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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una procedura di coltura ottimizzata di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) per l'attecchimento robusto di cellule geneticamente modificate in vivo.

Abstract

CRISPR / Cas9 è uno strumento di editing genetico altamente versatile ed efficiente adottato ampiamente per correggere varie mutazioni genetiche. La fattibilità della manipolazione genica delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) in vitro rende le HSPC una cellula bersaglio ideale per la terapia genica. Tuttavia, le HSPC perdono moderatamente il loro potenziale di attecchimento e ripopolamento multilineare in coltura ex vivo . Nel presente studio sono descritte condizioni di coltura ideali che migliorano l'attecchimento di HSPC e generano un aumento del numero di cellule geneticamente modificate in vivo. Il rapporto attuale mostra le condizioni di coltura in vitro ottimizzate, tra cui il tipo di terreno di coltura, l'integrazione unica di cocktail di piccole molecole, la concentrazione di citochine, le piastre di coltura cellulare e la densità di coltura. Inoltre, viene fornita una procedura ottimizzata di modifica genetica HSPC, insieme alla convalida degli eventi di modifica genetica. Per la convalida in vivo , vengono visualizzati l'infusione di HSPCs geneticamente modificata e l'analisi post-attecchimento nei destinatari di topo. I risultati hanno dimostrato che il sistema di coltura ha aumentato la frequenza delle HSC funzionali in vitro, con conseguente robusto attecchimento di cellule geneticamente modificate in vivo.

Introduzione

L'inaccessibilità ai donatori compatibili con l'antigene leucocitario umano (HLA) in contesti di trapianto allogenico e il rapido sviluppo di strumenti di ingegneria genetica altamente versatili e sicuri rendono il trapianto di cellule staminali ematopoietiche autologhe (HSCT) una strategia di trattamento curativo per le malattie ereditarie del sangue 1,2. La terapia genica con cellule staminali e progenitrici ematopoietiche autologhe (HSPC) comporta la raccolta di HSPC dei pazienti, la manipolazione genetica, la correzione delle mutazioni che causano malattie e il trapianto di HSPC geneticamente corretti nel paziente 3,4. Tuttavia, l'esito positivo della terapia genica si basa sulla qualità dell'innesto geneticamente modificato trapiantabile. Le fasi di manipolazione genica e la coltura ex vivo delle HSPC influenzano la qualità del trapianto diminuendo la frequenza delle cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (LT-HSCs), rendendo necessaria l'infusione di grandi dosi di HSPC manipolate genicamente 2,5,6.

Diverse piccole molecole, tra cui SR1 e UM171, sono attualmente impiegate per espandere le HSPC del sangue del cordone ombelicale in modo robusto 7,8. Per le HSPC adulte, a causa della maggiore resa cellulare ottenuta alla mobilizzazione, non è richiesta una robusta espansione. Tuttavia, mantenere la staminalità delle HSPC isolate in coltura ex vivo è fondamentale per le sue applicazioni di terapia genica. Pertanto, un approccio incentrato sull'arricchimento in coltura delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) viene sviluppato utilizzando una combinazione di piccole molecole: resveratrolo, UM729 e SR1 (RUS)7. Le condizioni di coltura ottimizzate di HSPC promuovono l'arricchimento delle HSC, con conseguente aumento della frequenza di HSC geneticamente modificate in vivo, e riducono la necessità di manipolare genicamente grandi dosi di HSPC, facilitando approcci di terapia genica economicamente vantaggiosi8.

Qui viene descritto un protocollo completo per la coltura di HSPC, insieme all'infusione e all'analisi di cellule geneticamente modificate in vivo.

Protocollo

Gli esperimenti in vivo su topi immunodeficienti sono stati approvati ed eseguiti seguendo le linee guida dell'Institute Animal Ethics Committee (IAEC), Christian Medical College, Vellore, India. I campioni di sangue periferico mobilitati con fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF) sono stati raccolti da donatori umani sani con il consenso informato dopo aver ottenuto l'approvazione dell'Institutional Review Board (IRB).

1. Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNC) e purificazione delle cellule CD34 +

  1. Eseguire l'isolamento PBMNC seguendo i passaggi seguenti.
    NOTA: Per la coltura HSPC in vitro e l'editing genetico, iniziare con almeno 1 x 106 HSPC/gruppo è l'ideale. Per l'analisi dell'attecchimento in vivo, un numero di cellule di partenza di almeno 5 x 10 6 HSPC/gruppo è ideale se un gruppo contiene otto topi e ogni topo è infuso con almeno6 x 105 cellule. Per ottenere un numero sufficiente di PBMNC (~1 x 109) per la procedura, si raccomanda di iniziare con 20 ml di sangue periferico mobilizzato (mPB).
    1. Dopo la raccolta di mPB, diluire 20 mL di mPB con soluzione salina sterile tamponata fosfato 1x (PBS) in un rapporto 1: 1.
      NOTA: L'efficienza della mobilizzazione del G-CSF può variare tra gli individui9 e, pertanto, il numero di HSPC ottenuti da 20 ml di sangue mobilizzato varia tra i donatori.
    2. Aggiungere 10 mL di mezzo con gradiente di densità (Lymphoprep, vedere Tabella dei materiali) a un tubo da 50 mL e stratificare il sangue diluito attraverso i lati del tubo in un rapporto 1:2.
      NOTA: Inclinando il tubo da 50 mL con un angolo di 20° mentre si aggiunge il sangue diluito si impedisce che si mescoli con Lymphoprep, portando a una netta separazione dei componenti del sangue dopo la centrifugazione.
    3. Centrifugare a 600 x g per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) con un tasso di accelerazione di 1 m/s² e un tasso di decelerazione di 1 m/s². Scartare lo strato superiore (plasma) usando una pipetta sierologica e raccogliere il buffy coat presente all'interfase (PBMNC) sopra lo strato medio del gradiente di densità.
      NOTA: Aspirare il buffy coat con una pipetta sierologica ruotandola delicatamente sui lati del tubo. Evitare di raccogliere un volume maggiore di interfase mentre si aspira il buffy coat per prevenire la contaminazione da granulociti e globuli rossi.
    4. Trasferire i PBMNC in un nuovo tubo conico da 50 mL e diluire la sospensione cellulare con 1x PBS in rapporto 1:2.
      NOTA: Diluire la sospensione cellulare con 1x PBS in rapporto 1:4 se è stato raccolto un eccesso di interfase durante l'aspirazione del buffy coat.
    5. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente con una velocità di accelerazione di 9 m/s² e una velocità di decelerazione di 7 m/s² ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta sierologica. Aggiungere 30 ml di tampone di lisi dei globuli rossi ghiacciato (vedere Tabella 7) al pellet e incubare nel ghiaccio per 10 minuti. Mescolare invertendo il tubo ogni 2 minuti.
    6. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente con una velocità di accelerazione di 9 m/s² e una velocità di decelerazione di 7 m/s², ed eliminare il surnatante. Ripetere i passaggi 1.1.5.-1.1.6. fino a quando il rossore del pellet scompare. Risospendere il pellet con mezzi basali (IMDM, vedi Tabella dei materiali) ed eseguire un conteggio delle cellule usando il blu di tripano in una camera Neubauer10.
      NOTA: I PBMNC isolati possono essere immediatamente utilizzati per purificare gli HSPC CD34+. In alternativa, i PBMNC possono essere crioconservati e rianimati ogni volta che è necessario per l'arricchimento di CD34+. Per la crioconservazione, centrifugare 5 x 108 cellule a 200 x g per 5 minuti e aggiungere 4 ml di mezzi criogenici contenenti IMDM: FBS: DMSO (vedi tabella dei materiali) nel rapporto di 7:2:1.
    7. Trasferire i flaconcini in un criorefrigeratore da 1 °C e conservarli a -80 °C per un massimo di 12 ore. Trasferire e conservare i crioviali in un contenitore di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
  2. Rianimare i PBMNC crioconservati.
    1. Scongelare a metà i crioviali a bagnomaria a 37 °C ruotando delicatamente per <1 min. Trasferire la sospensione cellulare del crioviale in una provetta da 50 mL contenente IMDM in rapporto 1:10.
    2. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente con una velocità di accelerazione di 9 m/s² e una velocità di decelerazione di 7 m/s² e scartare il surnatante utilizzando una pipetta sierologica.
  3. Purificare le cellule CD34+ dalle PBMNC seguendo i passaggi seguenti.
    1. Preparare il tampone di purificazione con 1x PBS sterile contenente siero fetale fetale filtrato al 2% (FBS). Risospendere il pellet della cella PBMNC nel tampone secondo la Tabella 1.
      Nota : il buffer deve essere Ca++ e Mg++ libero.
    2. Trasferire la sospensione cellulare contenente 1 x 108-5 x 108 cellule di PBMNC freschi o crioconservati nel tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: Aggiungere DNasi (vedere Tabella dei materiali) ad una concentrazione finale di 100 μg/mL alla sospensione cellulare per evitare l'aggregazione cellulare. Abbiamo utilizzato un kit disponibile in commercio per la purificazione CD34 contenente Human CD34 Positive Selection Cocktail e Dextran Rapid Spheres (vedi Tabella dei materiali).
    3. Aggiungere Human CD34 Positive Selection Cocktail disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) alla concentrazione di 100 μL/mL di cellule e risospendere delicatamente.
    4. Incubare a RT per 30 minuti e risospendere delicatamente la sospensione cellulare ogni 5 minuti. Aggiungere 50 μL/mL di Sfere rapide destrane disponibili in commercio (vedere la tabella dei materiali) e risospendere delicatamente.
      NOTA: Vortice le sfere di destrano ad alta velocità per 5 s per garantire che le particelle appaiano uniformemente disperse e quindi aggiungerle alle celle.
    5. Incubare a RT per 15 minuti e risospendere delicatamente la sospensione cellulare ogni 5 minuti. Portare la sospensione cellulare ad un volume totale di 2,5 ml con tampone di purificazione e risospenderla delicatamente.
    6. Posizionare il tubo in un magnete immunomagnetico privo di colonne disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) e incubare per 5 minuti a RT. Dopo l'incubazione, invertire il magnete e scartare il surnatante in un movimento continuo.
      NOTA: Le cellule CD34+ marcate con Dextran Rapid Spheres rimangono attratte ai lati del tubo dal campo magnetico. Il tubo deve essere tenuto in posizione invertita per 2-3 s. Evitare di tremare o cancellare le gocce che rimangono appese alla bocca del tubo.
    7. Rimuovere il tubo dal magnete e aggiungere 2,5 ml di tampone di purificazione. Ripetere i passaggi 1.3.6-1.3.7 cinque volte.
      NOTA: Durante l'aggiunta del tampone di purificazione, posizionare il tubo ad angolo acuto e aggiungere tampone ruotando il tubo, poiché le celle potrebbero aderire alle pareti superficiali mentre si inverte il magnete.
    8. Dopo aver completato cinque lavaggi, rimuovere il tubo dal magnete, aggiungere 4 ml di 1x PBS sterile e risospendere la sospensione cellulare. Trasferire la sospensione cellulare nella provetta da centrifuga da 15 mL e portarla a 10 mL con 1x PBS. Eseguire un conteggio delle cellule utilizzando il blu di tripano in una camera di Neubauer10.
    9. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a RT (accelerazione ~9 m/s², decelerazione ~7 m/s²) ed eliminare il surnatante con una pipetta. Per coltivare le HSPC, risospendere le cellule nei terreni di coltura HSPC, come indicato nel passaggio 2.1.
      NOTA: Gli eccessi delle HSPC purificate sono stati crioconservati in un mezzo di crioconservazione disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) ad una densità di 9 x 106 cellule/ml dopo aver coltivato gli HSPC per 12 ore in terreni di coltura HSPC.
  4. Rivitalizzare le HSPC crioconservate.
    1. Scongelare i crioviali per <1 min a bagnomaria a 37 °C ruotando delicatamente. Trasferire la sospensione cellulare nel crioviale in una provetta da 50 ml.
    2. Aggiungere l'1% di BSA risospeso in 1x PBS goccia a goccia con agitazione costante e portarlo a 20 ml. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente con una velocità di accelerazione di 9 m/s² e una velocità di decelerazione di 7 m/s² ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta sierologica.
    3. Ripetere il passaggio 1.4.2. 1x. Risospendere le cellule nei terreni di coltura HSPC e nella coltura come descritto al punto 2.1.

2. Coltura in vitro di HSPC purificati

  1. Preparare i terreni di coltura utilizzando SFEM-II con SCF (240 ng/mL), FLT3 (240 ng/mL), TPO (80 ng/mL), IL6 (40 ng/mL) e 1x antibiotico-antimicotico (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: I terreni di coltura preparati al momento sono altamente raccomandati. Tuttavia, il supporto può essere conservato a 4 °C per un massimo di 24 ore dopo la preparazione.
  2. Risospendere il pellet CD34+ con i terreni di coltura, aggiungere 3 μL di cocktail RUS/mL di terreno (Resveratrolo, 10 μM; UM729, 500 nM; StemReginin-1, 750 nM; vedi Tabella dei materiali) e coltura delle cellule a 37 °C con 5% di CO2.
    NOTA: UM171 (10 nm) può essere utilizzato per sostituire UM729 (500 nM) poiché entrambi hanno effetti simili sul mantenimento della stemness HSPC7. I flaconcini non possono essere congelati più di due volte.
  3. Inizialmente, seminare le cellule purificate ad una confluenza di 5 x 105/mL in piastre a 6 pozzetti trattate con superficie delta disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali) per rimuovere le cellule aderenti.
  4. Riseminare le cellule nella sospensione ad una confluenza di 2 x 105 cellule/ml in una nuova piastra a 6 pozzetti dopo 6 ore di purificazione.
  5. Caratterizzare la staminalità delle HSPC utilizzando la citometria a flusso prima dell'editing genetico.
    1. Per l'analisi della citometria a flusso, prelevare 1 x 105 cellule in 100 μL di 1x PBS e aggiungere 3 μL (75 ng) di CD34 PE, 4 μL (100 ng) di FITC CD133 e 4 μL (100 ng) di APC CD90 (vedere Tabella dei materiali).
    2. Incubare il tubo a RT per 20 minuti al buio. Lavare le cellule con 2 ml di 1x PBS 2x e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a RT. Scartare il surnatante con una pipetta, risospendere il pellet cellulare con 150 μL di 1x PBS e acquisirlo in citometria a flusso.
      NOTA: Se la percentuale di cellule CD34+ è <90%, aumentare il numero di lavaggi fino a sei volte nel passaggio 1.3.7. Semare le HSPC purificate in terreni di coltura e, dopo 6 ore, raccogliere solo le cellule nella sospensione. La maggior parte delle cellule CD34- aderiscono alla piastra di coltura.

3. Editing genetico delle HSPC

  1. Eseguire la ricostituzione dell'RNA guida.
    NOTA: SgRNA sintetico con modificazioni del fosforotioato mirate al locus CCR5 sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).
    1. Per la ricostituzione, impostare il termomiscelatore a 37 °C e preriscaldare il tampone 1x TE (vedere Tabella dei materiali) a 37 °C per 10 minuti. Centrifugare il flaconcino di sgRNA sinteticamente modificato chimicamente a 11.000 x g per 1 minuto a 4 °C.
    2. Al flaconcino di sgRNA contenente 1,5 nM di sgRNA liofilizzato, aggiungere 15 μL di tampone 1x TE, ottenendo una concentrazione finale di 100 pM/μL. Risospendere delicatamente fino a 5x, ruotando la punta intorno agli angoli.
    3. Incubare nel termomiscelatore a 37 °C per 30-40 s con agitazione minima. Dopo un breve spin, raccogliere 15 μL di sgRNA e conservare come 1 μl di aliquote (100 pM/μL) a -80 °C per un uso futuro fino a 1 anno.
      NOTA: Evitare ripetuti congelamenti. Si raccomanda un massimo di un ciclo di congelamento-scongelamento di gRNA aliquotato.
  2. Eseguire la nucleofezione seguendo i passaggi seguenti.
    1. Il giorno 3 della coltura, contare le cellule utilizzando la camera di conteggio delle cellule migliorata10 di Neubauer.
    2. Per la preparazione dell'RNP (per il nucleofecting di 2 x 10 5 cellule), prelevare 1 μL di sgRNA mirato al gene CCR5 (100 pM) in una provetta da0,5 mL e aggiungere 2,65 μL di Cas9 (50 pM) ruotando delicatamente attorno al fondo del flaconcino. Incubare a RT per 10 min.
      NOTA: sequenza gRNA: (CCR5) TGACATCAATTATTATACATCGG.
    3. Per la preparazione del tampone, aggiungere 16,4 μL di soluzione cellulare primaria P3 e 3,6 μL di supplemento, forniti con il kit di nucleofezione commerciale (vedi Tabella dei materiali), e incubare a RT per 10 minuti. Preparare terreni di coltura (fase 2.1.) e preincubarli a 37 °C nella piastra di coltura prima della nucleofezione.
    4. Pellet 2 x 10 5 celle centrifugando a 200 x g per5 minuti a RT e scartare delicatamente il surnatante usando una pipetta senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet con 20 μL del tampone preparato al punto 3.2.3. e risospenderlo delicatamente.
    5. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare con il complesso RNP preparato (fase 3.2.2.) senza bolle d'aria. Trasferire la sospensione sulla striscia di nucleofezione commerciale (vedere Tabella dei materiali) e selezionare il codice di impulso DZ100 per elettroporare le cellule usando il nucleofector 4D (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: Il volume finale della sospensione cellulare, compresi i componenti tampone e RNP, non deve superare più di 27 μL/elettroporazione.
    6. Per il controllo sperimentale, pellet 2 x 10 5 HSPC non modificati centrifugando a 200 x g per5 minuti a RT e risospendere il pellet con 20 μL del tampone preparato nella fase 3.2.3. senza complesso RNP.
    7. Aggiungere 100 μL di terreno di coltura preincubato (fase 3.2.3.) alle cellule elettroporate e lasciare le cellule indisturbate per 10 minuti nella striscia di nucleofezione a RT. Dopo 10 minuti di incubazione, trasferire il contenuto nella piastra di coltura secondo i requisiti sperimentali.
      NOTA: Questo protocollo può essere applicato alla rottura mirata mediata da non-homologous end joining (NHEJ) di qualsiasi locus genomico utilizzando gRNA target-specific. Lo stesso protocollo può essere applicato per introdurre grandi delezioni includendo il doppio gRNA nel passo 3.2.2. 11. Inoltre, dopo 10 minuti di incubazione RNP, lo stesso protocollo può essere utilizzato per l'editing genetico basato sulla riparazione diretta dall'omologia (HDR) quando viene fornito con un modello di donatore12. Il protocollo è stato convalidato dall'interruzione mirata di AAVS1, pseudo β-globina, β-globina e CCR5 locus 7,8.

4. Validazione di eventi di modifica genetica in HSPCs

  1. Eseguire l'estrazione del DNA.
    1. Dopo 72 ore dopo la nucleofezione, eseguire un conteggio delle cellule utilizzando il blu di tripano in una camera di Neubauer. Raccogliere 1 x 105 HSPC geneticamente modificati per l'estrazione del DNA.
    2. Centrifugare le cellule a 11.000 x g per 5 minuti a RT ed eliminare il surnatante usando una pipetta. Risospendere il pellet con 1 mL di 1x PBS e ripetere la centrifugazione e scartare il surnatante. Al pellet, aggiungere 20 μL di soluzione di estrazione rapida (vedi Tabella dei materiali) per 1 x 105 celle e risospendere il pellet.
    3. Incubare la miscela in un termociclatore a 68 °C per 30 min. Dopo una breve centrifuga, incubare la miscela in un termociclatore a 98 °C per 10 minuti. Misurare la concentrazione di DNA nel lisato grezzo utilizzando uno spettrofotometro13.
  2. Eseguire l'amplificazione del locus geneticamente modificato mediante PCR.
    1. Utilizzando Primer3 (vedi Tabella dei materiali), progettare i primer specifici del locus che attraversano il sito di rottura a doppio filamento (DSB) con dimensioni dell'amplicone comprese tra 400-700 bp (Tabella 2).
      NOTA: Primer3 è uno strumento open source basato sul web per la progettazione di primer PCR.
    2. Preparare la miscela di reazione come indicato nella tabella 3 e far funzionare il termociclatore con le condizioni di ciclo menzionate nella tabella 4. Per confermare l'amplificazione del locus desiderato, mescolare 5 μL di prodotto PCR con colorante di carico 6x e caricare sull'elettroforesi su gel di agarosio al 2% realizzata utilizzando tampone TAE.
      NOTA: i componenti del buffer TAE sono riportati nella tabella 7.
    3. Eseguire per 30-40 minuti a 100 V e rilevare l'amplicone utilizzando un sistema di imaging in gel (vedere la tabella dei materiali). Secondo il protocollo del produttore di purificazione PCR (vedi Tabella dei materiali), pulire il prodotto PCR amplificato.
    4. Misurare la concentrazione del prodotto PCR purificato utilizzando uno spettrofotometro a nanogoccia (vedi Tabella dei materiali).
  3. Eseguire il sequenziamento Sanger e la rimozione del terminatore di colorante libero seguendo i passaggi seguenti.
    1. Preparare la miscela di reazione come mostrato nella tabella 5. Far funzionare il termociclatore con le condizioni di ciclo indicate nella tabella 6.
    2. Aggiungere 10 μL di reagente DTR HighPrep (vedere Tabella dei materiali) e 40 μL di etanolo all'85% a 10 μL di campione PCR in una provetta da 1,5 mL e mescolare mediante pipettaggio vigoroso circa 8x-10x.
    3. Incubare la miscela a RT per 5 minuti e posizionare il tubo da 1,5 mL sul supporto di separazione magnetica per 5 minuti. Rimuovere il surnatante con una pipetta e aggiungere 100 μL di etanolo all'85%.
    4. Eliminare il surnatante e ripetere il punto 4.3.3. 1x. Estrarre i tubi da 1,5 mL dal supporto magnetico e incubarli a 37 °C per 10 minuti in un termomiscelatore per asciugare l'etanolo.
    5. Risospendere vigorosamente le sfere con 40 μL di acqua priva di nucleasi e incubare a RT per 5 minuti. Posizionare il tubo sul supporto di separazione magnetica per 5 minuti ed eseguire il sequenziamento Sanger seguendo i rapporti pubblicati14,15.
  4. Eseguire una valutazione della frequenza indel mediante analisi ICE16.
    1. Utilizzare Synthego (vedere Tabella dei materiali) per l'analisi ICE.
    2. Carica file ab1 di campioni modificati e non modificati e sequenze di gRNA e fai clic su analizza per ottenere la frequenza degli Indel.

5. Trapianto di HSPC geneticamente modificati

  1. Precondizionare il NOD scid gamma mouse (NSG)17 e NOD disponibili in commercio. CG-KitW-41JTyr+PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ (NBSGW)18 topi (vedi Tabella dei materiali) per il trapianto di midollo osseo.
    1. Per il precondizionamento dei topi NSG, scegli topi femmina di 6-8 settimane e separali in gruppi di controllo e modificati mediante randomizzazione in cieco.
    2. Posizionare i topi NSG nelle gabbie per torte e irradiare a 3,5 Gy utilizzando un irradiatore disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) 6-8 ore prima del trapianto HSPC.
      NOTA: Si raccomanda di pesare i topi prima dell'irradiazione e i topi di peso >20 g saranno sottoposti a irradiazione.
    3. Per il precondizionamento di topi NBSGW maschi e femmine di 6-8 settimane, iniettare busulfan (vedere Tabella dei materiali) mediante iniezione intraperitoneale (IP) alla dose di 12,5 mg/kg di peso corporeo 48 ore prima del trapianto di HSPC.
      NOTA: Il condizionamento di Busulfan aumenta l'attecchimento delle HSPC umane nel midollo osseo del topo e diminuisce la necessità di infondere grandi dosi di HSPC geneticamente modificate19. L'intervallo ideale della dose di busulfan per il condizionamento è compreso tra 10 mg/kg e 15 mg/kg di peso corporeo. L'aumento dei dosaggi di busulfan comporterà gravi problemi di mortalità.
  2. Preparare la sospensione cellulare per il trapianto di midollo osseo.
    1. Dopo 10 minuti di incubazione delle HSPC geneticamente modificate nella striscia di nucleofezione (vedere punto 3.2.7.), trasferire la sospensione cellulare a 10 mL di 1x PBS. Contare le celle utilizzando la camera di conteggio delle cellule migliorata di Neubauer10.
    2. Per l'infusione di un topo, pellet 6 x 10 5 celle in una provetta da 1,5 mL centrifugando a 200 x g per5 minuti a RT e scartare delicatamente il surnatante usando una pipetta senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet cellulare con 100 μL di 1x PBS.
  3. Infondere gli HSPC mediante iniezione di vena caudale seguendo i passaggi seguenti.
    1. Posizionare il mouse NSG o NBSGW precondizionato nel sistema di ritenuta del mouse (vedere Tabella dei materiali).
    2. Tenere la coda del mouse e spingere delicatamente la spina per trattenere il mouse. Pulire delicatamente la coda del topo con etanolo al 70%. Aspirare 100 μL della sospensione cellulare in una siringa da insulina da 31 G.
      NOTA: Evitare rigorosamente la formazione di bolle nel prodotto per infusione picchiettando delicatamente la siringa o muovendo delicatamente lo stantuffo.
    3. Dirigere la luce dalla lampada a infrarossi sulla coda per 30-40 secondi, coprendo l'area del corpo del mouse con pieghe di carta velina. Inserire delicatamente la parte smussata dell'ago nella vena caudale sinistra o destra con un angolo di 20°.
    4. Sollevare la coda con l'indice sinistro per mantenerla nell'asse planare con la siringa. Spingere lo stantuffo per infondere la sospensione cellulare nella vena. Applicare una leggera pressione vicino alla regione forata con carta velina ed estrarre l'ago.
    5. Dopo 30 secondi di applicazione di una leggera pressione, rimuovere il mouse dal sistema di ritenuta e trasferirlo nella sua gabbia.

6. Valutazione del potenziale di attecchimento a breve termine

  1. Dopo 4 settimane di trapianto umano di HSPC, valutare l'attecchimento a breve termine raccogliendo il sangue attraverso il seno venoso orbitale in un tubo eparinizzato utilizzando una pipetta Pasteur.
    1. Anestetizzare l'animale con la formulazione di ketamina (90-120 mg/kg) e xilazina (8-12 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale (IP) prima della raccolta del campione.
      NOTA: Applicare delicatamente pressione sugli arti posteriori del topo anestetizzato per confermare la perdita di sensibilità.
    2. Dopo l'anestetizzazione, posizionare l'animale in posizione ventrale sdraiata e collottola delicatamente il topo per aprire l'occhio, che consente al globo dell'occhio di sporgere leggermente.
    3. Inserire delicatamente la pipetta Pasteur nel canto mediale dell'occhio sotto la membrana nittante con un angolo di 30°-45°. Dopo aver posizionato la pipetta Pasteur nella posizione corretta, applicare una leggera pressione sul tubo e iniziare a ruotare delicatamente il tubo.
      NOTA: Il sangue entrerà nel tubo per azione capillare non appena il plesso retro-orbitale viene perforato.
  2. Dopo aver raccolto 50-80 μL di sangue periferico, prelevare delicatamente la pipetta dal canto mediale dell'occhio.
    1. Per interrompere l'emorragia intorno all'orbita dell'occhio, chiudere le palpebre e applicare una leggera pressione usando un pezzo di garza.
  3. Colorare le cellule con i rispettivi anticorpi (Tabella 8) e incubare le cellule al buio per 25-30 minuti a RT.
  4. Per la lisi dei globuli rossi, alla sospensione cellulare, aggiungere 3 mL di tampone di lisi 1x RBC (Tabella 7) e incubare per 10 minuti nel ghiaccio.
    1. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a RT ed eliminare il surnatante con una pipetta. Ripetere il passaggio 6.4. fino a quando il rossore del pellet scompare.
    2. Aggiungere 2 ml di 1x PBS e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a RT per rimuovere i detriti cellulari associati alla lisi dei globuli rossi.
    3. Aggiungere 150 μL di 1x PBS al pellet e quindi procedere con l'immunofenotipizzazione per citometria a flusso per valutare la percentuale di cellule umane innestate7.

7. Valutazione del potenziale di attecchimento a lungo termine

  1. Eutanasia dei topi.
    1. Sacrificare i topi trapiantati alla settimana 16 per l'analisi dell'attecchimento introducendo l'asfissia 20 al 100% di CO20 all'interno della gabbia dei topi per 1-2 minuti.
    2. Confermare l'eutanasia accertando l'arresto cardiaco e respiratorio e l'assenza di movimenti muscolari con un leggero pizzicamento degli arti posteriori. Se entrambe le condizioni sono soddisfatte, rimuovere i topi dalla gabbia.
    3. Per valutare il chimerismo delle cellule umane, raccogliere le cellule dal midollo osseo.
  2. Isolare le cellule dal midollo osseo seguendo i passaggi seguenti.
    1. Dopo l'eutanasia, praticare un'incisione verticale 1 cm sopra l'uretra ed estendere fino a 1 cm sotto il diaframma. Tagliare orizzontalmente agli angoli dell'area incisa per aprire ampiamente la regione addominale.
    2. Sezionare il femore e la tibia e rimuovere i tessuti molli attaccati al femore e alla tibia usando le forbici. Strofinare delicatamente con carta velina e praticare un piccolo foro con un diametro non superiore a 0,2 cm sul fondo di una provetta da microcentrifuga da 0,5 ml utilizzando un bisturi.
    3. Rimuovere le estremità prossimali delle ossa usando un bisturi e posizionare le ossa con il lato tagliato rivolto verso il foro del tubo di microcentrifugazione da 0,5 ml. Posizionare il tubo da 0,5 mL con le ossa nel tubo da 1,5 mL contenente 100 μL di 1x PBS sterile.
    4. Chiudere il coperchio, ruotare i tubi per 3 minuti a 1000 x g in condizioni sterili a RT e gettare i tubi da 0,5 ml contenenti ossa con una cavità midollare vuota. Aggiungere 1 mL di 1x PBS alla provetta di reazione da 1,5 mL contenente midollo osseo e risospendere delicatamente le cellule circa non meno di 10x utilizzando una pipetta da 1 mL.
    5. Trasferire 1 mL della sospensione cellulare in una provetta da 15 mL contenente 9 mL di tampone di lisi dei globuli rossi. Incubare le cellule nel ghiaccio per 7 minuti con una leggera inversione dei tubi ogni 2 minuti.
    6. Dopo 7 minuti, centrifugare a 200 x g per 5 minuti a RT con un'accelerazione di 9 m/s² e una deaccelerazione di 7 m/s². Ripetere il passaggio 7.2.5. fino a quando non si osserva un pellet bianco pallido chiaro.
    7. Risospendere le cellule con 10 ml di 1x DPBS sterile e filtrare la sospensione di cellule del midollo osseo utilizzando un filtro cellulare da 40 μm su un tubo da 15 ml. Risciacquare il filtro cellulare con 2 ml di 1x PBS 2x per evitare la perdita di cellule.
    8. Centrifugare per 5 minuti a 200 x g, RT, ed eliminare il surnatante usando una pipetta. Risospendere le cellule con 10 mL di IMDM con DNasi-I ad una concentrazione operativa di 100 μg/mL.
    9. Prelevare 1 x 106 cellule mononucleate in una provetta FACS per l'analisi dell'attecchimento mediante citometria a flusso. Per valutare la frequenza di editing genetico nelle cellule mononucleate del midollo osseo innestate, pellet 1 x 106 cellule mononucleate a 11.000 x g per 5 minuti a RT e scartare il surnatante usando una pipetta.

8. Immunofenotipizzazione

  1. Incubare le cellule del midollo osseo con 1,5 μL di una proteina Fc umana ricombinante purificata (vedere Tabella dei materiali) per 15 minuti a 4 °C prima di colorare con anticorpi.
    NOTA: La proteina Fc umana qui utilizzata è formulata per bloccare la colorazione anticorpale non specifica causata dai recettori per IgG; In tal modo, aumenta la specificità dell'etichettatura degli anticorpi 7,21,22. Prima della colorazione anticorpale delle cellule bersaglio, eseguire la titolazione degli anticorpi. Si consiglia vivamente di includere controlli FMO e controlli isotipo mentre si lavora sull'analisi citometrica a flusso multicolore.
  2. Per determinare la percentuale di attecchimento di cellule umane mediante citometro a flusso, prendere 1 x 106 cellule mononucleate in una provetta FACS e colorare le cellule come menzionato nella Tabella 8.
  3. Incubare le cellule al buio per 25-30 minuti a RT. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a RT e scartare il surnatante usando una pipetta.
  4. Acquisire le cellule da un citometro a flusso, controllare la popolazione cellulare (P1) utilizzando scatter in avanti (FSC) e laterali (SSC) di celle mononucleate e regolare la tensione in base alla popolazione cellulare. Acquisire 50.000 eventi cellulari nella popolazione P1.
  5. Per analizzare le popolazioni di leucociti umani nel midollo osseo di topo, eliminare le cellule CD45+ umane e CD45.1 di topo dalla popolazione di cellule P1 utilizzando un software di analisi dei dati di citometria a flusso (vedere Tabella dei materiali).
  6. Calcolare l'attecchimento delle cellule umane utilizzando la seguente formula8:
    % di attecchimento = (% hCD45) / (% hCD45 + % mCD45) × 100.
    NOTA: La soglia per l'attecchimento umano è stata considerata positiva allo 0,1% per CD45.
  7. Inoltre, analizzare la percentuale di cellule hCD34 + da cellule CD45 + umane per valutare le cellule di ripopolamento a lungo termine. Per valutare la ricostituzione multilineare delle cellule umane innestate, colorare 100 μL di sospensione cellulare seguendo la Tabella 9.
    NOTA: Gli anticorpi devono essere titolati prima degli esperimenti.
  8. Utilizzando il software di citometria a flusso, eliminare hCD45 dalla popolazione di cellule P1 e, da hCD45, quantificare la percentuale di hCD19, hCD3 e hCD13 (sottogruppi linfoidi e mieloidi).

9. Valutazione della frequenza di editing genetico in cellule mononucleate di midollo osseo innestate

  1. Al pellet monocellulare del midollo osseo, aggiungere 50 μL di soluzione di estrazione rapida (vedi Tabella dei materiali) per 5 x 105 cellule e risospendere il pellet.
  2. Incubare la miscela in un termociclatore a 68 °C per 30 min. Dopo una breve centrifuga, incubare la miscela in un termociclatore a 98 °C per 10 minuti.
  3. Misurare la concentrazione di DNA nel lisato grezzo utilizzando uno spettrofotometro. Seguire i passaggi 4.2.-4.4. per convalidare la frequenza di editing genetico utilizzando l'analisi ICE 8,15.

Risultati

Il presente studio identifica le condizioni ideali di coltura HSPC che facilitano la ritenzione di CD34+CD133+CD90+ HSCs in coltura ex vivo. Per dimostrare l'arricchimento della coltura delle HSC insieme alla generazione potenziata di HSC geneticamente modificate, vengono fornite le procedure ottimizzate per l'isolamento PBMNC, la purificazione delle cellule CD34+, la coltura, l'editing genetico, il trapianto, la caratterizzazione dell'attecchimento e le cellule geneti...

Discussione

L'esito positivo della terapia genica HSPC si basa prevalentemente sulla qualità e quantità di HSC innestabili nell'innesto. Tuttavia, le proprietà funzionali delle HSC sono fortemente influenzate durante la fase preparatoria dei prodotti di terapia genica, compresa la coltura in vitro e la tossicità associata alla procedura di manipolazione genica. Per superare questi limiti, abbiamo identificato condizioni di coltura ideali per HSPC che mantengono la staminalità delle HSC CD34+CD133+CD90+<...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano che non esistono interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Gli autori vogliono riconoscere il personale della struttura di citometria a flusso e della struttura per animali di CSCR. A. C. è finanziato da una borsa di studio ICMR-SRF, K. V. K. è finanziato da una borsa di studio DST-INSPIRE e P. B. è finanziato da una borsa di studio CSIR-JRF. Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India (sovvenzione n. BT / PR26901 / MED / 31/377 / 2017 e BT / PR31616 / MED / 31/408 / 2019)

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
4D-Nucleofector® X UnitLONZA BIOSCIENCEAAF-1003X
4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips)LONZA BIOSCIENCEV4XP-3032
Antibiotic-Antimycotic (100X)THERMO SCIENTIFIC15240096
Anti-human CD45 APCBD BIOSCIENCE 555485 
Anti-human CD13 PEBD BIOSCIENCE555394
Anti-human CD19 PerCPBD BIOSCIENCE340421
Anti-human CD3 PE-Cy7BD BIOSCIENCE557749
Anti-human CD90 APCBD BIOSCIENCE561971
Anti-human CD133/1 Miltenyibiotec130-113-673
Anti-human CD34 PEBD BIOSCIENCE348057
Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5BD BIOSCIENCE560580
Blood Irradator-2000 BRIT (Department of Biotechnology, India)BI 2000 
Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates)NUNC (THERMO SCIENTIFIC)140675
CrysoStor CS10BioLife solutions#07952
BusulfanCELON LABS (60mg/10mL)- 
Guide-it Recombinant Cas9TAKARA BIO632640
Cas9-eGFPSIGMAC120040 
 Centrifuge tube-15mlCORNING430790
 Centrifuge tube-50mlNUNC (THERMO SCIENTIFIC)339652
DMSOMPBIO219605590
DNAaseSTEMCELL TECHNOLOGIES6469
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1XHYCLONESH30028.02
EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit IISTEMCELL TECHNOLOGIES17856
EasySep magnetSTEMCELL TECHNOLOGIES18000
Electrophoresis unitORANGE INDIAHDS0036
FBSTHERMO SCIENTIFIC10270106
Flow cytometer – ARIA IIIBD BIOSCIENCE- 
FlowJo BD BIOSCIENCE -
Flt3-LPEPROTECH300-19-1000
Gel imaging systemCELL BIOSCIENCES11630453
HighPrep DTR reagentMAGBIOGENOMICSDT-70005
Human BD Fc BlockBD BIOSCIENCE553141
IL6PEPROTECH200-06-50
IMDM mediaTHERMO SCIENTIFIC12440053
Infrared lampMURPHY-
Insulin syringe 6mm 31GBD BIOSCIENCE324903
KetamineKETMIN 50-
Loading dye 6XTAKARA BIO9156
LymphoprepSTEMCELL TECHNOLOGIES7851
Mice RestrainerAVANTORTV-150
Nano drop spectrophotometerTHERMO SCIENTIFICND-2000C
Neubauer cell counting chamberROHEM INSTRUMENTSCC-3073
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)The Jackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:005557
NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW)The Jackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:026622
Nunc delta 6-well plateTHERMO SCIENTIFIC140675
Polystyrene round-bottom tubeBD352008
P3 primary cell Nucleofection solutionLONZA BIOSCIENCEPBP3-02250
Pasteur pipetteFISHER SCIENTIFIC13-678-20A
PCR clean-up kitTAKARA BIO740609.25
Mouse Pie CageFISCHER SCIENTIFIC50-195-5140
polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm)STEMCELL TECHNOLOGIES38007
Primer3Whitehead Institute for Biomedical Researchhttps://primer3.ut.ee/
QuickExtract™ DNA Extraction SolutionLucigenQE09050
ReserveratrolSTEMCELL TECHNOLOGIES72862
SCFPEPROTECH300-07-1000
SFEM-IISTEMCELL TECHNOLOGIES9655
sgRNASYNTHEGO- 
SPINWINTARSON1020
StemReginin 1STEMCELL TECHNOLOGIES72342
ICE analysis toolSYNTHEGOhttps://ice.synthego.com/
Tris-EDTA buffer solution (TE) 1XSYNTHEGOSupplied with gRNA 
ThermocyclerAPPLIED BIOSYSTEMS4375305
TPOPEPROTECH300-18-1000
Trypan blueHIMEDIA LABSTCL046
UM171STEMCELL TECHNOLOGIES72914
UM729STEMCELL TECHNOLOGIES72332
XylazineXYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED-

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