CorrelationCalculator und Filigrane: Werkzeuge zur datengetriebenen Netzwerkanalyse von Metabolomik-Daten

Zusammenfassung

Wir stellen CorrelationCalculator und Filigree vor, zwei Werkzeuge für den datengesteuerten Netzwerkaufbau und die Analyse von Metabolomik-Daten. CorrelationCalculator unterstützt den Aufbau eines einzelnen Interaktionsnetzwerks von Metaboliten auf der Grundlage von Expressionsdaten, während Filigran den Aufbau eines differentiellen Netzwerks ermöglicht, gefolgt von Netzwerk-Clustering und Anreicherungsanalyse.

Zusammenfassung

Eine große Herausforderung bei der Analyse von Omics-Daten ist die Gewinnung von verwertbarem biologischem Wissen. Die Metabolomik ist da keine Ausnahme. Das allgemeine Problem, Veränderungen in den Konzentrationen einzelner Metaboliten mit spezifischen biologischen Prozessen in Verbindung zu bringen, wird durch die große Anzahl unbekannter Metaboliten verschärft, die in ungezielten Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Studien (LC-MS) vorhanden sind. Darüber hinaus sind der Sekundärstoffwechsel und der Fettstoffwechsel in bestehenden Signalwegdatenbanken nur unzureichend vertreten. Um diese Einschränkungen zu überwinden, hat unsere Gruppe mehrere Tools für den datengesteuerten Netzwerkaufbau und die Analyse entwickelt. Dazu gehören CorrelationCalculator und Filigree. Beide Tools ermöglichen es Benutzern, partielle korrelationsbasierte Netzwerke aus experimentellen Metabolomik-Daten zu erstellen, wenn die Anzahl der Metaboliten die Anzahl der Proben übersteigt. CorrelationCalculator unterstützt den Aufbau eines einzelnen Netzwerks, während Filigran den Aufbau eines differenziellen Netzwerks unter Verwendung von Daten aus zwei Gruppen von Stichproben ermöglicht, gefolgt von Netzwerk-Clustering und Anreicherungsanalyse. Wir werden den Nutzen und die Anwendung beider Werkzeuge für die Analyse realer Metabolomics-Daten beschreiben.

Einleitung

In den letzten zehn Jahren hat sich die Metabolomik aufgrund von Fortschritten in analytischen Technologien wie der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) zu einer Omics-Wissenschaft entwickelt. Diese Techniken ermöglichen die gleichzeitige Messung von Hunderten bis Tausenden von niedermolekularen Metaboliten, wodurch komplexe mehrdimensionale Datensätze erstellt werden. Metabolomics-Experimente können im gezielten oder ungezielten Modus durchgeführt werden. Gezielte Metabolomik-Experimente messen bestimmte Klassen von Metaboliten. Sie sind in der Regel hypothesengetrieben, während ungezielte Ansätze versuchen, so viele Metaboliten wie möglich zu messen, und hypothesengenerierender Natur sind. Gezielte Assays enthalten in der Regel interne Standards und ermöglichen so eine absolute Quantifizierung der interessierenden Metaboliten. Im Gegensatz dazu ermöglichen ungezielte Assays eine relative Quantifizierung und umfassen viele unbekannte Metaboliten¹.

Die Analyse von Metabolomik-Daten ist ein mehrstufiger Prozess, der viele spezialisierte Software-Tools nutzt¹. Es kann in die folgenden drei Hauptschritte unterteilt werden: (1) Datenverarbeitung und Qualitätskontrolle, (2) statistische Analyse und (3) Interpretation biologischer Daten. Die hier beschriebenen Werkzeuge sind so konzipiert, dass sie den letzten Schritt der Analyse ermöglichen.

Eine intuitive und beliebte Methode zur Interpretation von Metabolomik-Daten besteht darin, die experimentellen Messungen auf Stoffwechselwege abzubilden. Um diese 2,3,4,5 zu erreichen, wurden zahlreiche Tools entwickelt, darunter Metscape, das von unserer Gruppe⁶ entwickelt wurde. Die Kartierung der Signalwege wird häufig mit einer Anreicherungsanalyse kombiniert, die dabei hilft, die wichtigsten Signalwege zu identifizieren ^7,8. Diese Techniken erlangten erstmals bei der Analyse von Genexpressionsdaten an Bedeutung und wurden erfolgreich für die Analyse von Proteomik- und Epigenomik-Daten eingesetzt 9,10,11,12,13. Die Analyse von Metabolomics-Daten stellt jedoch eine Reihe von Herausforderungen für wissensbasierte Ansätze dar. Erstens messen Metabolomik-Assays zusätzlich zu den endogenen Metaboliten exogene Verbindungen, einschließlich solcher, die aus der Ernährung und anderen Umweltquellen stammen. Diese Verbindungen sowie die von Bakterien produzierten Metaboliten können nicht auf menschliche oder metabolische Wege anderer eukaryotischer Organismen abgebildet werden. Darüber hinaus erlaubt die Abdeckung des Sekundärstoffwechsels und des Lipidstoffwechsels derzeit keine hochauflösende Kartierung auf einem Niveau, das die biologische Interpretation der Daten leicht unterstützen würde^14,15.

Datengesteuerte Netzwerkanalysetechniken können helfen, diese Herausforderungen zu meistern. Zum Beispiel können korrelationsbasierte Netzwerke helfen, Beziehungen zwischen bekannten und unbekannten Metaboliten abzuleiten und die Annotation der Unbekannten zu erleichtern¹⁶. Während die Berechnung der Pearson-Korrelationskoeffizienten der einfachste Ansatz ist, um die linearen Beziehungen zwischen Metaboliten zu ermitteln, besteht der Nachteil darin, dass sie sowohl direkte als auch indirekte Assoziationen erfasst^17,18,19. Eine Alternative besteht darin, partielle Korrelationskoeffizienten zu berechnen, die zwischen direkten und indirekten Assoziationen unterscheiden können. Die Gaußsche grafische Modellierung (GGM) kann zur Schätzung partieller Korrelationsnetzwerke verwendet werden. GGM verlangt jedoch, dass die Stichprobengröße und die Anzahl der Merkmale vergleichbar sind. Diese Bedingung ist bei ungezielten LC-MS-Daten, die Messungen für Tausende von Stoffwechselmerkmalen enthalten, selten erfüllt. Regularisierungstechniken können verwendet werden, um diese Einschränkung zu überwinden. Graphisches Lasso (Glasso) und knotenweise Regression sind beliebte Methoden zur regularisierten Schätzung des partiellen Korrelationsnetzwerks^16,20.

Das erste der hier vorgestellten Bioinformatik-Werkzeuge, CorrelationCalculator¹⁶, basiert auf dem Debiased Sparse Partial Correlation (DSPC)-Algorithmus. DSPC stützt sich auf die entsparsifizierte grafische Lasso-Modellierung. Dem Algorithmus liegt die Annahme zugrunde, dass die Anzahl der Verbindungen zwischen den Metaboliten deutlich kleiner ist als die Anzahl der Proben, d.h. das partielle Korrelationsnetzwerk der Metaboliten ist spärlich. Diese Annahme ermöglicht es DSPC, die Konnektivität zwischen einer großen Anzahl von Metaboliten mit weniger Proben zu entdecken und dabei regulierte Regressionstechniken zu nutzen. Darüber hinaus erhält es unter Verwendung eines Debiasing-Schritts für die regularisierten Regressionsschätzungen Stichprobenverteilungen für die Kantenparameter, die verwendet werden können, um Konfidenzintervalle zu konstruieren und Hypothesen von Interesse zu testen (z. B. Vorhandensein/Fehlen einer einzelnen oder einer Gruppe von Kanten). Das Vorhandensein oder Fehlen einer Kante im partiellen Korrelationsnetzwerk kann somit formal mit den berechneten p-Werten getestet werden.

CorrelationCalculator erwies sich als sehr nützlich für die Einzelgruppenanalyse¹⁶; Das Ziel vieler Metabolomics-Experimente ist jedoch die differentielle Analyse von zwei oder mehr Bedingungen. Während CorrelationCalculator für jede der Gruppen separat eingesetzt werden kann, um partielle Korrelationsnetzwerke für jede Bedingung zu generieren, begrenzt dieser Ansatz die Anzahl der Stichproben, die für die Netzwerkgenerierung verwendet werden können. Da eine ausreichend große Stichprobengröße eine der wichtigsten Überlegungen bei der datengetriebenen Analyse ist, sind Methoden, die alle verfügbaren Stichproben in den Daten nutzen können, um Netzwerke zu konstruieren, sehr wünschenswert. Dieser Ansatz wird im zweiten hier vorgestellten Tool mit dem Namen Filigran²¹ umgesetzt. Filigree stützt sich auf den zuvor veröffentlichten DNEA-Algorithmus (Differential Network Enrichment Analysis)²². Tabelle 1 zeigt die Anwendungen und den Workflow beider Tools.

Anzahl der Versuchsbedingungen (k)	k = 1	k = 2
Programmentwicklungssystem	Korrelationsrechner	Filigran
Eingangsdaten	• Metaboliten x Proben Datenmatrix	• Metaboliten x Proben Datenmatrix • Experimentelle Gruppen
Arbeitsablauf •Vorbehandlung • Schätzung des Netzwerks • Netzwerk-Clustering • Anreicherungsanalyse	• Log-Transformation; Automatische Skalierung • DSPC • Über externe Apps •Nein	• Log-Transformation; Automatische Skalierung • Schätzung des gemeinsamen Netzes • Konsens-Clustering • NetGSA
Datenvisualisierung	Über externe App, z.B. Cytoscape	Über externe App, z.B. Cytoscape
Testen von Stoffwechselmodulen auf die Assoziation mit dem interessierenden Ergebnis (optional)	Über externe Apps	Über externe Apps

Tabelle 1: Der Anwendungsbereich und der Workflow von CorrelationCalculator und Filigree.

Protokoll

1. Korrelationsrechner

1. Laden Sie eine kommagetrennte Beispieleingabedatei herunter, die eine Liste der Metaboliten mit experimentellen Messungen bei http://metscape.med.umich.edu/kora_data_240.csv enthält.
2. Doppelklicken Sie auf die heruntergeladene Beispieldatei, um sie zu öffnen.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Datei Etiketten sowohl für die Proben als auch für die Metaboliten enthält.
   2. Da sich die Proben in Zeilen befinden, vergewissern Sie sich, dass die erste Spalte die Probennamen und die erste Zeile die Metabolitennamen enthält.
3. Laden Sie die Java-Anwendung CorrelationCalculator (http://metscape.med.umich.edu/calculator.html) herunter. Doppelklicken Sie auf die heruntergeladene .jar-Datei, um die Anwendung zu starten.
4. Klicken Sie auf der Registerkarte Eingabe auf die Schaltfläche Durchsuchen , um die Eingabedatei hochzuladen.
5. Verwenden Sie unter Dateiformat angeben den Dropdown-Pfeil, um das entsprechende Eingabedateiformat auszuwählen. Wählen Sie Stichproben in Zeilen aus (ergänzende Abbildung 1).
6. Wechseln Sie zur Registerkarte Datennormalisierung , indem Sie unten rechts im Fenster auf die Schaltfläche Nächste >> klicken.
7. Aktivieren Sie unter Methode(n) auswählen das Kontrollkästchen neben Log2-Transform Data. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Daten automatisch skalieren.
8. Klicken Sie unter Daten normalisieren auf die Schaltfläche Ausführen .
   HINWEIS: Sobald die Normalisierung abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Normalisierte Daten anzeigen , die sich unter Daten normalisieren befindet, und überprüfen Sie das aktualisierte Dataset (ergänzende Abbildung 2).
9. Klicken Sie unter " Daten normalisieren" auf die Schaltfläche "Speichern " und speichern Sie die neue Datendatei.
10. Wechseln Sie zur Registerkarte Datenanalyse , indem Sie unten rechts im Fenster auf die Schaltfläche Nächste >> klicken.
11. Klicken Sie unter Pearson-Korrelation berechnen auf Ausführen. Bestimmen Sie den besten Pearson-Korrelationsbereich für die Daten.
    1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Histogramm anzeigen . Überprüfen Sie die Häufigkeit der maximalen Pearson-Korrelationswerte pro Feature.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Heatmap anzeigen . Sehen Sie sich die Darstellung der Korrelationsmatrix von Pearson an.
12. Behalten Sie unter Nach Pearson-Korrelationen filtern die Standardzahlen bei, um nach einem Bereich von 0,00 bis 1,00 zu filtern
    HINWEIS: Schieben Sie den kleinen blauen Pfeil am rechten Ende von 1 und den kleinen blauen Pfeil links von 0, um den Filter zu ändern. Die Eingabe bestimmter Zahlen in die Textfelder ist ebenfalls eine Option.
13. Wählen Sie unter Partielle Korrelationsmethode auswählen die gewünschte Methode DSPC-Methode aus.
    HINWEIS: Wenn die Anzahl der Metaboliten kleiner ist als die Anzahl der Proben im Datensatz, kann nur die DSPC-Methode verwendet werden.
14. Klicken Sie unter Partielle Korrelationen berechnen auf die Schaltfläche Ausführen (ergänzende Abbildung 3).
15. Klicken Sie auf CSV-Datei anzeigen und zeigen Sie die Ergebnisse an. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern und speichern Sie die Ergebnisse.
16. Klicken Sie auf die Schaltfläche In MetScape anzeigen , um ein interaktives Korrelationsnetzwerk zu starten.
    Siehe Karnovsky, A. et ^al.6 für weitere Informationen zur Verwendung von MetScape.
    HINWEIS: MetScape ist eine Cytoscape-Anwendung, die die Erstellung und Untersuchung von Korrelationsnetzwerken ermöglicht.

2. Filigran

1. Laden Sie eine kommagetrennte Beispieleingabedatei herunter, die Metabolitenmessungen bei http://metscape.med.umich.edu/T1D_primaryMetabolites_noIS_log_scaled_sorted.csv enthält.
2. Doppelklicken Sie auf die heruntergeladene Beispieldatei, um sie zu öffnen.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Datei Beispielnamen in Spalte 1 und Gruppenzuweisungen in Spalte 2 enthält. Vergewissern Sie sich, dass die verbleibenden Spalten Metaboliten/Lipide enthalten.
   2. Stellen Sie sicher, dass jede Zeile eine Stichprobe darstellt.
      HINWEIS: Die Metabolitenmessungen sollten logarithmisch transformiert und automatisch skaliert werden, es sei denn, es wird eine Merkmalsaggregation durchgeführt, in diesem Fall sollten die Messungen nur logarithmisch transformiert werden.
3. Laden Sie die Anwendung Filigree Java (http://metscape.med.umich.edu/filigree.html) herunter.
   HINWEIS: Ein ausführliches Benutzerhandbuch finden Sie unter http://metscape.ncibi.org/v0.1.2Filigree_UserManual.pdf.
4. Doppelklicken Sie auf die heruntergeladene .jar-Datei, um die Anwendung zu starten.
5. Klicken Sie auf der Registerkarte Daten auf die Schaltfläche Durchsuchen , um die Eingabedatei hochzuladen.
6. Klicken Sie unter Spalten/Zeilen angeben auf den Dropdown-Pfeil neben Beispiel-ID , um den entsprechenden Spalten-/Zeilennamen aus der Eingabedatei auszuwählen. Wählen Sie Sample (Beispiel) aus.
7. Klicken Sie unter Spalten/Zeilen angeben auf den Dropdown-Pfeil neben "Gruppieren", um die entsprechende Spalte/Zeile aus der Eingabedatei auszuwählen. Wählen Sie Gruppe aus.
8. Klicken Sie unter " Beispielgruppen angeben" auf die Dropdown-Pfeile neben jeder Gruppe , um die entsprechende Gruppenspalte aus der Eingabedatei auszuwählen. Wählen Sie für Gruppe 1 Diabetiker aus. Wählen Sie für Gruppe 2 die Option Nicht-Diabetiker aus.
9. Aktivieren Sie unter Feature-Gruppierung das Kontrollkästchen neben der gewünschten Methode Feature-Gruppen berechnen.
10. Klicken Sie auf die Schaltfläche Heatmaps anzeigen . Sehen Sie sich die Heatmap an und bestimmen Sie eine gewünschte prozentuale Reduzierung.
11. Verwenden Sie den Schieberegler Feature-Reduzierung , um die gewünschte prozentuale Reduzierung von Features auszuwählen. Verschieben Sie den kleinen Kreis, bis die prozentuale Reduzierung ein Merkmal-zu-Stichproben-Verhältnis von 1,25 aufweist (ergänzende Abbildung 4).
12. Wechseln Sie zur Registerkarte Analyse , indem Sie unten rechts im Fenster auf die Schaltfläche Nächste >> klicken.
13. Klicken Sie unter Ausgabeverzeichnis auswählen auf die Schaltfläche Durchsuchen und wählen Sie den gewünschten Speicherort für die generierten Ausgabedateien aus.
14. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analyse ausführen unten links im Fenster. Die Fortschrittsbalken werden für jede Analysekomponente aktualisiert (ergänzende Abbildung 5). Klicken Sie auf die Schaltfläche OK im Popup-Fenster, in dem die Meldung Analyse erfolgreich abgeschlossen angezeigt wird.
15. Klicken Sie auf der Registerkarte Analyse auf die Schaltfläche Netzwerke durchsuchen , um die interaktiven Filigranen Teilnetze in einer Browserregisterkarte zu öffnen.
16. Klicken Sie auf den Link Teilnetz 1 in der Spalte Teilnetzname .
17. Erkunden Sie das interaktive Teilnetz mithilfe der verschiedenen Schaltflächen. Klicken Sie auf die Schaltfläche + und vergrößern Sie den Teil des Netzwerks. Klicken Sie auf die Schaltfläche -, und verkleinern Sie die Ansicht (ergänzende Abbildung 6).
18. Klicken Sie auf einen Gruppenknoten , und ziehen Sie ihn, um ihn innerhalb des Teilnetzes neu zu positionieren.
    HINWEIS: Die Knotenfarbe steht für die Auf-/Abwärtsregulierung und die Farbdeckkraft für die höhere/niedrigere Falzänderung. Die Kantenfarbe stellt den unterschiedlichen Status zwischen den Gruppen dar.
19. Klicken Sie oben rechts auf der Seite auf die Schaltfläche Features erweitern, um alle Gruppenknoten zu erweitern . Überprüfen Sie die spezifischen Verbindungen, aus denen die Gruppenknoten bestehen.
20. Klicken Sie oben rechts auf der Seite auf die Schaltfläche Features reduzieren , um die zuletzt erweiterten Gruppenknoten auszublenden.
21. Klicken Sie oben rechts auf der Seite auf die Schaltfläche Nach Stichprobengruppe , um die Ansicht von einem einzelnen Teilnetz in mehrere Teilnetze zu ändern, die nach einer Gruppe aufgeteilt sind. Untersuchen und vergleichen Sie die Gruppen in dieser Ansicht der Teilnetze (ergänzende Abbildung 7).
22. Klicken Sie auf die Schaltfläche Alle Stichproben , um zur Ansicht eines einzelnen Teilnetzes zurückzukehren.
23. Zeigen Sie das nächste Teilnetz an, indem Sie oben rechts auf der Seite auf die Schaltfläche Weiter klicken.
24. Wiederholen Sie die Schritte 2.19 bis 2.23 für jedes Teilnetz.
25. Klicken Sie oben in der Mitte des Fensters auf den Link Ergebnisse der differenziellen Netzwerkanreicherungsanalyse , um zur Übersichtstabellenansicht zurückzukehren, in der alle Teilnetze aufgeführt sind.
    HINWEIS: Importieren Sie die Edge- und/oder Knotenausgabedateien in ein anderes Software-Tool, z. B. Cytoscape²³, um zusätzliche Netzwerkvisualisierungen zu erstellen.

3. Zusätzliche Erwägungen

1. Bei Mac-Computern, auf denen Big Sur (OSX 11.2) oder neuer ausgeführt wird, genehmigen Sie das Tool im Apple-Menü > Systemeinstellungen > Sicherheit & Datenschutz > Allgemein und wählen Sie unten im Tab die Option "Zulassen " aus.
2. Erlauben Sie außerdem Filigrane Zugriff auf die Dateien im Apple-Menü > Systemeinstellungen > Sicherheit > Datenschutz , indem Sie im Menü auf der linken Seite die Option " Dateien und Ordner" und dann im Menü auf der rechten Seite die Option " Filigran" auswählen.

Ergebnisse

Um die Verwendung von CorrelationCalculator zu veranschaulichen, konstruierten wir ein partielles Korrelationsnetzwerk unter Verwendung einer Teilmenge der Metabolomik-Daten aus der KORA-Populationsstudie, die in Krumsiek et ^al.24 beschrieben wurden. Der Datensatz enthielt 151 Metaboliten und 240 Proben. Abbildung 1 zeigt das resultierende partielle Korrelationsnetzwerk, das in Cytoscape visualisiert wurde. Das Netzwerk umfasst 148 Knoten und 272 Edges. Die F...

Diskussion

Partielle korrelationsbasierte Netzwerkanalysemethoden, die in CorrelationCalculator und Filigree implementiert sind, tragen dazu bei, einige der Einschränkungen wissensbasierter Stoffwechselweganalysen zu überwinden, insbesondere für Datensätze mit einer hohen Prävalenz unbekannter Metaboliten und einer begrenzten Abdeckung von Stoffwechselwegen (z. B. Lipidomik-Daten). Diese Werkzeuge werden von der Forschungsgemeinschaft häufig verwendet, um ein breites Spektrum von Metabolomik- und Lipidomik-Daten zu analysiere...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorrelationCalculator	JAVA	http://metscape.med.umich.edu/calculator.html
clusterNet		https://github.com/Karnovsky-Lab/clusterNet
Cytoscape	Cytoscape	https://cytoscape.org/
Filigree	JAVA	http://metscape.med.umich.edu/filigree.html
MetScape	Cytoscape	https://apps.cytoscape.org/apps/metscape	Cytoscape application that allows for the creation and exploration of correlation networks.