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Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses du coussinet adipeux infrapatellaire (IFP-MSC) peuvent être isolées facilement du coussinet adipeux infrapatellaire de l’articulation du genou. Ils prolifèrent bien in vitro, forment des colonies CFU-F et se différencient en lignées adipogènes, chondrogènes et ostéogéniques. La méthodologie d’isolement, d’expansion et de différenciation des IFP-MSC par rapport à l’articulation d’étouffement de chèvre est fournie.

Résumé

L’IFP, présent dans l’articulation du genou, est une source prometteuse de CSM. L’IFP est un tissu facilement accessible car il est régulièrement réséqué et jeté lors de procédures arthroscopiques et de chirurgies de remplacement du genou. De plus, son élimination est associée à une morbidité minimale du site donneur. Des études récentes ont démontré que les IFP-MSC ne perdent pas leur capacité de prolifération lors de l’expansion in vitro et ont un potentiel de différenciation ostéogénique indépendant de l’âge. Les IFP-MSC possèdent un potentiel de différenciation chondrogénique supérieur à celui des CSM dérivées de la moelle osseuse (BMSC) et des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC). Bien que ces cellules soient facilement accessibles chez les patients âgés et malades, leur efficacité est limitée. Par conséquent, l’utilisation d’IFP-MSC provenant de donneurs sains est importante pour déterminer leur efficacité dans des applications biomédicales. Comme l’accès à un donneur humain en bonne santé est difficile, les modèles animaux pourraient être une meilleure alternative pour permettre une compréhension fondamentale. Les grands animaux tels que les chiens, les chevaux, les moutons et les chèvres jouent un rôle crucial dans la recherche translationnelle. Parmi ceux-ci, la chèvre pourrait être un modèle préféré puisque l’articulation étouffante de la chèvre a l’anatomie la plus proche de l’articulation du genou humain. De plus, l’IFP caprin peut atteindre les valeurs MSC plus élevées nécessaires pour les applications de régénération tissulaire. De plus, le faible coût, la disponibilité et le respect des principes 3R pour la recherche animale en font un modèle attrayant. Cette étude démontre un protocole simple pour isoler les IFP-MSC de l’articulation étouffante des chèvres et les conditions de culture in vitro pour leur expansion et leur différenciation. L’IFP isolé de manière aseptique de la chèvre a été lavé, haché et digéré par voie enzymatique. Après filtration et centrifugation, les cellules collectées ont été cultivées. Ces cellules étaient adhérentes, avaient une morphologie semblable à celle des CSM et présentaient une capacité clonogène remarquable. En outre, ils se sont différenciés en lignées adipogènes, chondrogènes et ostéogéniques, démontrant leur multipotence. En conclusion, l’étude démontre l’isolement et l’expansion des CSM, qui présentent un potentiel dans les applications d’ingénierie tissulaire et de médecine régénérative.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont un candidat intéressant pour les thérapies cellulaires en médecine régénérative 1,2. Ils peuvent être récoltés à partir d’une variété de sources tissulaires telles que la moelle osseuse, le cordon ombilical, le placenta, la pulpe dentaire et le tissu adipeux sous-cutané3. Cependant, comme la disponibilité des cellules souches chez les adultes est limitée et que leur procédure d’isolement est souvent invasive (entraînant une morbidité au site donneur), il est souhaitable de disposer d’une autre source de cellules souches qui pourrait contourner ces défis.

L’articulation du genou est un dépôt de divers types de cellules, tels que les CSM dérivés du coussinet adipeux infrapatellar, les CSM dérivés de la membrane synoviale, les CSM dérivés du liquide synovial, les fibroblastes ligamentaires, les chondrocytes articulaires, etc. 4,5,6. Ces cellules ont le potentiel d’être largement explorées dans la recherche basée sur le génie tissulaire musculo-squelettique. Par conséquent, l’articulation du genou pourrait être une source possible et fiable de plusieurs types de CSM. Le dépôt adipeux situé dans l’articulation du genou, connu sous le nom de coussinet adipeux infrapatellaire (IFP) ou coussinet adipeux de Hoffa, est un choix prometteur et alternatif de dépôt MSC. L’IFP est une source relativement facilement accessible et cliniquement accessible de CSM, car il est régulièrement réséqué et jeté sous forme de déchets chirurgicaux lors d’une arthroscopie du genou ou d’une chirurgie ouverte du genou. L’élimination de l’IFP est associée à une morbidité minimale du site donneur, ce qui en fait également une source tissulaire attrayante. Tout en ayant un profil phénotypique similaire, les CSM de l’IFP (IFP-MSC) ont un potentiel clonogène accru par rapport aux cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BM-MSCs)6 et une meilleure capacité de prolifération par rapport aux cellules souches sous-cutanées dérivées du tissu adipeux (ADSC)7. Il est intéressant de noter que, par rapport aux CSM dérivées du liquide synovial (SF-MSC), les IFP-MSC ne perdent pas leur capacité de prolifération aux passages tardifs, pas plus que le temps de doublement n’augmente aux passages tardifs. Cela suggère que, pendant l’expansion cellulaire, les IFP-MSC peuvent atteindre un nombre suffisamment important de cellules pour des applications d’ingénierie tissulaire in vitro sans compromettre leur taux de prolifération8. Des études récentes ont également suggéré que les IFP-MSC possèdent un potentiel de différenciation chondrogénique supérieur à celui des CSM dérivées de la moelle osseuse (BMSC) et des CSM dérivées du tissu adipeux (ADSC), probablement en raison de leur proximité anatomique avec le cartilage articulaire, ce qui indique leur aptitude à l’ingénierie tissulaire du cartilage 6,7,9,10. De plus, ils possèdent également un potentiel de différenciation ostéogénique indépendant de l’âge11. Il a été démontré que l’injection intra-articulaire d’IFP-MSCs réduit la douleur et améliore les fonctions articulaires du genou chez les patients atteints d’arthrose12,13. En outre, de fortes réponses immunosuppressives et une amélioration des propriétés immunomodulatrices des IFP-MSC en présence de cytokines inflammatoires dans des conditions pathologiques ont également été rapportées6.

Les IFP-MSC sont une source alternative prometteuse de MSC; Cependant, leur bénéfice thérapeutique en génie tissulaire et en médecine régénérative est relativement moins exploré. Les études existantes sur les IFP-MSC ont principalement utilisé des cellules provenant de donneurs humains. Parmi celles-ci, quelques études récentes ont examiné les IFP-MSC de donneurs humains sains (patients non arthritiques, âgés de 17 à 60 ans)6,14, tandis que la plupart des études ont utilisé des IFP-MSC de patients âgés subissant une arthroplastie totale du genou (patients malades, âgés de 70 à 80 ans). Comme on sait que l’âge et la maladie altèrent le fonctionnement normal des cellules souches (réduction du nombre et perte de potentiel fonctionnel), cela pourrait potentiellement entraîner des incohérences dans les résultats des études basées sur les CSM 7,15,16,17. En outre, l’utilisation d’IFP-MSC provenant de patients atteints de maladies physiopathologiques (par exemple, arthrite et obésité) pose également des difficultés pour comprendre les caractéristiques de base des cellules saines in vitro, agissant ainsi comme un facteur limitant dans le développement de thérapies basées sur les CSM. Pour surmonter ces problèmes, l’utilisation de l’IFP-MSC provenant de donneurs sains est vitale. Comme l’accès à un donneur humain en bonne santé est difficile, les modèles animaux pourraient être une meilleure alternative. À cet égard, il existe quelques études où l’IFP a été isolé chez des souris18. Cependant, en raison de la petite taille du coussinet graisseux chez les souris normales, les tissus adipeux de plusieurs animaux ont été combinés pour obtenir suffisamment de tissu pour exécuter des procédures expérimentales élaborées19. Par conséquent, il est nécessaire de disposer d’un grand modèle animal, qui pourrait répondre à l’exigence d’un plus grand nombre de cellules tout en respectant les principes 3R (affiner, remplacer et réduire) dans la recherche animale20. L’utilisation de grands animaux a des implications importantes dans la recherche translationnelle. Plus précisément, dans le domaine de l’ingénierie tissulaire musculo-squelettique, une gamme de grands animaux tels que les chiens, les porcs, les moutons, les chèvres et les chevaux ont été étudiés21. La chèvre (Capra aegagrus hircus) est un excellent choix de gros animal car son articulation étouffante a l’anatomie la plus proche de l’articulation du genou humain22,23,24. La structure trabéculaire osseuse sous-chondrale et l’épaisseur osseuse sous-chondrale des chèvres sont similaires à celles des humains, et la proportion du cartilage par rapport à l’os serait également proche de celle des humains21. En outre, les chèvres ont été largement domestiquées dans le monde entier, ce qui les rend facilement disponibles lorsqu’elles sont squelettiques. En outre, les faibles coûts d’entretien et la facilité de manipulation en ont fait un modèle animal attrayant pour la recherche22.

Dans la présente étude, un protocole simple pour l’isolement des IFP-MSC de l’articulation étouffante de Capra aegagrus hircus (chèvre) et des conditions de culture in vitro pour leur expansion et leur différenciation sont démontrés. Les cellules isolées sont adhérentes, ont une morphologie semblable à celle des CSM, forment des colonies de fibroblastes CFU-F (fibroblastes formant des colonies) et possèdent un potentiel de différenciation adipogénique, chondrogénique et ostéogénique. Par conséquent, les IFP-MSC présentent un potentiel en tant que source alternative de MSC pour les applications biomédicales.

Protocole

Le protocole est basé sur l’isolement des IFP-MSC des chèvres. L’IFP caprin et le sang ont été prélevés dans un abattoir local. Étant donné que ces collections de tissus ne relèvent pas d’un comité d’éthique des animaux institutionnel, l’approbation éthique n’était pas requise.

1. Isolement des IFP-CSM de l’articulation fémorotibiale du genou de chèvre

  1. Prélever l’articulation fémorotibiale de chèvre (échantillon) englobant ~15 cm chacune des régions fémorales et tibiales des membres postérieurs. Placer immédiatement l’échantillon dans une boîte de prélèvement d’échantillons stérilisée et le conserver à 4 °C pour le transporter au laboratoire en vue d’un traitement ultérieur. Traiter les échantillons de manière aseptique dans une enceinte de biosécurité, à l’aide d’outils chirurgicaux stérilisés tout au long de la procédure (Figure 1, Étape 1).
  2. Placer l’échantillon sur une boîte de Petri de 150 mm et rincer abondamment avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) autoclavée additionnée d’antibiotiques (amphotéricine B à 5 μg/mL, 200 U/mL de pénicilline-streptomycine et 50 μg/mL de ciprofloxacine) pour éviter toute contamination. Assurez-vous toujours que l’échantillon est maintenu hydraté à l’aide de PBS.
  3. Examinez attentivement les régions anatomiques de l’échantillon. Pour faciliter l’accès à la capsule articulaire, assurez-vous que les tissus supplémentaires des deux os longs sont complètement enlevés (Figure 1, Étape 2).
  4. Pour ce faire, tenez d’abord la surface terminale de l’os du fémur d’une main et, avec des ciseaux tranchants, coupez longitudinalement vers l’articulation. Enlevez les muscles environnants et le tissu adipeux de l’os pendant le processus. Veillez à ce que le tissu entourant la capsule articulaire immédiate ne soit pas perturbé au départ.
  5. De même, faites une autre incision à l’extrémité tibiale de l’échantillon et retirez les muscles et le tissu adipeux de l’os tibial. Assurez-vous que les os longs sont complètement exposés et que la capsule articulaire est clairement visible après cette étape (Figure 1, Étape 3).
  6. Ensuite, faites une incision de chaque côté de la membrane de la synoviale pour ouvrir l’articulation articulaire (Figure 1, Étape 4). Coupez la rotule de la membrane synoviale et des ligaments rotuliens à l’aide d’un nouveau lot de ciseaux et de pinces stérilisés. Conservez immédiatement la rotule séparée dans une boîte de Petri contenant du PBS (Figure 1, Étape 5).
  7. Retirez tout le coussinet graisseux présent sur la surface interne de la rotule à l’aide de ciseaux et de pinces et recueillez le coussinet graisseux dans une autre boîte de Pétri fraîche (Figure 1, Étape 6). Hachez le coussinet de graisse collecté à l’aide d’un scalpel. Inclure d’autres outils chirurgicaux (p. ex., ciseaux ou lames chirurgicales) au besoin pour obtenir les plus petits morceaux ou segments de graisse possibles de ~2-3 mm.
    REMARQUE: Un bon hachage est essentiel pour obtenir un bon rendement des cellules. Gardez toujours le tissu hydraté et ne le laissez sécher à aucune étape de la procédure d’isolement.
  8. Transférer le tissu haché à l’aide d’une spatule dans un tube à centrifuger de 50 ml et le laver avec du PBS complété par des antibiotiques à température ambiante (RT) pendant 15 minutes dans un mélangeur à tube à essai. Répétez l’étape de lavage 3x, 15 min chacune.
  9. Pour la digestion enzymatique, incuber le tissu haché (~5 g) dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM à faible teneur en glucose) contenant 1,5 mg/mL de collagénase de type II (20 mL) et complété par 2 % de FBS à 37 °C pendant 12 à 16 h.
    REMARQUE: Effectuer la digestion dans un mélangeur à tube à essai à ~15 rotations par minute (RPM).
  10. Aspirez soigneusement le tissu digéré et filtrez-le à travers une passoire cellulaire (70 μm) pour éliminer tout tissu non digéré. Centrifuger le filtrat dans un tube à centrifuger de 15 mL à 150 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et lavez la pastille avec du DMEM à faible teneur en glucose au moins 2x.
    REMARQUE: Versez lentement le tissu digéré dans la passoire pour éviter les déversements. Utilisez un tube centrifuge de faible volume (15 mL) pour obtenir une bonne pastille.
  11. Resuspendre la pastille cellulaire obtenue dans un milieu DMEM complet (DMEM à faible teneur en glucose supplémenté en FBS à 10 % et en antibiotiques [amphotéricine 2,5 μg/mL, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine et 25 μg/mL de ciprofloxacine]), appelés milieux d’expansion dans le protocole dans les étapes suivantes.
  12. Ensemencer les cellules sur des boîtes de Petri de 150 mm et les cultiver dans le milieu d’expansion additionné de 5 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques (FGFb) et de sel trisodique de 50 μg/mL d’acide 2-phospho-L-ascorbique. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 pour permettre aux cellules d’adhérer et de proliférer. Surveiller quotidiennement l’attachement et la croissance des cellules.

2. Maintenance et expansion des cellules isolées

  1. Changez le média tous les 3 jours jusqu’à ce que les cellules deviennent confluentes. Ajouter du fFGb frais de 5 ng/mL et du sel trisodique d’acide 2-phospho-L-ascorbique à 50 μg/mL directement dans la boîte de Petri chaque fois que le média est changé. Une fois que les cellules deviennent confluentes à 80%-90%, sous-culture des cellules.
    REMARQUE : supprimez les entités non adhérentes lors de chaque changement de média. Dans le cas où des gouttelettes d’huile sont vues après 3 jours d’incubation, laver les cellules avec PBS 1x, puis ajouter un média frais à la boîte de Pétri. Continuez avec le lavage PBS avant chaque changement de média jusqu’à ce que les gouttelettes d’huile soient complètement éliminées.
  2. Sous-culture de cellules: Retirez le milieu d’expansion de la boîte de Petri et lavez les cellules 1x avec du PBS. Ajouter 4 mL de trypsine/EDTA à 0,25 % dans la capsule et incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 4 min.
    REMARQUE: La confluence (80% -90%) est atteinte dans les 7 jours. Répartir uniformément la solution trypsine/EDTA sur toute la surface de la boîte de Petri pendant la trypsinisation.
  3. Délogez les cellules en tapotant la plaque sur le côté et en observant au microscope pour confirmer que toutes les cellules sont détachées. Neutraliser la trypsine après avoir ajouté un volume égal (4 mL) de milieu d’expansion.
  4. Recueillir les cellules dissociées à l’aide d’une pipette dans un tube en polypropylène frais de 15 ml et centrifuger à 150 x g pendant 5 min à TA. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans le volume désiré de fluide d’expansion.
  5. Compter les cellules en utilisant la méthode standard de comptage des cellules et la sous-culture dans des boîtes de Petri de 150 mm à une densité d’ensemencement de 1 x 104 cellules/cm2 pour une expansion ultérieure. Pour tous les dosages, utiliser une monocouche confluente de cellules du numéro de passage P2-P5.
    NOTE: Cryoconserver les cellules en excès.

3. Évaluation de la capacité clonogène des IFP-MSC à l’aide du test de formation de colonies (UFC-F)

  1. Pour le dosage CFU-F, ensemencer les cellules dans un milieu d’expansion dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits à une densité d’ensemencement de 50-100 cellules/cm2. Ajouter le média pour obtenir un volume final de 3 mL.
    REMARQUE: Optimiser la concentration cellulaire pour les tests et le traitement.
  2. Culture des cellules pendant 12 jours à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 dans des conditions de culture standard pour permettre aux cellules de former des colonies. Changez le support tous les 3 jours. Soyez doux lorsque vous changez de média.
  3. Après 12 jours, rincer les colonies 1x avec du PBS et les fixer en utilisant 20% de méthanol pendant 20 min à TA. Colorer les colonies avec un colorant violet cristallin (0,5% [p/v] dans 20% de méthanol) pendant 20 min à TA. Compter les colonies individuelles à l’aide d’un microscope inversé.
    Remarque : Une colonie est définie comme un groupe de plus de 50 cellules.

4. Potentiel de différenciation des IFP-MSC

  1. Induire la différenciation adipogénique des IFP-MSC
    1. Pour induire l’adipogenèse, ensemencer les cellules à une densité de 25 x 103 cellules/cm2 dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Ajouter le milieu pour obtenir un volume final de 500 μL. Culture des cellules à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 .
    2. Un jour après la confluence, remplacer le milieu d’expansion par 500 μL de milieu de différenciation adipogénique. Il faut environ 2 jours pour que les cellules atteignent la confluence.
    3. Préparer le milieu de différenciation adipogène en complétant le milieu d’expansion (DMEM + 10% FBS + 2,5 μg/mL d’amphotéricine, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine et 25 μg/mL de ciprofloxacine) avec 25 mM de D (+)-glucose, 10 μg/mL d’insuline, 1 μM de dexaméthasone et 100 μM d’indométacine.
      NOTE: Le milieu de différenciation est instable à 4 °C après 1 mois; Par conséquent, préparez les médias au besoin.
    4. Considérez les cellules cultivées dans le milieu d’expansion supplémenté en glucose de 25 mM D (+) comme des témoins non induits. Changez le support tous les 3 jours pendant 14 jours. À la fin des 14 jours, lavez les cellules 1x avec PBS. Fixer les cellules à l’aide de formol tamponné neutre (FBN; formaldéhyde à 4 % dans du PBS) pendant 15 min à 4 °C.
    5. Après fixation, laver les puits 1x avec de l’eau distillée puis incuber les cellules avec 60% d’isopropanol pendant 5 min à TA. Après avoir éliminé l’isopropanol, colorer les gouttelettes lipidiques en incubant les cellules avec 500 μL de la solution de travail du colorant Oil Red O pendant 5 min à TA. Lavez les puits 1x avec de l’eau distillée pour enlever le colorant non lié et imagez les cellules à l’aide d’un microscope inversé.
      NOTE: Préparer la solution mère d’Oil Red O (ORO) en dissolvant 300 mg d’ORO dans 100 mL d’isopropanol à 99%. Pour préparer la solution de travail, mélanger trois parties d’ORO brut et deux parties d’eau distillée et laisser mélanger à TA pendant 10 min. Filtrer le mélange à l’aide de papier filtre de 0,2 μm. La solution de travail est prête à l’emploi. La solution mère peut être préparée et conservée à RT pendant 1 mois dans l’obscurité, tandis que la solution de travail doit être fraîchement préparée avant chaque utilisation/coloration.
  2. Induire la différenciation chondrogénique des CSM IFP
    1. Isolement du plasma caprin :
      1. Préparer 3,4 % (p/v) de citrate de sodium dans de l’eau distillée. Ajouter 5 mL de la solution préparée de citrate de sodium dans un tube à centrifuger de 50 mL.
      2. Prélever 45 mL de sang de chèvre fraîchement isolé dans le même tube. Inclinez immédiatement le tube pour bien mélanger le sang avec le citrate de sodium afin d’éviter la coagulation et transportez-le au laboratoire à 4 °C.
      3. Centrifuger le sang de chèvre recueilli à 1000 x g pendant 20 min à 4 °C. Transférer le surnageant (plasma) dans un tube neuf à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité. Filtrer le plasma à travers des filtres de 0,2 μm, aliquote, et conserver à -20 °C pour une utilisation ultérieure.
        REMARQUE : Maintenir la température de 2 à 8 °C pendant la manipulation des échantillons. Il est important de minimiser les cycles de gel-dégel du plasma.
    2. Cultivez les cellules expansées à 80%-90% de confluence, dissociez les cellules à l’aide d’une solution de trypsine/EDTA et enduisez les cellules à 150 x g pendant 5 minutes dans un tube à centrifuger de 15 mL. Remettez en suspension la pastille dans du plasma de chèvre à une densité de 2 x 106 cellules par 50 μL de solution plasmatique.
    3. Ajouter une goutte de cellules contenant du plasma (50 μL) sur une boîte de Petri stérilisée de 90 mm, puis ajouter le chlorure de calcium à une concentration finale de 0,3% (p / v). Bien mélanger pour fabriquer de l’hydrogel plasma réticulé.
    4. Incuber l’hydrogel fabriqué à 37 °C pendant 40 min. Après l’incubation, transférer les hydrogels dans des plaques de culture tissulaire à 24 puits contenant des milieux chondrogènes.
    5. Préparer des milieux chondrogènes en complétant le DMEM à faible teneur en glucose avec 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinééthanésulfonique (HEPES), 1,25 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA), 1 mM de proline, 50 μg/mL d’acide 2-phospho-L-ascorbique sel trisodique, 100 nM de dexaméthasone, 1x insuline, transferrine, sélénite de sodium + linoléique-BSA (ITS+1), des antibiotiques (2,5 μg/mL d’amphotéricine, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine et 25 μg/mL de ciprofloxacine), et 10 ng/mL de facteur de croissance transformant β1 (TGF-β1).
    6. Les hydrogels cultivés dans un milieu DMEM complet (DMEM à faible teneur en glucose avec 10% FBS et antibiotiques [2,5 μg/mL d’amphotéricine, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine et 25 μg/mL de ciprofloxacine]) sans TGF-β1 sont considérés comme des témoins non induits. Changez le support tous les 3 jours pendant 14 jours.
    7. Après 14 jours de différenciation chondrogénique des cellules dans les hydrogels plasmatiques, laver les hydrogels avec du PBS 3x pendant 5 min chacun, puis fixer les échantillons dans le FBN pendant 3 h.
      ATTENTION : Le formaldéhyde est un cancérogène potentiel et peut causer une irritation du nez, de la gorge et des poumons lors de l’inhalation. Effectuer toutes les procédures liées au formaldéhyde dans une hotte.
    8. Retirer le FBN, laver les hydrogels avec du PBS 3x pendant 5 minutes chacun, puis incuber dans 35% (p / v) de saccharose à TA pendant la nuit pour permettre à la solution d’être complètement absorbée dans les échantillons. Acclimater les hydrogels dans un composé à température de coupe optimale (OCT) pendant 3 h. Incorporer les échantillons dans un composé OCT à l’aide de moules en silicone sous azote liquide.
    9. Couper les échantillons à une épaisseur de 10-12 μm sur des lames de verre recouvertes de gélatine à l’aide d’un cryotome et les conserver à -20 °C pour une utilisation ultérieure. Pour examiner la présence ou le dépôt de la matrice extracellulaire après différenciation chondrogénique, colorer les sections avec du bleu d’Alcian et du colorant safranine-O, qui se lient aux glycosaminoglycanes sulfatés.
      NOTE: Pour préparer le colorant bleu Alcian, dissoudre 1 g de colorant bleu Alcian dans 100 mL de HCl 0,1 N et bien mélanger dans un mélangeur en tube à essai pendant une nuit. La solution peut être conservée chez RT pendant 1 mois dans l’obscurité. Pour préparer le colorant Safranin-O, dissoudre 0,1 g de colorant Safranin-O dans 100 mL d’eau distillée et bien mélanger dans un mélangeur en tube à essai pendant une nuit.
    10. Pour la coloration au bleu Alcian, laver les sections d’hydrogel 1x avec de l’eau distillée pendant 5 min. Pour fixer les sections, ajouter 4% NBF aux lames et incuber pendant 30 min.
    11. Laver les sections 1x à l’eau distillée pendant 5 min, puis 2x avec 0,1 N HCl pendant 30 s chacune. Retirez le HCl et séchez doucement les lames avec du papier de soie. Ajouter la teinture Alcian Blue préparée aux sections et incuber pendant 30 min à 37 °C dans une chambre humidifiée.
    12. Laver le colorant non lié avec 0,1 N HCl, puis distiller à l’eau pendant 3 min. Déshydrater les sections dans de l’éthanol absolu, les éliminer dans du xylène et enfin monter les sections colorées dans un milieu résineux pour l’imagerie.
    13. Pour la coloration au safranin-O, laver les sections d’hydrogel avec de l’eau distillée 1x pendant 5 min. Pour fixer les sections, ajouter 4% NBF aux lames et incuber pendant 30 min. Laver les sections 1x avec de l’eau distillée pendant 5 min, puis tremper les lames dans de l’acide acétique à 1% pendant 10-15 s. Sécher doucement les lames avec du papier de soie.
    14. Ajouter le colorant Safranin-O préparé aux sections et incuber pendant 10 min à TA. Laver le colorant non lié avec de l’éthanol à 100%. Trempez les lames dans de l’éthanol à 100% pendant 5 min. Sécher les lames à l’air, les nettoyer dans du xylène et enfin monter les sections colorées dans un milieu résineux pour l’imagerie.
  3. Induire la différenciation ostéogénique des CSM IFP
    1. Pour induire une différenciation ostéogénique, trypsiniser les cellules, comme indiqué précédemment (étape 2.2.). Ensemencer les cellules à une densité de 3 x 103 cellules/cm2 dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Ajouter le milieu pour obtenir un volume final de 500 μL. Culture des cellules à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 . 1 jour après l’ensemencement, remplacer le milieu d’expansion par un milieu de différenciation ostéogénique de 500 μL.
    2. Préparer le milieu ostéogénique en complétant le milieu d’expansion (DMEM + 10% FBS +2,5 μg/mL d’amphotéricine, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine et 25 μg/mL de ciprofloxacine) avec 25 mM de D (+)-glucose, 10 nM de dexaméthasone, 10 mM de β-glycérophosphate, 50 μg/mL de sel trisodique d’acide 2-phospho-L-ascorbique et 10 nM de vitamine D3.
      NOTE: Les cellules cultivées dans des milieux d’expansion supplémentés en 25 mM D (+) de glucose sont considérées comme des témoins non induits.
    3. Changez le milieu ostéogénique tous les 3 jours pendant 14 jours ou 28 jours. Au bout de 14 jours, mesurer l’étendue de l’ostéogenèse par coloration à la phosphatase alcaline (PA).
      REMARQUE : Pour préparer le substrat en vue de la coloration à l’ALP, dissoudre un comprimé de phosphate de chloro-3-indolyle (PIBC)/tétrazolium nitrobleu (NBT) dans 10 mL d’eau distillée dans un tube à centrifuger de 15 mL. Laissez le comprimé se dissoudre complètement. La solution de substrat est prête à l’emploi. Étant donné que la solution de substrat ne peut pas être conservée plus longtemps, en fonction des besoins, cassez le comprimé en deux et dissolvez-le dans 5 ml d’eau distillée. Pour préparer le tampon de perméabilisation, ajouter le tampon Tris (100 mM) et le chlorure de magnésium (5 mM) à l’eau distillée. Ajouter Triton X100 (0,1%) à la solution et laisser dissoudre. Ajustez le pH de la solution à 9,25-9,75.
    4. Pour la coloration ALP, après 14 jours d’induction, retirez le média et lavez les cellules avec du PBS. Fixez les cellules en utilisant NBF (4%) pendant 1 min. Lavez les cellules avec du PBS et perméez à l’aide du tampon de lyse préparé pendant 2-3 min.
    5. Ajouter 500 μL de la solution de substrat préparée aux cellules et laisser incuber pendant 15 min à 1 h, selon le niveau d’expression. Vérifiez le développement de la couleur violette / bleue entre les deux.
    6. Retirer la solution de substrat et laver à l’eau distillée. Imagez les cellules colorées à l’aide d’un microscope inversé.
    7. Au bout de 28 jours, mesurer l’étendue de la calcification après induction ostéogénique par coloration Alizarin Red-S.
      NOTE: Pour préparer la solution de coloration Alizarin Red-S (40 mM), dissoudre 2 g d’Alizarin Red-S dans 100 mL d’eau distillée et ajuster le pH à 4,1-4,3 avec HCl ou NH4OH. Filtrer la solution à travers une membrane de 0,22 μm et la conserver à 4 °C dans l’obscurité. Le pH de la solution est important; par conséquent, il est recommandé soit de faire une solution fraîche, soit de remesurer le pH de la solution si elle a plus de 1 mois.
    8. Pour la coloration Alizarin Red-S, après 28 jours d’induction, retirez le média et lavez les cellules 1x avec du PBS froid. Fixer les cellules à l’éthanol à 70% pendant 1 h à 4 °C.
    9. Retirez le fixateur et lavez les cellules 2x avec de l’eau distillée. Retirez complètement l’eau et ajoutez 1 mL de solution d’Alizarin Red-S à chaque puits.
    10. Incuber les cellules avec la solution pendant 1 h à RT et imager les cellules à l’aide d’un microscope inversé.

Résultats

Isolement des IFP-MSC de l’articulation fémorotibiale de chèvre
Les étapes de l’isolement des IFP-MSC de l’articulation étouffante d’une chèvre sont illustrées à la figure 1. Le coussinet graisseux présent dans la surface interne non articulée de la rotule a été retiré, haché et digéré enzymatiquement. Les IFP-MSC ont été isolés avec succès et cultivés in vitro (Figure 2A).

Discussion

Dans le protocole actuel, une méthode simple, fiable et reproductible pour l’isolement des CSM de l’IFP caprin a été fournie. Les cellules isolées à l’aide de cette méthode ont été utilisées avec succès dans nos études précédentes pour la régénération tissulaire in vitro. Il a été observé que les cellules isolées étaient prolifératives, répondaient à divers facteurs de croissance et conservaient leur activité biologique lorsqu’elles étaient ensemencées sur des fibres électrofi...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.

Remerciements

SH reconnaît le soutien de la bourse postdoctorale de l’Institut de l’IIT Kanpur et la subvention SYST de DST (Division SEED) (SP/YO/618/2018). AM remercie l’Institut indien de technologie de Kanpur (IIT-Kanpur) pour une bourse de l’Institut. DSK remercie la chaire Gireesh Jankinath et le département de biotechnologie de l’Inde pour leur financement (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH et DSK remercient le Mehta Family Centre for Engineering in Medicine de l’IIT-Kanpur pour son généreux soutien.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
β-glycerophosphateSigma-AldrichG9422-10G10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTAHi-MediaTCL049
15-mL centrifuge tubeCorning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma49752-10G50 µg/mL
2-PropanolSigma-AldrichI9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)HiMediaTCL021-50ml10 mM
50-mL centrifuge tubeCorning
Alcian BlueHi-MediaRM471For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red SS D Fine-Chem Limited26048-25GFor calcium deposition
Amphotericin BHiMediaA0112.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF)Sino Biologicals10014-HNAE5 ng/mL
BCIP/NBT ALP SubstrateSigmaB5655-5TABFor ALP staining
Biological safety cabinet
BSAHiMediaMB-083Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainerHiMediaTCP-18270 µm
CentrifugeREMI
CiprofloxacinRANBAXY LAB. LimitedB17407T12.5 µg/mL
Crystal VioletS D Fine-Chem Limited42555
D(+)-glucoseMerck1.94925.052125 mM
DexamethasoneSigma-AldrichD29151 µM
DMEM LGSIGMAD5523Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
EthanolMerck100983
FBSGibco10270Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41%Merck61780805001730
IndomethacinSigma-AldrichI7378100 µM
InsulinSigma-AldrichI927810 µg/mL
Inverted microscopeNikon Eclipse TS 100
ITS + 1Sigma-AldrichI2521-5mLLong name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-ProlineHiMediaTO-109-25G1 mM
Magnesium chlorideMerck61751605001730For lysis buffer
MethanolMeck1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)Thermoscientific
MUSE Cell analyserMerck MilliporeFor cell counting
OCT compoundTissue-Tek4583Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dyeS D Fine-Chem Limited54304For lipid vacuole staining
Penicillin-StreptomycinHiMediaA007100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm)NEST
Safranin OS D Fine-Chem Limited50240For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrateSigma-AldrichC34343.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpelsFor isolation of IFP-MSC
SucroseMerck1.94953.052135 % (w/v)
TGF-β1Sino BiologicalsLong name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2Thermoscientific
Tris bufferMerck61771405001730For lysis buffer
Triton X100S D Fine-Chem Limited40632For lysis buffer
Type II collagenaseGibco171010151.5 mg/mL
Vitamin D3SigmaC9756-1G10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP)NEST

Références

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