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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes hämatopoetisches Stamm- und Vorläuferzell-Kulturverfahren (HSPC) für die robuste Anpflanzung von geneditierten Zellen in vivo.

Zusammenfassung

CRISPR/Cas9 ist ein äußerst vielseitiges und effizientes Gen-Editing-Tool, das häufig zur Korrektur verschiedener genetischer Mutationen eingesetzt wird. Die Machbarkeit der Genmanipulation von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) in vitro macht HSPCs zu einer idealen Zielzelle für die Gentherapie. HSPCs verlieren jedoch in Ex-vivo-Kultur moderat ihr Engraftment- und Multilineage-Repopulationspotenzial. In der vorliegenden Studie werden ideale Kulturbedingungen beschrieben, die das HSPC-Engraftment verbessern und eine erhöhte Anzahl genmodifizierter Zellen in vivo erzeugen. Der aktuelle Bericht zeigt optimierte In-vitro-Kulturbedingungen , einschließlich der Art der Kulturmedien, der einzigartigen Ergänzung mit niedermolekularen Cocktails, der Zytokinkonzentration, der Zellkulturplatten und der Kulturdichte. Darüber hinaus werden ein optimiertes HSPC-Gen-Editing-Verfahren sowie die Validierung der Gen-Editing-Ereignisse bereitgestellt. Für die In-vivo-Validierung werden die geneditierte HSPC-Infusion und die Post-Engraftment-Analyse bei Mausempfängern angezeigt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Kultursystem die Häufigkeit funktioneller HSZ in vitro erhöhte, was zu einer robusten Anpflanzung von geneditierten Zellen in vivo führte.

Einleitung

Die Unzugänglichkeit zu humanen Leukozytenantigen (HLA)-passenden Spendern in allogenen Transplantationsumgebungen und die rasche Entwicklung äußerst vielseitiger und sicherer gentechnischer Werkzeuge machen die autologe hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) zu einer kurativen Behandlungsstrategie für erbliche Blutkrankheiten 1,2. Die autologe hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzell-Gentherapie (HSPC) umfasst die Sammlung von HSPCs der Patienten, genetische Manipulation, Korrektur krankheitsverursachender Mutationen und Transplantation genkorrigierter HSPCs in den Patienten 3,4. Das erfolgreiche Ergebnis der Gentherapie hängt jedoch von der Qualität des transplantierbaren, genmodifizierten Transplantats ab. Die Genmanipulationsschritte und die Ex-vivo-Kultur von HSPCs beeinflussen die Qualität des Transplantats, indem sie die Häufigkeit von langfristigen hämatopoetischen Stammzellen (LT-HSCs) verringern, was die Infusion großer Dosen genmanipulierter HSPCs erfordert 2,5,6.

Mehrere kleine Moleküle, darunter SR1 und UM171, werden derzeit verwendet, um Nabelschnurblut-HSPCs robust zu expandieren 7,8. Für adulte HSPCs ist aufgrund der höheren Zellausbeute, die bei der Mobilisierung erzielt wird, keine robuste Expansion erforderlich. Die Beibehaltung der Stammzellen isolierter HSPCs in Ex-vivo-Kultur ist jedoch entscheidend für ihre Gentherapieanwendungen. Daher wird ein Ansatz entwickelt, der sich auf die Kulturanreicherung von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) konzentriert, wobei eine Kombination kleiner Moleküle verwendet wird: Resveratrol, UM729 und SR1 (RUS)7. Die optimierten HSPC-Kulturbedingungen fördern die Anreicherung von HSCs, was zu einer erhöhten Häufigkeit genmodifizierter HSCs in vivo führt und die Notwendigkeit reduziert, große Dosen von HSPCs genmanipulieren zu müssen, was kostengünstige Gentherapieansätze ermöglicht8.

Hier wird ein umfassendes Protokoll für die HSPC-Kultur beschrieben, zusammen mit der Infusion und Analyse von geneditierten Zellen in vivo.

Protokoll

In-vivo-Experimente an immundefizienten Mäusen wurden vom Institute Animal Ethics Committee (IAEC), Christian Medical College, Vellore, Indien, genehmigt und nach den Richtlinien durchgeführt. Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF)-mobilisierte periphere Blutproben wurden von gesunden menschlichen Spendern mit informierter Zustimmung nach Erhalt der Genehmigung durch das Institutional Review Board (IRB) gesammelt.

1. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNCs) und Reinigung von CD34 + -Zellen

  1. Führen Sie die PBMNC-Isolierung aus, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    HINWEIS: Für die In-vitro-HSPC-Kultur und Gen-Editierung ist es ideal, mit mindestens 1 x 106 HSPCs/Gruppe zu beginnen. Für die In-vivo-Engraftment-Analyse ist eine Ausgangszellzahl von mindestens 5 x 10 6 HSPCs/Gruppe ideal, wenn eine Gruppe acht Mäuse enthält und jede Maus mit mindestens6 x 105 Zellen infundiert ist. Um eine ausreichende Anzahl von PBMNCs (~ 1 x 109) für das Verfahren zu erhalten, wird empfohlen, mit 20 ml mobilisiertem peripherem Blut (mPB) zu beginnen.
    1. Nach der Sammlung von mPB werden 20 ml mPB mit steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) im Verhältnis 1:1 verdünnt.
      HINWEIS: Die Effizienz der G-CSF-Mobilisierung kann zwischen den Individuenvariieren 9, und daher variiert die Anzahl der HSPCs, die aus 20 ml mobilisiertem Blut gewonnen werden, zwischen den Spendern.
    2. Fügen Sie 10 ml Dichtegradientenmedium (Lymphoprep, siehe Materialtabelle) zu einem 50-ml-Röhrchen hinzu und schichten Sie das verdünnte Blut im Verhältnis 1:2 durch die Seiten des Röhrchens.
      HINWEIS: Das Kippen des 50-ml-Röhrchens in einem Winkel von 20° während der Zugabe des verdünnten Blutes verhindert, dass es sich mit Lymphoprep vermischt, was zu einer klaren Trennung der Blutbestandteile nach der Zentrifugation führt.
    3. Zentrifuge bei 600 x g für 30 min bei Raumtemperatur (RT) mit einer Beschleunigungsrate von 1 m/s² und einer Verzögerung von 1 m/s². Verwerfen Sie die obere Schicht (Plasma) mit einer serologischen Pipette und ernten Sie den Buffy-Mantel, der in der Interphase (PBMNCs) über der mittleren Schicht des Dichtegradienten vorhanden ist.
      HINWEIS: Saugen Sie den Buffy-Mantel mit einer serologischen Pipette ab, indem Sie ihn vorsichtig an den Seiten des Röhrchens schwenken. Vermeiden Sie es, ein höheres Volumen an Interphase zu sammeln, während Sie den Buffy-Mantel ansaugen, um eine Granulozyten- und RBC-Kontamination zu vermeiden.
    4. Die PBMNCs werden in ein frisches 50 ml konisches Röhrchen überführt und die Zellsuspension mit 1x PBS im Verhältnis 1:2 verdünnt.
      HINWEIS: Verdünnen Sie die Zellsuspension mit 1x PBS im Verhältnis 1:4, wenn beim Absaugen des Buffy-Mantels ein Überschuss an Interphase gesammelt wurde.
    5. Die Zellsuspension wird bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur mit einer Beschleunigung von 9 m/s² und einer Verzögerung von 7 m/s² zentrifugiert und der Überstand mit einer serologischen Pipette verworfen. 30 mL eiskalter RBC-Lysepuffer (siehe Tabelle 7) zum Pellet geben und 10 min in Eis inkubieren. Mischen Sie, indem Sie die Röhre alle 2 Minuten umdrehen.
    6. Bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur mit einer Beschleunigungsrate von 9 m/s² und einer Verzögerung von 7 m/s² zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.5.-1.1.6. bis die Pelletrötung verschwindet. Resuspendieren Sie das Pellet mit basalen Medien (IMDM, siehe Materialtabelle) und führen Sie eine Zellzählung mit Trypanblau in einer Neubauer-Kammer10 durch.
      HINWEIS: Die isolierten PBMNCs können sofort zur Reinigung von CD34+ HSPCs verwendet werden. Alternativ können die PBMNCs kryokonserviert und wiederbelebt werden, wann immer dies für die CD34+ Anreicherung erforderlich ist. Zur Kryokonservierung 5 x 108 Zellen bei 200 x g für 5 min zentrifugieren und 4 mL Kryomedien mit IMDM: FBS: DMSO (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 7:2:1 hinzufügen.
    7. Die Durchstechflaschen in einen 1 °C Kryokühler geben und bei −80 °C bis zu 12 h lagern. Übertragen und lagern Sie die Kryogeräte in einem Flüssigstickstoffbehälter zur Langzeitlagerung.
  2. Wiederbelebung der kryokonservierten PBMNCs.
    1. Die Kryoviale in einem 37 °C warmen Wasserbad durch leichtes Schwenken für <1 min halb auftauen. Die Zellsuspension des Kryos wird in ein 50-ml-Röhrchen mit IMDM im Verhältnis 1:10 überführt.
    2. Die Zellsuspension wird bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur mit einer Beschleunigung von 9 m/s² und einer Verzögerung von 7 m/s² zentrifugiert und der Überstand mit einer serologischen Pipette verworfen.
  3. Reinigen Sie die CD34+ -Zellen von PBMNCs, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Bereiten Sie den Reinigungspuffer mit sterilem 1x PBS vor, das 2% gefiltertes fetales Rinderserum (FBS) enthält. Resuspendieren Sie das PBMNC-Zellpellet gemäß Tabelle 1 im Puffer.
      HINWEIS: Der Puffer muss frei von Ca++ und Mg++ sein.
    2. Die Zellsuspension, die 1 x 108-5 x 108 Zellen frischer oder kryokonservierter PBMNCs enthält, wird in das 5-ml-Polystyrol-Rundbodenrohr überführt (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Fügen Sie der Zellsuspension DNase (siehe Materialtabelle) in einer Endkonzentration von 100 μg/ml hinzu, um eine Zellverklumpung zu verhindern. Wir verwendeten ein handelsübliches Kit für die CD34-Reinigung, das Human CD34 Positive Selection Cocktail und Dextran Rapid Spheres enthält (siehe Materialtabelle).
    3. Im Handel erhältlichen Human CD34 Positive Selection Cocktail (siehe Materialtabelle) in der Konzentration von 100 μL/ml Zellen zugeben und vorsichtig resuspendieren.
    4. Bei RT für 30 min inkubieren und die Zellsuspension alle 5 min vorsichtig resuspendieren. Fügen Sie 50 μL/ml handelsübliche Dextran Rapid Spheres hinzu (siehe Materialtabelle) und resuspendieren Sie sie vorsichtig.
      HINWEIS: Wirbeln Sie die Dextran-Kugeln mit hoher Geschwindigkeit für 5 s, um sicherzustellen, dass die Partikel gleichmäßig verteilt erscheinen, und fügen Sie sie dann zu den Zellen hinzu.
    5. Inkubieren Sie bei RT für 15 min und resuspendieren Sie die Zellsuspension vorsichtig alle 5 min. Die Zellsuspension mit Reinigungspuffer auf ein Gesamtvolumen von 2,5 ml herstellen und schonend resuspendieren.
    6. Legen Sie das Röhrchen in einen handelsüblichen immunomagnetischen säulenfreien Magneten (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie für 5 min bei RT. Nach der Inkubation den Magneten umkehren und den Überstand in einer kontinuierlichen Bewegung verwerfen.
      HINWEIS: Die Dextran Rapid Spheres-markierten CD34+ Zellen bleiben durch das Magnetfeld an den Seiten der Röhre angezogen. Das Rohr muss 2-3 s in umgekehrter Position gehalten werden. Vermeiden Sie Zittern oder Ablöschen der Tropfen, die am Mund der Röhre hängen.
    7. Entfernen Sie den Schlauch aus dem Magneten und fügen Sie 2,5 ml Reinigungspuffer hinzu. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6-1.3.7 fünfmal.
      HINWEIS: Während der Zugabe des Reinigungspuffers positionieren Sie das Rohr in einem spitzen Winkel und fügen Sie Puffer hinzu, indem Sie das Rohr schwenken, da die Zellen beim Invertieren des Magneten an den Oberflächenwänden haften können.
    8. Nach fünf Wäschen entfernen Sie das Röhrchen aus dem Magneten, fügen Sie 4 ml 1x steriles PBS hinzu und suspendieren Sie die Zellsuspension. Die Zellsuspension in das 15 mL Zentrifugenröhrchen geben und mit 1x PBS auf 10 mL auffüllen. Führen Sie eine Zellzählung mit Trypanblau in einer Neubauer-Kammerdurch 10.
    9. Zentrifugieren Sie bei 200 x g für 5 min bei RT (Beschleunigung ~9 m/s², Verzögerung ~7 m/s²) und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Um die HSPCs zu kultivieren, resuspendieren Sie die Zellen in HSPC-Kulturmedien, wie in Schritt 2.1 erwähnt.
      HINWEIS: Die Exzesse gereinigter HSPCs wurden in einem kommerziell erhältlichen Kryokonservierungsmedium (siehe Materialtabelle) mit einer Dichte von 9 x 106 Zellen/ml kryokonserviert, nachdem die HSPCs 12 h lang in HSPC-Kulturmedien kultiviert wurden.
  4. Wiederbelebung der kryokonservierten HSPCs.
    1. Die Kryovials <1 min in einem 37 °C warmen Wasserbad durch leichtes Schwenken auftauen. Übertragen Sie die Zellsuspension im Kryo in ein 50-ml-Röhrchen.
    2. Fügen Sie 1% BSA resuspendiert in 1x PBS Tropfen für Tropfen mit konstantem Rühren hinzu und machen Sie es auf 20 ml. Bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur mit einer Beschleunigungsrate von 9 m/s² und einer Verzögerung von 7 m/s² zentrifugieren und den Überstand mit einer serologischen Pipette verwerfen.
    3. Wiederholen Sie Schritt 1.4.2. 1x. Resuspendieren Sie die Zellen in HSPC-Kulturmedien und Kultur wie in Schritt 2.1 beschrieben.

2. In-vitro-Kultur von gereinigten HSPC

  1. Bereiten Sie die Nährmedien mit SFEM-II mit SCF (240 ng/ml), FLT3 (240 ng/ml), TPO (80 ng/ml), IL6 (40 ng/ml) und 1x Antibiotika-Antimykotikum vor (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Frisch zubereitete Nährmedien werden dringend empfohlen. Die Medien können jedoch nach der Aufbereitung bis zu 24 h bei 4 °C gelagert werden.
  2. Resuspendieren Sie das CD34+ -Pellet mit dem Nährmedium, fügen Sie 3 μL RUS-Cocktail/ml Medium (Resveratrol, 10 μM; UM729, 500 nM; StemReginin-1, 750 nM; siehe Materialtabelle) und kultivieren die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2.
    HINWEIS: UM171 (10 nm) kann verwendet werden, um UM729 (500 nM) zu ersetzen, da beide ähnliche Auswirkungen auf die HSPC-Stammerhaltung haben7. Die Durchstechflaschen können nicht mehr als zweimal eingefroren werden.
  3. Zunächst werden die gereinigten Zellen bei einem Konfluency von 5 x 105/ml in handelsüblichen oberflächenbehandelten Delta-6-Well-Platten (siehe Materialtabelle) ausgesät, um die anhaftenden Zellen zu entfernen.
  4. Säen Sie die Zellen in der Suspension bei einem Zusammenfluss von 2 x 105 Zellen/ml in einer neuen 6-Well-Platte nach 6 h Reinigung erneut aus.
  5. Charakterisieren Sie die Stammheit der HSPCs mittels Durchflusszytometrie vor der Genbearbeitung.
    1. Für die Durchflusszytometrie-Analyse nehmen Sie 1 x 105 Zellen in 100 μL 1x PBS und fügen Sie 3 μL (75 ng) CD34 PE, 4 μL (100 ng) CD133 FITC und 4 μL (100 ng) CD90 APC hinzu (siehe Materialtabelle).
    2. Inkubieren Sie das Röhrchen bei RT für 20 min im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen mit 2 ml 1x PBS 2x und zentrifugieren Sie bei 200 x g für 5 min bei RT. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette, resuspendieren Sie das Zellpellet mit 150 μL 1x PBS und erwerben Sie es in der Durchflusszytometrie.
      HINWEIS: Wenn der Prozentsatz der CD34+ -Zellen <90% beträgt, erhöhen Sie die Anzahl der Wäschen in Schritt 1.3.7 bis zu sechsmal. Die gereinigten HSPC werden in Kulturmedien ausgesät und nach 6 h nur die Zellen in der Suspension gesammelt. Die meisten CD34-Zellen haften an der Kulturplatte.

3. Gen-Editing von HSPCs

  1. Führen Sie eine RNA-Rekonstitution durch.
    HINWEIS: Synthetische sgRNA mit Phosphorothioatmodifikationen, die auf den CCR5-Locus abzielen, wurde aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).
    1. Zur Rekonstitution stellen Sie den Thermomischer auf 37 °C ein und heizen den 1x TE-Puffer (siehe Materialtabelle) auf 37 °C für 10 min vor. Zentrifugieren Sie die synthetische chemisch modifizierte sgRNA-Durchstechflasche bei 11.000 x g für 1 min bei 4 °C.
    2. Zu der sgRNA-Durchstechflasche, die 1,5 nM lyophilisierte sgRNA enthält, werden 15 μL 1x TE-Puffer hinzugefügt, was eine Endkonzentration von 100 pM/μL ergibt.
    3. Im Thermomischer bei 37 °C für 30-40 s mit minimalem Schütteln inkubieren. Nach einer kurzen Drehung 15 μL sgRNA sammeln und als 1 μl Aliquots (100 pM/μL) bei −80 °C für die zukünftige Verwendung bis zu 1 Jahr lagern.
      HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Es wird maximal ein Gefrier-Tau-Zyklus von aliquotierter gRNA empfohlen.
  2. Führen Sie die Nukleofektion durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Zählen Sie am Tag 3 der Kultur die Zellen mit Neubauers verbesserter Zellzählkammer10.
    2. Zur RNP-Vorbereitung (zur Nukleofektierung von 2 x 10 5 Zellen) nehmen Sie 1 μL sgRNA, die auf das CCR5-Gen abzielt (100 pM) in einem 0,5-ml-Röhrchen und fügen 2,65 μL Cas9 (50 pM) hinzu, indem Sie vorsichtig um den Boden der Durchstechflasche herumwirbeln. Inkubieren bei RT für 10 min.
      HINWEIS: gRNA-Sequenz: (CCR5) TGACATCAATTATACATCGG.
    3. Zur Puffervorbereitung 16,4 μL P3-Primärzelllösung und 3,6 μl Nahrungsergänzungsmittel mit dem handelsüblichen Nukleofektionskit (siehe Materialtabelle) zugeben und 10 min bei RT inkubieren. Nährmedien vorbereiten (Schritt 2.1.) und vor der Nukleofektion bei 37 °C in der Kulturplatte vorinkubieren.
    4. Pelletieren Sie 2 x 10 5 Zellen durch Zentrifugieren bei 200 x g für5 min bei RT und verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette, ohne das Pellet zu stören. Das Pellet wird mit 20 μL des in Schritt 3.2.3 vorbereiteten Puffers resuspendiert. und resuspendieren Sie es vorsichtig.
    5. Die Zellsuspension wird vorsichtig mit dem vorbereiteten RNP-Komplex (Schritt 3.2.2.) ohne Luftblasen gemischt. Übertragen Sie die Suspension auf den kommerziellen Nukleofektionsstreifen (siehe Materialtabelle) und wählen Sie den Pulscode DZ100, um die Zellen mit dem 4D-Nukleofektor zu elektropolieren (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Das Endvolumen der Zellsuspension, einschließlich der Puffer- und RNP-Komponenten, darf nicht mehr als 27 μL/Elektroporation überschreiten.
    6. Für die experimentelle Kontrolle werden 2 x 10 5 unbearbeitete HSPCs durch Zentrifugieren bei 200 x g für5 min bei RT pelletiert und das Pellet mit 20 μL des in Schritt 3.2.3 hergestellten Puffers resuspendiert. ohne RNP-Komplex.
    7. 100 μL vorinkubiertes Kulturmedium (Schritt 3.2.3.) zu den elektropolierten Zellen geben und die Zellen 10 min ungestört im Nukleofektionsstreifen bei RT lassen. Nach 10 Minuten Inkubation wird der Inhalt gemäß den experimentellen Anforderungen auf die Kulturplatte überführt.
      HINWEIS: Dieses Protokoll kann auf nicht-homologe End-Joining (NHEJ)-vermittelte gezielte Störung eines beliebigen genomischen Locus unter Verwendung von zielspezifischer gRNA angewendet werden. Das gleiche Protokoll kann für die Einführung großer Deletionen angewendet werden, indem duale gRNA in Schritt 3.2.2 eingeschlossen wird. 11. Darüber hinaus kann nach 10 Minuten RNP-Inkubation dasselbe Protokoll für die Homology Directed Repair (HDR)-basierte Genbearbeitung verwendet werden, wenn eine Spendervorlage12 bereitgestellt wird. Das Protokoll wurde durch die gezielte Störung von AAVS1, Pseudo-β-Globin, β-Globin und dem CCR5-Locus 7,8 validiert.

4. Validierung von Gen-Editing-Ereignissen in HSPCs

  1. Führen Sie eine DNA-Extraktion durch.
    1. Nach 72 h nach der Nukleofektion führen Sie eine Zellzählung mit Trypanblau in einer Neubauer-Kammer durch. Sammeln Sie 1 x 105 geneditierte HSPCs für die DNA-Extraktion.
    2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 11.000 x g für 5 min bei RT und verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 ml 1x PBS und wiederholen Sie die Zentrifugation und verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie dem Pellet 20 μL Schnellextraktlösung (siehe Materialtabelle) für 1 x 105 Zellen hinzu und resuspendieren Sie das Pellet.
    3. Die Mischung in einem Thermocycler bei 68 °C für 30 min inkubieren. Nach einer kurzen Drehung die Mischung in einem Thermocycler bei 98 °C für 10 min inkubieren. Die Konzentration der DNA im Rohlysat wird mit einem Spektralphotometer13 gemessen.
  2. Führen Sie die Amplifikation des geneditierten Locus durch PCR durch.
    1. Entwerfen Sie mit Primer3 (siehe Materialtabelle) die locusspezifischen Grundierungen, die die doppelsträngige Bruchstelle (DSB) mit Amplikongrößen zwischen 400 und 700 bp überspannen (Tabelle 2).
      HINWEIS: Primer3 ist ein webbasiertes Open-Source-Tool zum Entwerfen von PCR-Primern.
    2. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch gemäß Tabelle 3 vor und betreiben Sie den Thermocycler unter den in Tabelle 4 genannten Zyklusbedingungen. Um die Amplifikation des gewünschten Locus zu bestätigen, mischen Sie 5 μL PCR-Produkt mit 6x Ladefarbstoff und laden Sie auf die 2% ige Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung des TAE-Puffers.
      HINWEIS: Die TAE-Pufferkomponenten sind in Tabelle 7 aufgeführt.
    3. 30-40 min bei 100 V laufen und das Amplikon mit einem Gel-Bildgebungssystem detektieren (siehe Materialtabelle). Gemäß dem PCR-Reinigungsherstellerprotokoll (siehe Materialtabelle) das amplifizierte PCR-Produkt reinigen.
    4. Messen Sie die Konzentration des gereinigten PCR-Produkts mit einem Nanotropfen-Spektralphotometer (siehe Materialtabelle).
  3. Führen Sie die Sanger-Sequenzierung durch und entfernen Sie den freien Farbstoffterminator, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Das Reaktionsgemisch wird wie in Tabelle 5 dargestellt hergestellt. Führen Sie den Thermocycler mit den in Tabelle 6 genannten Zyklusbedingungen aus.
    2. 10 μL HighPrep DTR-Reagenz (siehe Materialtabelle) und 40 μL 85% Ethanol zu 10 μL PCR-Probe in ein 1,5-ml-Röhrchen geben und durch kräftiges Pipettieren etwa 8x-10x mischen.
    3. Inkubieren Sie die Mischung bei RT für 5 min und legen Sie das 1,5 ml Röhrchen für 5 min auf den magnetischen Trennständer. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und fügen Sie 100 μL 85% Ethanol hinzu.
    4. Verwerfen Sie den Überstand und wiederholen Sie Schritt 4.3.3. 1x. Nehmen Sie die 1,5-ml-Röhrchen aus dem Magnetständer und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 10 min in einem Thermomischer, um das Ethanol zu trocknen.
    5. Die Beads mit 40 μL nukleasefreiem Wasser kräftig resuspendieren und bei RT 5 min inkubieren. Legen Sie das Röhrchen für 5 min auf den magnetischen Trennständer und führen Sie eine Sanger-Sequenzierung gemäß den veröffentlichten Berichten14,15 durch.
  4. Führen Sie eine Indelfrequenzbewertung durch ICE-Analysedurch 16 durch.
    1. Verwenden Sie Synthego (siehe Materialtabelle) für die ICE-Analyse.
    2. Laden Sie ab1-Dateien mit bearbeiteten und unbearbeiteten Proben und gRNA-Sequenzen hoch und klicken Sie auf Analyse, um die Häufigkeit der Indels zu erhalten.

5. Transplantation von geneditierten HSPCs

  1. Voraussetzung ist die handelsübliche NOD scid gamma mouse (NSG)17 und NOD. CG-KitW-41JTyr+PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ (NBSGW)18 Mäuse (siehe Materialtabelle) zur Knochenmarktransplantation.
    1. Wählen Sie für die Vorkonditionierung von NSG-Mäusen 6-8 Wochen alte weibliche Mäuse aus und trennen Sie sie durch verblindete Randomisierung in Kontroll- und Bearbeitungsgruppen.
    2. Setzen Sie die NSG-Mäuse in die Tortenkäfige und bestrahlen Sie 6-8 h vor der HSPC-Transplantation mit einem handelsüblichen Bestrahlungsgerät (siehe Materialtabelle) bei 3,5 Gy.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Mäuse vor der Bestrahlung zu wiegen, und Mäuse mit einem Gewicht von >20 g werden bestrahlt.
    3. Zur Vorkonditionierung von 6-8 Wochen alten männlichen und weiblichen NBSGW-Mäusen wird Busulfan (siehe Materialtabelle) durch intraperitoneale (IP) Injektion in einer Dosis von 12,5 mg/kg Körpergewicht 48 h vor der HSPC-Transplantation injiziert.
      HINWEIS: Die Busulfan-Konditionierung erhöht die Anpflanzung menschlicher HSPCs im Knochenmark der Maus und verringert die Notwendigkeit, große Dosen geneditierter HSPCs zu infundieren19. Der ideale Bereich der Busulfan-Dosis für die Konditionierung liegt zwischen 10 mg/kg und 15 mg/kg Körpergewicht. Erhöhte Dosierungen von Busulfan führen zu schweren Mortalitätsproblemen.
  2. Bereiten Sie die Zellsuspension für die Knochenmarktransplantation vor.
    1. Nach 10-minütiger Inkubation der geneditierten HSPCs im Nukleofektionsstreifen (siehe Schritt 3.2.7) wird die Zellsuspension auf 10 ml 1x PBS übertragen. Zählen Sie die Zellen mit Neubauers verbesserter Zellzählkammer10.
    2. Für die Infusion einer Maus 6 x 10 5 Zellen in einem 1,5 ml Röhrchen durch Zentrifugieren bei 200 x g für5 min bei RT pelletieren und den Überstand vorsichtig mit einer Pipette verwerfen, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 100 μL 1x PBS.
  3. Infusion der HSPCs durch Schwanzveneninjektion gemäß den folgenden Schritten.
    1. Setzen Sie die vorkonditionierte NSG- oder NBSGW-Maus in das Maus-Resieb ein (siehe Materialtabelle).
    2. Halten Sie den Mausschwanz und drücken Sie vorsichtig auf den Stecker, um die Maus zurückzuhalten. Wischen Sie den Mausschwanz vorsichtig mit 70% Ethanol ab. 100 μL der Zellsuspension in einer 31 G Insulinspritze aspirieren.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Blasen im Infusionsprodukt, indem Sie vorsichtig auf die Spritze klopfen oder den Kolben vorsichtig bewegen.
    3. Richten Sie das Licht der Infrarotlampe für 30-40 s auf den Schwanz und bedecken Sie den Körperbereich der Maus mit Falten aus Seidenpapier. Führen Sie den abgeschrägten Teil der Nadel vorsichtig in einem Winkel von 20° in die linke oder rechte Schwanzvene ein.
    4. Heben Sie den Schwanz mit dem linken Zeigefinger an, um ihn mit der Spritze in der planaren Achse zu halten. Drücken Sie den Kolben, um die Zellsuspension in die Vene zu infundieren. Üben Sie leichten Druck in der Nähe der durchstochenen Region mit Seidenpapier aus und ziehen Sie die Nadel heraus.
    5. Nach 30 s sanftem Druck nehmen Sie die Maus aus dem Behälter und bringen Sie sie in ihren Käfig.

6. Bewertung des kurzfristigen Engraftment-Potenzials

  1. Nach 4 Wochen menschlicher HSPC-Transplantation beurteilen Sie das kurzfristige Engraftment, indem Sie Blut über den orbitalen Venensinus in einem heparinisierten Röhrchen mit einer Pasteur-Pipette sammeln.
    1. Betäuben Sie das Tier vor der Probenentnahme mit Ketamin (90-120 mg/kg) und Xylazin (8-12 mg/kg) durch intraperitoneale (IP) Injektion.
      HINWEIS: Üben Sie vorsichtigen Druck auf die Hinterbeine der anästhesierten Maus aus, um den Gefühlsverlust zu bestätigen.
    2. Positionieren Sie das Tier nach der Narkose in ventraler Liege und schrubben Sie die Maus vorsichtig, um das Auge zu öffnen, wodurch die Augenkugel leicht hervorstehen kann.
    3. Führen Sie die Pasteur-Pipette vorsichtig in den medialen Knoten des Auges unter der Nickhaut in einem Winkel von 30°-45° ein. Nachdem Sie die Pasteur-Pipette in die richtige Position gebracht haben, üben Sie leichten Druck auf das Röhrchen aus und beginnen Sie, das Rohr sanft zu drehen.
      HINWEIS: Blut gelangt durch Kapillarwirkung in die Röhre, sobald der retroorbitale Plexus punktiert wird.
  2. Nachdem Sie 50-80 μL peripheres Blut gesammelt haben, ziehen Sie die Pipette vorsichtig aus dem medialen Canthus des Auges.
    1. Um die Blutung um die Augenhöhle zu stoppen, schließen Sie die Augenlider und üben Sie sanften Druck mit einem Stück Gaze aus.
  3. Färben Sie die Zellen mit entsprechenden Antikörpern (Tabelle 8) und inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln für 25-30 min bei RT.
  4. Für die RBC-Lyse werden der Zellsuspension 3 ml 1x RBC-Lysepuffer (Tabelle 7) zugegeben und 10 min in Eis inkubiert.
    1. Bei 200 x g 5 min bei RT zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette verwerfen. Wiederholen Sie Schritt 6.4. bis die Rötung des Pellets verschwindet.
    2. Fügen Sie 2 ml 1x PBS hinzu und zentrifugieren Sie bei 200 x g für 5 min bei RT, um die mit der RBC-Lyse verbundenen Zelltrümmer zu entfernen.
    3. Fügen Sie dem Pellet 150 μL 1x PBS hinzu und fahren Sie dann mit der Immunphänotypisierung für die Durchflusszytometrie fort, um den Prozentsatz der transplantierten menschlichen Zellen zu bestimmen7.

7. Bewertung des langfristigen Anpflanzungspotenzials

  1. Euthanasiere die Mäuse.
    1. Opfern Sie die transplantierten Mäuse in Woche 16 für die Transplantationsanalyse, indem Sie 100%CO2-Erstickung 20 für 1-2 min in den Mäusekäfig einführen.
    2. Bestätigen Sie die Euthanasie, indem Sie Herz- und Atemstillstand und das Fehlen von Muskelbewegungen mit leichtem Kneifen der Hinterbeine feststellen. Wenn beide Bedingungen erfüllt sind, entfernen Sie die Mäuse aus dem Käfig.
    3. Um den Chimärismus menschlicher Zellen zu bewerten, sammeln Sie die Zellen aus dem Knochenmark.
  2. Isolieren Sie Zellen aus dem Knochenmark, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Nach der Euthanasie machen Sie einen vertikalen Schnitt 1 cm über der Harnröhre und erstrecken Sie sich bis 1 cm unter das Zwerchfell. Schneiden Sie horizontal an den Ecken des eingeschnittenen Bereichs, um die Bauchregion weit zu öffnen.
    2. Sezieren Sie den Femur und die Tibia und entfernen Sie die am Femur und Tibia befestigten Weichteile mit einer Schere. Schrubben Sie vorsichtig mit Seidenpapier und machen Sie mit einem Skalpell ein kleines Loch mit einem Durchmesser von nicht mehr als 0,2 cm am Boden eines 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens.
    3. Entfernen Sie die proximalen Enden der Knochen mit einem Skalpell und legen Sie die Knochen mit der geschnittenen Seite in Richtung des Lochs des 0,5-ml-Mikrozentrifugationsröhrchens. Legen Sie das 0,5-ml-Röhrchen mit den Knochen in das 1,5-ml-Röhrchen mit 100 μL sterilem 1x PBS.
    4. Schließen Sie den Deckel, drehen Sie die Röhrchen für 3 min bei 1000 x g unter sterilen Bedingungen bei RT und entsorgen Sie die 0,5-ml-Röhrchen mit Knochen in einer leeren Markhöhle. Geben Sie 1 ml 1x PBS in das 1,5 ml Reaktionsröhrchen mit Knochenmark und resuspendieren Sie die Zellen etwa 10x vorsichtig mit einer 1 ml Pipette.
    5. Übertragen Sie 1 ml der Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen, das 9 ml RBC-Lysepuffer enthält. Inkubieren Sie die Zellen in Eis für 7 min mit sanfter Inversion der Röhrchen alle 2 min.
    6. Nach 7 min bei 200 x g für 5 min bei RT mit einer Beschleunigung von 9 m/s² und einer Abbremsung von 7 m/s² zentrifugieren. Wiederholen Sie Schritt 7.2.5. bis ein klares hellweißes Pellet beobachtet wird.
    7. Resuspendieren Sie die Zellen mit 10 mL sterilem 1x DPBS und filtrieren Sie die Knochenmarkzellsuspension mit einem 40 μm Zellsieb auf einem 15 ml Röhrchen. Spülen Sie das Zellsieb mit 2 ml 1x PBS 2x, um den Verlust von Zellen zu vermeiden.
    8. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 200 x g, RT, und verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. Resuspendieren Sie die Zellen mit 10 ml IMDM mit DNase-I in einer Arbeitskonzentration von 100 μg/ml.
    9. Nehmen Sie 1 x 106 mononukleäre Zellen in einem FACS-Röhrchen zur Engraftment-Analyse mittels Durchflusszytometrie. Um die Gen-Editing-Häufigkeit in transplantierten mononukleären Zellen des Knochenmarks zu bestimmen, pelletieren Sie 1 x 106 mononukleäre Zellen bei 11.000 x g für 5 min bei RT und verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette.

8. Immunphänotypisierung

  1. Die Knochenmarkzellen mit 1,5 μL eines gereinigten rekombinanten humanen Fc-Proteins (siehe Materialtabelle) für 15 min bei 4 °C inkubieren, bevor sie mit Antikörpern angefärbt werden.
    HINWEIS: Das hier verwendete menschliche Fc-Protein ist so formuliert, dass es die unspezifische Antikörperfärbung blockiert, die durch Rezeptoren für IgG verursacht wird; Dadurch erhöht es die Spezifität der Antikörpermarkierung 7,21,22. Führen Sie vor der Antikörperfärbung der Zielzellen eine Antikörpertitration durch. Es wird dringend empfohlen, FMO-Kontrollen und Isotypkontrollen einzubeziehen, während Sie an mehrfarbigen durchflusszytometrischen Analysen arbeiten.
  2. Um den Prozentsatz der menschlichen Zelltransplantation mittels Durchflusszytometer zu bestimmen, nehmen Sie 1 x 106 mononukleäre Zellen in einem FACS-Röhrchen und färben Sie die Zellen wie in Tabelle 8 angegeben.
  3. Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln für 25-30 min bei RT. Zentrifugieren Sie bei 200 x g für 5 min bei RT und verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette.
  4. Erfassen Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer, Gate der Zellpopulation (P1) unter Verwendung von Vorwärts- (FSC) und Seitenstreuungen (SSC) von mononukleären Zellen und passen Sie die Spannung entsprechend der Zellpopulation an. Erfassung von 50.000 Zellereignissen in der P1-Population.
  5. Um menschliche Leukozytenpopulationen im Knochenmark der Maus zu analysieren, werden die menschlichen CD45+ -Zellen und die Maus-CD45.1 mithilfe einer Durchflusszytometrie-Datenanalysesoftware aus der P1-Zellpopulation gekömmt (siehe Materialtabelle).
  6. Berechnen Sie die Anpflanzung menschlicher Zellen mit der folgenden Formel8:
    % des Engraftments = (% hCD45) / (% hCD45 + % mCD45) × 100.
    HINWEIS: Der Schwellenwert für die menschliche Anpflanzung wurde als 0,1% positiv für CD45 angesehen.
  7. Analysieren Sie außerdem den Prozentsatz der hCD34+-Zellen aus menschlichen CD45+-Zellen, um die Langzeit-Repopulationszellen zu bewerten. Um die Multilineage-Rekonstitution der transplantierten menschlichen Zellen zu beurteilen, färben Sie 100 μL Zellsuspension gemäß Tabelle 9.
    HINWEIS: Die Antikörper müssen vor den Experimenten titriert werden.
  8. Mit der Durchflusszytometrie-Software wird das hCD45 aus der P1-Zellpopulation gegleiten und aus hCD45 der Prozentsatz von hCD19, hCD3 und hCD13 (lymphatische und myeloische Untergruppen) quantifiziert.

9. Bewertung der Gen-Editing-Häufigkeit in gepfropften mononukleären Zellen des Knochenmarks

  1. Zum mononukleären Knochenmarkzellpellet 50 μL Schnellextraktlösung (siehe Materialtabelle) für 5 x 105 Zellen hinzufügen und das Pellet resuspendieren.
  2. Die Mischung in einem Thermocycler bei 68 °C für 30 min inkubieren. Nach einer kurzen Drehung die Mischung in einem Thermocycler bei 98 °C für 10 min inkubieren.
  3. Messen Sie die Konzentration der DNA im Rohlysat mit einem Spektralphotometer. Führen Sie die Schritte 4.2.-4.4 aus. zur Validierung der Gen-Editing-Häufigkeit mittels ICE-Analyse 8,15.

Ergebnisse

Die vorliegende Studie identifiziert ideale HSPC-Kulturbedingungen, die die Retention von CD34+CD133+CD90+ HSCs in Ex-vivo-Kultur erleichtern. Um die Kulturanreicherung von HSZ zusammen mit der verbesserten Erzeugung genmodifizierter HSCs zu demonstrieren, werden die optimierten Verfahren für PBMNC-Isolierung, CD34+-Zellreinigung, Kultur, Geneditierung, Transplantation, Charakterisierung von Engraftment und genmodifizierte Zellen in vivo bereitgestellt (

Diskussion

Das erfolgreiche Ergebnis der HSPC-Gentherapie hängt hauptsächlich von der Qualität und Quantität der transplantierbaren HSZ im Transplantat ab. Die funktionellen Eigenschaften von HSZ werden jedoch während der Vorbereitungsphase von Gentherapieprodukten stark beeinträchtigt, einschließlich durch In-vitro-Kultur und Toxizität im Zusammenhang mit dem Genmanipulationsverfahren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir ideale HSPC-Kulturbedingungen identifiziert, die die Stammheit von CD34+<...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

Die Autoren möchten die Mitarbeiter der Durchflusszytometrie-Einrichtung und der Tiereinrichtung des CSCR würdigen. A. C. wird durch ein ICMR-SRF-Stipendium finanziert, K. V. K. wird durch ein DST-INSPIRE-Stipendium und P. B. durch ein CSIR-JRF-Stipendium finanziert. Diese Arbeit wurde vom Department of Biotechnology der indischen Regierung finanziert (Fördernummer BT/PR26901/MED/31/377/2017 und BT/PR31616/MED/31/408/2019)

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
4D-Nucleofector® X UnitLONZA BIOSCIENCEAAF-1003X
4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips)LONZA BIOSCIENCEV4XP-3032
Antibiotic-Antimycotic (100X)THERMO SCIENTIFIC15240096
Anti-human CD45 APCBD BIOSCIENCE 555485 
Anti-human CD13 PEBD BIOSCIENCE555394
Anti-human CD19 PerCPBD BIOSCIENCE340421
Anti-human CD3 PE-Cy7BD BIOSCIENCE557749
Anti-human CD90 APCBD BIOSCIENCE561971
Anti-human CD133/1 Miltenyibiotec130-113-673
Anti-human CD34 PEBD BIOSCIENCE348057
Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5BD BIOSCIENCE560580
Blood Irradator-2000 BRIT (Department of Biotechnology, India)BI 2000 
Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates)NUNC (THERMO SCIENTIFIC)140675
CrysoStor CS10BioLife solutions#07952
BusulfanCELON LABS (60mg/10mL)- 
Guide-it Recombinant Cas9TAKARA BIO632640
Cas9-eGFPSIGMAC120040 
 Centrifuge tube-15mlCORNING430790
 Centrifuge tube-50mlNUNC (THERMO SCIENTIFIC)339652
DMSOMPBIO219605590
DNAaseSTEMCELL TECHNOLOGIES6469
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1XHYCLONESH30028.02
EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit IISTEMCELL TECHNOLOGIES17856
EasySep magnetSTEMCELL TECHNOLOGIES18000
Electrophoresis unitORANGE INDIAHDS0036
FBSTHERMO SCIENTIFIC10270106
Flow cytometer – ARIA IIIBD BIOSCIENCE- 
FlowJo BD BIOSCIENCE -
Flt3-LPEPROTECH300-19-1000
Gel imaging systemCELL BIOSCIENCES11630453
HighPrep DTR reagentMAGBIOGENOMICSDT-70005
Human BD Fc BlockBD BIOSCIENCE553141
IL6PEPROTECH200-06-50
IMDM mediaTHERMO SCIENTIFIC12440053
Infrared lampMURPHY-
Insulin syringe 6mm 31GBD BIOSCIENCE324903
KetamineKETMIN 50-
Loading dye 6XTAKARA BIO9156
LymphoprepSTEMCELL TECHNOLOGIES7851
Mice RestrainerAVANTORTV-150
Nano drop spectrophotometerTHERMO SCIENTIFICND-2000C
Neubauer cell counting chamberROHEM INSTRUMENTSCC-3073
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)The Jackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:005557
NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW)The Jackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:026622
Nunc delta 6-well plateTHERMO SCIENTIFIC140675
Polystyrene round-bottom tubeBD352008
P3 primary cell Nucleofection solutionLONZA BIOSCIENCEPBP3-02250
Pasteur pipetteFISHER SCIENTIFIC13-678-20A
PCR clean-up kitTAKARA BIO740609.25
Mouse Pie CageFISCHER SCIENTIFIC50-195-5140
polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm)STEMCELL TECHNOLOGIES38007
Primer3Whitehead Institute for Biomedical Researchhttps://primer3.ut.ee/
QuickExtract™ DNA Extraction SolutionLucigenQE09050
ReserveratrolSTEMCELL TECHNOLOGIES72862
SCFPEPROTECH300-07-1000
SFEM-IISTEMCELL TECHNOLOGIES9655
sgRNASYNTHEGO- 
SPINWINTARSON1020
StemReginin 1STEMCELL TECHNOLOGIES72342
ICE analysis toolSYNTHEGOhttps://ice.synthego.com/
Tris-EDTA buffer solution (TE) 1XSYNTHEGOSupplied with gRNA 
ThermocyclerAPPLIED BIOSYSTEMS4375305
TPOPEPROTECH300-18-1000
Trypan blueHIMEDIA LABSTCL046
UM171STEMCELL TECHNOLOGIES72914
UM729STEMCELL TECHNOLOGIES72332
XylazineXYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED-

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