CRISPR/Cas9 Gene Editing di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche per applicazioni di terapia genica

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una procedura di coltura ottimizzata di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) per l'attecchimento robusto di cellule geneticamente modificate in vivo.

Abstract

CRISPR / Cas9 è uno strumento di editing genetico altamente versatile ed efficiente adottato ampiamente per correggere varie mutazioni genetiche. La fattibilità della manipolazione genica delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) in vitro rende le HSPC una cellula bersaglio ideale per la terapia genica. Tuttavia, le HSPC perdono moderatamente il loro potenziale di attecchimento e ripopolamento multilineare in coltura ex vivo . Nel presente studio sono descritte condizioni di coltura ideali che migliorano l'attecchimento di HSPC e generano un aumento del numero di cellule geneticamente modificate in vivo. Il rapporto attuale mostra le condizioni di coltura in vitro ottimizzate, tra cui il tipo di terreno di coltura, l'integrazione unica di cocktail di piccole molecole, la concentrazione di citochine, le piastre di coltura cellulare e la densità di coltura. Inoltre, viene fornita una procedura ottimizzata di modifica genetica HSPC, insieme alla convalida degli eventi di modifica genetica. Per la convalida in vivo , vengono visualizzati l'infusione di HSPCs geneticamente modificata e l'analisi post-attecchimento nei destinatari di topo. I risultati hanno dimostrato che il sistema di coltura ha aumentato la frequenza delle HSC funzionali in vitro, con conseguente robusto attecchimento di cellule geneticamente modificate in vivo.

Introduzione

L'inaccessibilità ai donatori compatibili con l'antigene leucocitario umano (HLA) in contesti di trapianto allogenico e il rapido sviluppo di strumenti di ingegneria genetica altamente versatili e sicuri rendono il trapianto di cellule staminali ematopoietiche autologhe (HSCT) una strategia di trattamento curativo per le malattie ereditarie del sangue ^1,2. La terapia genica con cellule staminali e progenitrici ematopoietiche autologhe (HSPC) comporta la raccolta di HSPC dei pazienti, la manipolazione genetica, la correzione delle mutazioni che causano malattie e il trapianto di HSPC geneticamente corretti nel ....

Protocollo

Gli esperimenti in vivo su topi immunodeficienti sono stati approvati ed eseguiti seguendo le linee guida dell'Institute Animal Ethics Committee (IAEC), Christian Medical College, Vellore, India. I campioni di sangue periferico mobilitati con fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF) sono stati raccolti da donatori umani sani con il consenso informato dopo aver ottenuto l'approvazione dell'Institutional Review Board (IRB).

1. Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNC) e purificazione delle cellule CD34 ⁺

1. Eseguire l'isolamento PBMNC seguendo i passaggi seguent....

Risultati

Il presente studio identifica le condizioni ideali di coltura HSPC che facilitano la ritenzione di CD34+CD133⁺CD90⁺ HSCs in coltura ex vivo. Per dimostrare l'arricchimento della coltura delle HSC insieme alla generazione potenziata di HSC geneticamente modificate, vengono fornite le procedure ottimizzate per l'isolamento PBMNC, la purificazione delle cellule CD34⁺, la coltura, l'editing genetico, il trapianto, la caratterizzazione dell'attecchimento e le cellule geneti.......

Discussione

L'esito positivo della terapia genica HSPC si basa prevalentemente sulla qualità e quantità di HSC innestabili nell'innesto. Tuttavia, le proprietà funzionali delle HSC sono fortemente influenzate durante la fase preparatoria dei prodotti di terapia genica, compresa la coltura in vitro e la tossicità associata alla procedura di manipolazione genica. Per superare questi limiti, abbiamo identificato condizioni di coltura ideali per HSPC che mantengono la staminalità delle HSC CD34+CD133⁺CD90^+<.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4D-Nucleofector® X Unit	LONZA BIOSCIENCE	AAF-1003X
4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips)	LONZA BIOSCIENCE	V4XP-3032
Antibiotic-Antimycotic (100X)	THERMO SCIENTIFIC	15240096
Anti-human CD45 APC	BD BIOSCIENCE	555485
Anti-human CD13 PE	BD BIOSCIENCE	555394
Anti-human CD19 PerCP	BD BIOSCIENCE	340421
Anti-human CD3 PE-Cy7	BD BIOSCIENCE	557749
Anti-human CD90 APC	BD BIOSCIENCE	561971
Anti-human CD133/1	Miltenyibiotec	130-113-673
Anti-human CD34 PE	BD BIOSCIENCE	348057
Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5	BD BIOSCIENCE	560580
Blood Irradator-2000	BRIT (Department of Biotechnology, India)	BI 2000
Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates)	NUNC (THERMO SCIENTIFIC)	140675
CrysoStor CS10	BioLife solutions	#07952
Busulfan	CELON LABS (60mg/10mL)	-
Guide-it Recombinant Cas9	TAKARA BIO	632640
Cas9-eGFP	SIGMA	C120040
Centrifuge tube-15ml	CORNING	430790
Centrifuge tube-50ml	NUNC (THERMO SCIENTIFIC)	339652
DMSO	MPBIO	219605590
DNAase	STEMCELL TECHNOLOGIES	6469
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X	HYCLONE	SH30028.02
EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II	STEMCELL TECHNOLOGIES	17856
EasySep magnet	STEMCELL TECHNOLOGIES	18000
Electrophoresis unit	ORANGE INDIA	HDS0036
FBS	THERMO SCIENTIFIC	10270106
Flow cytometer – ARIA III	BD BIOSCIENCE	-
FlowJo	BD BIOSCIENCE	-
Flt3-L	PEPROTECH	300-19-1000
Gel imaging system	CELL BIOSCIENCES	11630453
HighPrep DTR reagent	MAGBIOGENOMICS	DT-70005
Human BD Fc Block	BD BIOSCIENCE	553141
IL6	PEPROTECH	200-06-50
IMDM media	THERMO SCIENTIFIC	12440053
Infrared lamp	MURPHY	-
Insulin syringe 6mm 31G	BD BIOSCIENCE	324903
Ketamine	KETMIN 50	-
Loading dye 6X	TAKARA BIO	9156
Lymphoprep	STEMCELL TECHNOLOGIES	7851
Mice Restrainer	AVANTOR	TV-150
Nano drop spectrophotometer	THERMO SCIENTIFIC	ND-2000C
Neubauer cell counting chamber	ROHEM INSTRUMENTS	CC-3073
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)	The Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:005557
NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW)	The Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:026622
Nunc delta 6-well plate	THERMO SCIENTIFIC	140675
Polystyrene round-bottom tube	BD	352008
P3 primary cell Nucleofection solution	LONZA BIOSCIENCE	PBP3-02250
Pasteur pipette	FISHER SCIENTIFIC	13-678-20A
PCR clean-up kit	TAKARA BIO	740609.25
Mouse Pie Cage	FISCHER SCIENTIFIC	50-195-5140
polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm)	STEMCELL TECHNOLOGIES	38007
Primer3	Whitehead Institute for Biomedical Research	https://primer3.ut.ee/
QuickExtract™ DNA Extraction Solution	Lucigen	QE09050
Reserveratrol	STEMCELL TECHNOLOGIES	72862
SCF	PEPROTECH	300-07-1000
SFEM-II	STEMCELL TECHNOLOGIES	9655
sgRNA	SYNTHEGO	-
SPINWIN	TARSON	1020
StemReginin 1	STEMCELL TECHNOLOGIES	72342
ICE analysis tool	SYNTHEGO	https://ice.synthego.com/
Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X	SYNTHEGO	Supplied with gRNA
Thermocycler	APPLIED BIOSYSTEMS	4375305
TPO	PEPROTECH	300-18-1000
Trypan blue	HIMEDIA LABS	TCL046
UM171	STEMCELL TECHNOLOGIES	72914
UM729	STEMCELL TECHNOLOGIES	72332
Xylazine	XYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED	-