CorrelationCalculator e Filigrana: Ferramentas para Análise de Redes Data-Driven de Dados Metabolômicos

Resumo

Apresentamos CorrelationCalculator e Filigrana, duas ferramentas para construção de redes baseadas em dados e análise de dados metabolômicos. O CorrelationCalculator suporta a construção de uma única rede de interação de metabólitos com base em dados de expressão, enquanto o Filigrana permite a construção de uma rede diferencial, seguida de clustering de rede e análise de enriquecimento.

Resumo

Um desafio significativo na análise de dados ômicos é extrair conhecimento biológico acionável. A metabolômica não é exceção. O problema geral de relacionar mudanças nos níveis de metabólitos individuais a processos biológicos específicos é agravado pelo grande número de metabólitos desconhecidos presentes em estudos de cromatografia líquida não direcionada acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). Além disso, o metabolismo secundário e o metabolismo lipídico são pouco representados nos bancos de dados de vias existentes. Para superar essas limitações, nosso grupo desenvolveu diversas ferramentas para construção e análise de redes baseadas em dados. Estes incluem CorrelationCalculator e filigrana. Ambas as ferramentas permitem que os usuários construam redes baseadas em correlação parcial a partir de dados metabolômicos experimentais quando o número de metabólitos excede o número de amostras. CorrelationCalculator suporta a construção de uma única rede, enquanto Filigrana permite a construção de uma rede diferencial utilizando dados de dois grupos de amostras, seguido de agrupamento de rede e análise de enriquecimento. Descreveremos a utilidade e a aplicação de ambas as ferramentas para a análise de dados metabolômicos da vida real.

Introdução

Na última década, a metabolômica emergiu como ciência ômica devido aos avanços em tecnologias analíticas como a Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massas (GC-MS) e a Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massas (LC-MS). Essas técnicas permitem a medição simultânea de centenas a milhares de metabólitos de pequenas moléculas, criando conjuntos de dados multidimensionais complexos. Os experimentos metabolômicos podem ser realizados em modos direcionados ou não. Experimentos de metabolômica direcionada medem classes específicas de metabólitos. Eles são geralmente orientados por hipóteses, enquanto abordagens não direcionadas tentam medir o maior número possível de metabólitos e são geradoras de hipóteses por natureza. Ensaios direcionados geralmente incluem padrões internos e, portanto, permitem a quantificação absoluta de metabólitos de interesse. Em contraste, ensaios não direcionados permitem quantificação relativa e incluem muitos metabólitos desconhecidos¹.

A análise de dados metabolômicos é um processo de várias etapas que utiliza muitas ferramentas de software especializadas¹. Ele pode ser dividido em três etapas principais: (1) processamento e controle de qualidade dos dados, (2) análise estatística e (3) interpretação dos dados biológicos. As ferramentas aqui descritas são projetadas para permitir a última etapa da análise.

Uma maneira intuitiva e popular de interpretar dados metabolômicos é mapear as medidas experimentais em vias metabólicas. Inúmeras ferramentas foram projetadas para isso2,3,4,5, incluindo o Metscape^, desenvolvido por nosso grupo 6. O mapeamento de vias é frequentemente combinado com a análise de enriquecimento, o que ajuda a identificar as vias mais significativas ^7,8. Essas técnicas ganharam destaque na análise de dados de expressão gênica e têm sido aplicadas com sucesso para análise de dados proteômicos e epigenômicos9,10,11,12,13. No entanto, a análise de dados metabolômicos apresenta uma série de desafios para abordagens baseadas em conhecimento. Primeiro, além dos metabólitos endógenos, os ensaios metabolômicos medem compostos exógenos, incluindo aqueles provenientes da nutrição e de outras fontes ambientais. Esses compostos, assim como os metabólitos produzidos por bactérias, não podem ser mapeados em vias humanas ou metabólicas de outros organismos eucarióticos. Além disso, a cobertura das vias do metabolismo secundário e do metabolismo lipídico atualmente não permite um mapeamento de alta resolução em nível que facilmente apoiaria a interpretação biológica dos dados^14,15.

Técnicas de análise de rede orientadas por dados podem ajudar a superar esses desafios. Por exemplo, redes baseadas em correlação podem ajudar a derivar relações entre metabólitos conhecidos e desconhecidos e facilitar a anotação das incógnitas¹⁶. Embora o cálculo dos coeficientes de correlação de Pearson seja a abordagem mais simples para estabelecer as relações lineares entre metabólitos, a desvantagem é que ele captura associações diretas e indiretas^17,18,19. Uma alternativa é calcular coeficientes de correlação parciais que possam distinguir entre associações diretas e indiretas. A modelagem gráfica gaussiana (GGM) pode ser usada para estimar redes de correlação parcial. No entanto, o GGM requer que o tamanho da amostra e o número de características sejam comparáveis. Essa condição raramente é encontrada em dados LC-MS não direcionados que contêm medições para milhares de características metabólicas. Técnicas de regularização podem ser utilizadas para superar essa limitação. Laço gráfico (Glasso) e regressão nodewise são métodos populares para estimação regularizada da rede de correlação parcial^16,20.

A primeira das ferramentas de bioinformática aqui apresentadas, a CorrelationCalculator¹⁶, baseia-se no algoritmo de correlação parcial esparsa enviesada (DSPC). O DSPC conta com modelagem gráfica de laço desparsificado. A suposição subjacente do algoritmo é que o número de conexões entre os metabólitos é consideravelmente menor do que o número de amostras, ou seja, a rede de correlação parcial de metabólitos é escassa. Essa suposição permite que o DSPC descubra a conectividade entre um grande número de metabólitos usando menos amostras, aproveitando técnicas de regressão regularizada. Além disso, usando uma etapa de debiasing para as estimativas de regressão regularizada, obtém-se distribuições amostrais para os parâmetros de borda que podem ser usadas para construir intervalos de confiança e testar hipóteses de interesse (por exemplo, presença/ausência de uma única ou de um grupo de arestas). A presença ou ausência de uma aresta na rede de correlação parcial pode, portanto, ser formalmente testada usando os valores de p calculados.

O CorrelationCalculator mostrou-se muito útil para análise de grupo único¹⁶; No entanto, o objetivo de muitos experimentos metabolômicos é a análise diferencial de duas ou mais condições. Enquanto CorrelationCalculator pode ser empregado em cada um dos grupos separadamente para gerar redes de correlação parcial para cada condição, essa abordagem limita o número de amostras que podem ser usadas para geração de rede. Uma vez que um tamanho de amostra suficientemente grande é uma das maiores considerações na análise orientada por dados, métodos que possam aproveitar todas as amostras disponíveis nos dados para construir redes são altamente desejáveis. Essa abordagem é implementada na segunda ferramenta aqui apresentada, denominada Filigrana²¹. A filigrana baseia-se no algoritmo Differential Network Enrichment Analysis (DNEA) publicado anteriormente²². A Tabela 1 mostra os aplicativos e o fluxo de trabalho de ambas as ferramentas.

Número de condições experimentais (k)	k = 1	k = 2
Ferramenta de software	CorrelationCalculator	Filigrana
Dados de entrada	• Metabólitos x Matriz de dados de amostras	• Metabólitos x Matriz de dados de amostras • Grupos experimentais
Fluxo de trabalho •Pré-tratamento • Estimativa de rede • Clustering de rede • Análise de enriquecimento	• Transformação de logs; dimensionamento automático • DSPC • Através de aplicativos externos •Não	• Transformação de logs; dimensionamento automático • Estimativa de rede conjunta • Agrupamento de consenso • NetGSA
Visualização de dados	Via aplicativo externo, por exemplo, Cytoscape	Via aplicativo externo, por exemplo, Cytoscape
Testando módulos metabólicos para a associação com o desfecho de interesse (opcional)	Através de aplicativos externos	Através de aplicativos externos

Tabela 1: O escopo de aplicação e o fluxo de trabalho de CorrelationCalculator e Filigrana.

Protocolo

1. Calculadora de Correlação:

1. Faça o download de um arquivo de entrada delimitado por vírgulas contendo uma lista de metabólitos com medições experimentais em http://metscape.med.umich.edu/kora_data_240.csv.
2. Clique duas vezes no arquivo de exemplo baixado para abri-lo.
   1. Certifique-se de que o arquivo contenha rótulos para as amostras e os metabólitos.
   2. Como as amostras estão em linhas, confirme se a primeira coluna são os nomes de amostra e a primeira linha são os nomes dos metabólitos.
3. Faça o download do aplicativo Java CorrelationCalculator (http://metscape.med.umich.edu/calculator.html). Clique duas vezes no arquivo de .jar baixado para iniciar o aplicativo.
4. Na guia Entrada , clique no botão Procurar para carregar o arquivo de entrada.
5. Em Especificar Formato de Arquivo, use a seta suspensa para selecionar o formato de arquivo de entrada apropriado. Selecione amostras em linhas (Figura suplementar 1).
6. Vá para a guia Normalização de Dados clicando no botão Avançar >> no canto inferior direito da janela.
7. Em Selecionar método(s), marque a caixa ao lado de Log2-Transform Data. Marque a caixa ao lado de Dimensionamento automático de dados.
8. Em Normalizar Dados, clique no botão Executar .
   Observação : quando a normalização estiver concluída, clique no botão Exibir dados normalizados , localizado em Normalizar dados e revise o conjunto de dados atualizado (Figura suplementar 2).
9. Em Normalizar Dados, clique no botão Salvar e salve o novo arquivo de dados.
10. Vá para a guia Análise de Dados clicando no botão Avançar >> no canto inferior direito da janela.
11. Em Calcular Correlação de Pearson, clique em Executar. Determine o melhor intervalo de Correlação de Pearson para os dados.
    1. Clique no botão Exibir histograma . Revise a frequência dos escores máximos de correlação de Pearson por característica.
    2. Clique no botão Exibir mapa de calor . Revise a representação da matriz de correlação de Pearson.
12. Em Filtrar por correlações de Pearson, deixe os números padrão para filtrar por um intervalo de 0,00 a 1,00
    Observação : deslize a pequena seta azul na extremidade direita de 1 e a pequena seta azul à esquerda de 0 para alterar o filtro. Inserir números específicos nas caixas de texto também é uma opção.
13. Em Selecionar Método de Correlação Parcial, selecione o método desejado, Método DSPC.
    Observação : se o número de metabólitos é menor do que o número de amostras no conjunto de dados, somente o método DSPC pode ser usado.
14. Em Calcular correlações parciais, clique no botão Executar (Figura 3 suplementar).
15. Clique no arquivo CSV View e visualize os resultados. Clique no botão Salvar e salve os resultados.
16. Clique no botão Exibir no MetScape para iniciar uma rede de correlação interativa.
    Ver Karnovsky, A. et ^al.6 para obter mais informações sobre o uso do MetScape.
    NOTA: MetScape é uma aplicação Cytoscape que permite a criação e exploração de redes de correlação.

2. Filigrana

1. Baixe um arquivo de entrada delimitado por vírgulas de amostra contendo medidas de metabólitos em http://metscape.med.umich.edu/T1D_primaryMetabolites_noIS_log_scaled_sorted.csv.
2. Clique duas vezes no arquivo de exemplo baixado para abri-lo.
   1. Verifique se o arquivo contém nomes de exemplo na coluna 1 e atribuições de grupo na coluna 2. Confirme se as colunas restantes contêm metabolitos/lípidos.
   2. Certifique-se de que cada linha represente uma amostra.
      NOTA: As medições de metabolitos devem ser transformadas em log e dimensionadas automaticamente, a menos que se execute a agregação de funcionalidades, caso em que as medições só devem ser transformadas em log.
3. Faça o download do aplicativo Filigree Java (http://metscape.med.umich.edu/filigree.html).
   NOTA: Um manual do usuário detalhado está disponível em http://metscape.ncibi.org/v0.1.2Filigree_UserManual.pdf.
4. Clique duas vezes no arquivo de .jar baixado para iniciar o aplicativo.
5. Na guia Dados , clique no botão Procurar para carregar o arquivo de entrada.
6. Em Especificar Colunas/Linhas, clique na seta suspensa ao lado de ID de Exemplo para selecionar o nome da coluna/linha correspondente no arquivo de entrada. Selecione Exemplo.
7. Em Especificar colunas/linhas, clique na seta suspensa ao lado de "Grupo" para selecionar a coluna/linha correspondente no arquivo de entrada. Selecione Grupo.
8. Em Especificar Grupos de Exemplo, clique nas setas suspensas ao lado de cada Grupo para selecionar a coluna de grupo correspondente no arquivo de entrada. Para o Grupo 1, selecione Diabético. Para o Grupo 2, selecione Não diabético.
9. Em Agrupamento de Recursos, marque a caixa ao lado do método desejado, Calcular Grupos de Recursos.
10. Clique no botão Exibir mapas de calor . Visualize o mapa de calor e determine uma redução percentual desejada.
11. Use o controle deslizante Redução de recursos para selecionar a redução percentual desejada de recursos. Deslize o pequeno círculo até que a redução percentual mostre uma relação característica/amostra de 1,25 (Figura 4 suplementar).
12. Vá para a guia Análise clicando no botão Avançar >> no canto inferior direito da janela.
13. Em Selecionar diretório de saída, clique no botão Procurar e selecione o local de diretório desejado para armazenar os arquivos de saída gerados.
14. Clique no botão Executar análise localizado na parte inferior esquerda da janela. As barras de progresso são atualizadas para cada componente de análise (Figura 5 Suplementar). Clique no botão OK na janela pop-up que exibe a mensagem Análise concluída com êxito.
15. Na guia Análise , clique no botão Procurar Redes para abrir as sub-redes interativas do Filigrana em uma guia do navegador.
16. Clique no link Sub-rede 1 na coluna Nome da sub-rede .
17. Explore a sub-rede interativa usando os vários botões. Clique no botão + e aumente o zoom na parte da rede. Clique no botão - e reduza o zoom (Figura 6 Suplementar).
18. Clique em um Nó de Grupo e arraste-o para reposicioná-lo dentro da sub-rede.
    NOTA: A cor do nó representa a regulação ascendente/descendente e a opacidade da cor representa a alteração da dobra superior/inferior. A cor da borda representa o status diferencial entre os grupos.
19. Clique no botão Expandir Recursos no canto superior direito da página para expandir todos os nós do grupo. Revise os compostos específicos que compõem os nós do grupo.
20. Clique no botão Recolher Recursos no canto superior direito da página para recolher os nós de grupo expandidos recentemente.
21. Clique no botão Por Grupo de Amostra no canto superior direito da página para alterar a exibição de uma única sub-rede para várias sub-redes divididas por um grupo. Explore e compare os grupos usando essa visão das sub-redes (Figura 7 Suplementar).
22. Clique no botão Todas as amostras para voltar ao modo de exibição de sub-rede única.
23. Exiba a próxima sub-rede clicando no botão Avançar no canto superior direito da página.
24. Repita as etapas 2.19-2.23 para cada sub-rede.
25. Clique no link Resultados da Análise de Enriquecimento de Rede Diferencial no meio superior da janela para retornar à exibição de tabela de resumo listando todas as sub-redes.
    Observação : importar os arquivos de saída de borda e/ou nó em uma ferramenta de software diferente, como o Cytoscape²³, para criar visualizações de rede adicionais.

3. Considerações adicionais

1. Para computadores Mac com Big Sur (OSX 11.2) ou posterior, aprove a ferramenta no Menu Apple > Preferências do Sistema > Segurança e Privacidade > Geral e selecione Permitir na parte inferior da guia.
2. Além disso, permita o acesso da filigrana aos arquivos no Menu Apple > nas Preferências do Sistema > Segurança e Privacidade > Privacidade selecionando Arquivos e Pastas no menu à esquerda e, em seguida, selecionando Filigrana no menu à direita.

Resultados

Para ilustrar o uso da CorrelationCalculator, construímos uma rede de correlação parcial usando um subconjunto dos dados metabolômicos do estudo populacional KORA descrito em Krumsiek et ^al.24. O conjunto de dados continha 151 metabólitos e 240 amostras. A Figura 1 mostra a rede de correlação parcial resultante que foi visualizada no Cytoscape. A rede contém 148 nós e 272 bordas. A cor dos nós representa metabólitos pertencentes a diferentes classe...

Discussão

Métodos de análise de rede baseados em correlação parcial implementados em CorrelationCalculator e Filigrana ajudam a superar algumas das limitações das análises de vias metabólicas baseadas em conhecimento, especialmente para os conjuntos de dados com alta prevalência de metabólitos desconhecidos e cobertura limitada de vias metabólicas (por exemplo, dados lipidômicos). Essas ferramentas têm sido amplamente utilizadas pela comunidade de pesquisa para analisar uma ampla gama de dados metabolômicos e lipidô...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorrelationCalculator	JAVA	http://metscape.med.umich.edu/calculator.html
clusterNet		https://github.com/Karnovsky-Lab/clusterNet
Cytoscape	Cytoscape	https://cytoscape.org/
Filigree	JAVA	http://metscape.med.umich.edu/filigree.html
MetScape	Cytoscape	https://apps.cytoscape.org/apps/metscape	Cytoscape application that allows for the creation and exploration of correlation networks.