemare le sezioni, aggiungere il 4% di NBF alle diapositive e incubare per 30 minuti. Lavare le sezioni 1x con acqua distillata per 5 minuti, quindi immergere i vetrini in acido acetico all'1% per 10-15 s. Asciugare delicatamente i vetrini con carta velina.
    14. Aggiungere il colorante Safranin-O preparato alle sezioni e incubare per 10 minuti a RT. Lavare il colorante non legato con etanolo al 100%. Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 5 minuti. Asciugare all'aria i vetrini, pulirli in xilene e infine montare le sezioni colorate in un mezzo resinoso per l'imaging.
  3. Indurre la differenziazione osteogenica delle MSC IFP
    1. Per indurre la differenziazione osteogenica, tripsinizzare le cellule, come affermato in precedenza (Passo 2.2.). Seminare le cellule ad una densità di 3 x 103 cellule/cm2 in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Aggiungere il mezzo per ottenere un volume finale di 500 μL. Coltivare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 . 1 giorno dopo la semina, sostituire il mezzo di espansione con un mezzo di differenziazione osteogenica da 500 μL.
    2. Preparare il terreno osteogenico integrando i mezzi di espansione (DMEM + 10% FBS +2,5 μg/mL di amfotericina, 100 U/mL di penicillina-streptomicina e 25 μg/mL di ciprofloxacina) con 25 mM di D (+)-glucosio, 10 nM di desametasone, 10 mM di β-glicerofosfato, 50 μg/mL di sale trisodico dell'acido 2-fosfo-L-ascorbico e 10 nM di vitamina D3.
      NOTA: Le cellule coltivate in mezzi di espansione integrati con 25 mM di glucosio D (+) sono considerati controlli non indotti.
    3. Cambiare il mezzo osteogenico ogni 3 giorni per 14 giorni o 28 giorni. Alla fine di 14 giorni, misurare l'entità dell'osteogenesi mediante colorazione con fosfatasi alcalina (ALP).
      NOTA: Per preparare il substrato per la colorazione ALP, sciogliere una compressa di 5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil Fosfato (BCIP)/Nitroblue Tetrazolium (NBT) in 10 mL di acqua distillata in una provetta da centrifuga da 15 ml. Lasciare che la compressa si dissolva completamente. La soluzione di substrato è pronta all'uso. Poiché la soluzione di substrato non può essere conservata per una durata più lunga, in base alle necessità, rompere la compressa a metà e scioglierla in 5 ml di acqua distillata. Per preparare il tampone di permeabilizzazione, aggiungere tampone Tris (100 mM) e cloruro di magnesio (5 mM) all'acqua distillata. Aggiungere Triton X100 (0,1%) alla soluzione e lasciarla sciogliere. Regolare il pH della soluzione a 9,25-9,75.
    4. Per la colorazione ALP, dopo 14 giorni di induzione, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con PBS. Fissare le celle usando NBF (4%) per 1 min. Lavare le cellule con PBS e permeare usando il tampone di lisi preparato per 2-3 minuti.
    5. Aggiungere 500 μL della soluzione di substrato preparata alle cellule e lasciarla incubare per 15 minuti a 1 ora, a seconda del livello di espressione. Controlla lo sviluppo del colore viola / blu in mezzo.
    6. Rimuovere la soluzione di substrato e lavare con acqua distillata. Immagina le cellule colorate usando un microscopio invertito.
    7. Alla fine di 28 giorni, misurare l'entità della calcificazione dopo l'induzione osteogenica mediante colorazione Alizarin Red-S.
      NOTA: Per preparare la soluzione colorante Alizarin Red-S (40 mM), sciogliere 2 g di Alizarin Red-S in 100 mL di acqua distillata e regolare il pH a 4,1-4,3 con HCl o NH4OH. Filtrare la soluzione attraverso una membrana da 0,22 μm e conservare a 4 °C al buio. Il pH della soluzione è importante; quindi si raccomanda di fare una soluzione fresca o di rimisurare il pH della soluzione se ha più di 1 mese.
    8. Per la colorazione di Alizarin Red-S, dopo 28 giorni di induzione, rimuovere il mezzo e lavare le cellule 1x con PBS freddo. Fissare le celle utilizzando etanolo al 70% per 1 ora a 4 °C.
    9. Rimuovere il fissativo e lavare le celle 2 volte con acqua distillata. Rimuovere completamente l'acqua e aggiungere 1 ml di soluzione di Alizarin Red-S a ciascun pozzetto.
    10. Incubare le cellule con la soluzione per 1 ora a RT e visualizzare le cellule utilizzando un microscopio invertito.

Risultati

Isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione femorotibiale della capra
Le fasi coinvolte nell'isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione soffocante di una capra sono illustrate nella Figura 1. Il cuscinetto adiposo presente nella superficie interna non articolata della rotula è stato rimosso, tritato e digerito enzimaticamente. Le IFP-MSC sono state isolate e coltivate con successo in vitro (Figura 2A).

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Discussione

Nel presente protocollo è stato fornito un metodo semplice, affidabile e riproducibile per l'isolamento delle MSC dall'IFP caprino. Le cellule isolate con questo metodo sono state utilizzate con successo nei nostri precedenti studi per la rigenerazione tissutale in vitro. È stato osservato che le cellule isolate erano proliferative, rispondevano a vari fattori di crescita e conservavano la loro attività biologica quando seminate su fibre elettrofilate e scaffold25,26

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Riconoscimenti

SH riconosce il supporto dell'Institute Post-Doctoral Fellowship di IIT Kanpur e la sovvenzione SYST di DST (SEED Division) (SP / YO / 618 / 2018). AM riconosce l'Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) per una borsa di studio dell'Istituto. DSK riconosce Gireesh Jankinath Chair Professorship e Department of Biotechnology, India, per il finanziamento (BT / PR22445 / MED / 32/571 / 2016). AM, SH e DSK ringraziano il Mehta Family Centre for Engineering in Medicine di IIT-Kanpur per il loro generoso supporto.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
β-glycerophosphateSigma-AldrichG9422-10G10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTAHi-MediaTCL049
15-mL centrifuge tubeCorning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma49752-10G50 µg/mL
2-PropanolSigma-AldrichI9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)HiMediaTCL021-50ml10 mM
50-mL centrifuge tubeCorning
Alcian BlueHi-MediaRM471For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red SS D Fine-Chem Limited26048-25GFor calcium deposition
Amphotericin BHiMediaA0112.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF)Sino Biologicals10014-HNAE5 ng/mL
BCIP/NBT ALP SubstrateSigmaB5655-5TABFor ALP staining
Biological safety cabinet
BSAHiMediaMB-083Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainerHiMediaTCP-18270 µm
CentrifugeREMI
CiprofloxacinRANBAXY LAB. LimitedB17407T12.5 µg/mL
Crystal VioletS D Fine-Chem Limited42555
D(+)-glucoseMerck1.94925.052125 mM
DexamethasoneSigma-AldrichD29151 µM
DMEM LGSIGMAD5523Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
EthanolMerck100983
FBSGibco10270Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41%Merck61780805001730
IndomethacinSigma-AldrichI7378100 µM
InsulinSigma-AldrichI927810 µg/mL
Inverted microscopeNikon Eclipse TS 100
ITS + 1Sigma-AldrichI2521-5mLLong name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-ProlineHiMediaTO-109-25G1 mM
Magnesium chlorideMerck61751605001730For lysis buffer
MethanolMeck1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)Thermoscientific
MUSE Cell analyserMerck MilliporeFor cell counting
OCT compoundTissue-Tek4583Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dyeS D Fine-Chem Limited54304For lipid vacuole staining
Penicillin-StreptomycinHiMediaA007100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm)NEST
Safranin OS D Fine-Chem Limited50240For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrateSigma-AldrichC34343.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpelsFor isolation of IFP-MSC
SucroseMerck1.94953.052135 % (w/v)
TGF-β1Sino BiologicalsLong name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2Thermoscientific
Tris bufferMerck61771405001730For lysis buffer
Triton X100S D Fine-Chem Limited40632For lysis buffer
Type II collagenaseGibco171010151.5 mg/mL
Vitamin D3SigmaC9756-1G10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP)NEST

Riferimenti

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