CorrelationCalculator и филигрань: инструменты для сетевого анализа метаболомных данных на основе данных

Резюме

Мы представляем CorrelationCalculator и Filigree, два инструмента для построения сетей на основе данных и анализа данных метаболомики. CorrelationCalculator поддерживает построение единой сети взаимодействия метаболитов на основе данных экспрессии, в то время как Filigree позволяет построить дифференциальную сеть с последующей кластеризацией и обогащением сети.

Аннотация

Серьезной проблемой при анализе омиксных данных является извлечение практических биологических знаний. Метаболомика не является исключением. Общая проблема связи изменений уровней отдельных метаболитов с конкретными биологическими процессами осложняется большим количеством неизвестных метаболитов, присутствующих в исследованиях нетаргетной жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Кроме того, вторичный метаболизм и липидный обмен слабо представлены в существующих базах данных путей. Чтобы преодолеть эти ограничения, наша группа разработала несколько инструментов для построения и анализа сетей на основе данных. К ним относятся CorrelationCalculator и Filigree. Оба инструмента позволяют создавать сети на основе частичной корреляции на основе данных экспериментальной метаболомики, когда количество метаболитов превышает количество образцов. CorrelationCalculator поддерживает построение единой сети, в то время как Filigree позволяет построить дифференциальную сеть с использованием данных из двух групп выборок с последующей кластеризацией и обогащением сети. Мы опишем полезность и применение обоих инструментов для анализа реальных метаболомических данных.

Введение

В последнее десятилетие метаболомика превратилась в омиксную науку благодаря достижениям в области аналитических технологий, таких как газовая хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС) и жидкостная хромато-масс-спектрометрия (ЖХ-МС). Эти методы позволяют одновременно измерять сотни и тысячи низкомолекулярных метаболитов, создавая сложные многомерные наборы данных. Эксперименты по метаболомике могут проводиться как в таргетном, так и в нетаргетном режимах. Целевые эксперименты по метаболомике измеряют определенные классы метаболитов. Они, как правило, основаны на гипотезах, в то время как нецелевые подходы пытаются измерить как можно больше метаболитов и по своей природе генерируют гипотезы. Таргетные анализы обычно включают внутренние стандарты и, таким образом, позволяют проводить абсолютное количественное определение интересующих метаболитов. В отличие от этого, нетаргетные анализы позволяют проводить относительную количественную оценку и включают много неизвестных метаболитов¹.

Анализ метаболомных данных представляет собой многоступенчатый процесс, в котором используется множество специализированных программных средств¹. Его можно разделить на следующие три основных этапа: (1) обработка данных и контроль качества, (2) статистический анализ и (3) интерпретация биологических данных. Описанные здесь инструменты предназначены для обеспечения последнего этапа анализа.

Интуитивно понятный и популярный способ интерпретации данных метаболомики заключается в сопоставлении экспериментальных измерений с метаболическими путями. Для^{достижения этой} цели было разработано множество инструментов, в том числе Metscape^, разработанный нашей группой⁶. Картирование путей часто сочетается с анализом обогащения, который помогает определить наиболее значимые пути ^7,8. Эти методы впервые получили известность при анализе данных экспрессии генов и были успешно применены для анализа данных протеомики и эпигеномики 9,10,11,12,13. Тем не менее, анализ данных метаболомики создает ряд проблем для подходов, основанных на знаниях. Во-первых, в дополнение к эндогенным метаболитам, метаболомные анализы измеряют экзогенные соединения, в том числе те, которые поступают из продуктов питания и других источников окружающей среды. Эти соединения, а также метаболиты, продуцируемые бактериями, не могут быть сопоставлены с человеческими или метаболическими путями других эукариотических организмов. Кроме того, охват путей вторичного метаболизма и липидного обмена в настоящее время не позволяет картировать данные с высоким разрешением на уровне, который легко поддерживал бы биологическую интерпретацию данных^14,15.

Методы сетевого анализа на основе данных могут помочь преодолеть эти проблемы. Например, корреляционные сети могут помочь выявить взаимосвязи между как известными, так и неизвестными метаболитами и облегчить аннотирование неизвестных¹⁶. В то время как вычисление коэффициентов корреляции Пирсона является наиболее простым подходом к установлению линейных отношений между метаболитами, его недостаток заключается в том, что он охватывает как прямые, так и косвенные связи^17,18,19. В качестве альтернативы можно вычислить коэффициенты частичной корреляции, которые могут различать прямые и косвенные связи. Геометрическое графическое моделирование (GGM) может быть использовано для оценки сетей частичной корреляции. Однако GGM требует, чтобы размер выборки и количество признаков были сопоставимы. Это состояние редко встречается в нецелевых данных ЖХ-МС, которые содержат измерения тысяч метаболических особенностей. Для преодоления этого ограничения можно использовать методы регуляризации. Графическое лассо (Глассо) и узловая регрессия являются популярными методами регуляризованного оценивания частичной корреляционной сети ^16,20.

Первый из представленных здесь инструментов биоинформатики, CorrelationCalculator¹⁶, основан на алгоритме смещенной разреженной частичной корреляции (DSPC). DSPC основан на графическом моделировании лассо. В основе алгоритма лежит предположение, что число связей между метаболитами значительно меньше, чем число образцов, т.е. частичная корреляционная сеть метаболитов разрежена. Это предположение позволяет DSPC обнаружить связь между большим количеством метаболитов с использованием меньшего количества образцов, используя методы регуляризованной регрессии. Кроме того, используя шаг устранения смещения для регуляризованных регрессионных оценок, он получает выборочные распределения для параметров ребер, которые могут быть использованы для построения доверительных интервалов и проверки интересующих гипотез (например, наличие/отсутствие одного или группы ребер). Таким образом, наличие или отсутствие ребра в сети частичной корреляции может быть формально проверено с помощью вычисленных p-значений.

CorrelationCalculator оказался очень полезным для одногруппового анализа¹⁶; Однако целью многих экспериментов по метаболомике является дифференциальный анализ двух или более условий. Несмотря на то, что CorrelationCalculator можно использовать для каждой из групп отдельно для создания сетей частичной корреляции для каждого условия, этот подход ограничивает количество выборок, которые могут быть использованы для создания сети. Поскольку достаточно большой размер выборки является одним из самых важных соображений в анализе, основанном на данных, методы, которые могут использовать все доступные выборки данных для построения сетей, крайне желательны. Этот подход реализован во втором представленном здесь инструменте под названием Filigree²¹. Филигрань опирается на ранее опубликованный алгоритм дифференциального анализа обогащения сети (DNEA)²². В таблице 1 показаны приложения и рабочий процесс обоих инструментов.

Количество условий эксперимента (k)	k = 1	k = 2
Программный инструмент	CorrelationCalculator (Калькулятор корреляции)	Филигрань
Входные данные	• Матрица данных метаболитов x Samples	• Матрица данных метаболитов x Samples • Экспериментальные группы
Рабочий процесс •Предварительная обработка • Оценка сети • Кластеризация сети • Анализ обогащения	• Логарифмическое преобразование; Автомасштабирование • DSPC • Через внешние приложения •Нет	• Логарифмическое преобразование; Автомасштабирование • Оценка совместной сети • Кластеризация консенсуса • НетГСА
Визуализация данных	Через внешнее приложение, например, Cytoscape	Через внешнее приложение, например, Cytoscape
Тестирование метаболических модулей на связь с интересующим исходом (опционально)	Через внешние приложения	Через внешние приложения

Таблица 1: Область применения и рабочий процесс CorrelationCalculator и Filigree.

протокол

1. Калькулятор корреляции

1. Загрузите образец входного файла с разделителями-запятыми, содержащий список метаболитов с экспериментальными измерениями на http://metscape.med.umich.edu/kora_data_240.csv.
2. Дважды щелкните загруженный файл примера, чтобы открыть его.
   1. Убедитесь, что файл содержит метки как для образцов, так и для метаболитов.
   2. Так как образцы находятся в строках, убедитесь, что первый столбец — это имена образцов, а первый — имена метаболитов.
3. Загрузите Java-приложение CorrelationCalculator (http://metscape.med.umich.edu/calculator.html). Дважды щелкните загруженный файл .jar, чтобы запустить приложение.
4. На вкладке « Входные данные » нажмите кнопку «Обзор », чтобы загрузить входной файл.
5. В разделе «Указать формат файла» используйте стрелку раскрывающегося списка, чтобы выбрать соответствующий формат входного файла. Выберите образцы в строках (дополнительный рисунок 1).
6. Перейдите на вкладку Нормализация данных , нажав кнопку Далее >> в правом нижнем углу окна.
7. В разделе Select Method(s) установите флажок Log2-Transform Data (Данные преобразования Log2). Установите флажок рядом с пунктом Автомасштабирование данных.
8. В разделе « Нормализация данных» нажмите кнопку «Выполнить ».
   ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения нормализации нажмите кнопку View Normalized Data, расположенную в разделе Normalize Data, и просмотрите обновленный набор данных (дополнительный рисунок 2).
9. В разделе « Нормализация данных» нажмите кнопку «Сохранить » и сохраните новый файл данных.
10. Перейдите на вкладку Анализ данных , нажав кнопку Далее >> в правом нижнем углу окна.
11. В разделе « Вычислить корреляцию Пирсона» нажмите кнопку «Выполнить». Определите наилучший диапазон корреляции Пирсона для данных.
    1. Нажмите кнопку Просмотреть гистограмму . Просмотрите частоту максимальных оценок корреляции Пирсона для каждого признака.
    2. Нажмите кнопку Просмотреть тепловую карту . Просмотрите представление корреляционной матрицы Пирсона.
12. В разделе «Фильтр по корреляциям Пирсона» оставьте числа по умолчанию для фильтрации по диапазону от 0,00 до 1,00
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сдвиньте маленькую синюю стрелку справа от 1 и маленькую синюю стрелку слева от 0, чтобы изменить фильтр. Также можно ввести определенные числа в текстовые поля.
13. В разделе Select Partial Correlation Method (Выбор метода частичной корреляции) выберите нужный метод DSPC (Метод DSPC).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество метаболитов меньше, чем количество образцов в наборе данных, можно использовать только метод DSPC.
14. В разделе Calculate Partial Correlations нажмите кнопку Run (дополнительный рисунок 3).
15. Нажмите « Просмотреть CSV-файл» и просмотрите результаты. Нажмите кнопку Сохранить и сохраните результаты.
16. Нажмите кнопку Просмотреть в MetScape, чтобы запустить интерактивную корреляционную сеть.
    Karnovsky, A. et ^al.6 для получения дополнительной информации об использовании MetScape.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MetScape - это приложение Cytoscape, которое позволяет создавать и исследовать корреляционные сети.

2. Филигрань

1. Загрузите образец входного файла с разделителями-запятыми, содержащий измерения метаболитов в http://metscape.med.umich.edu/T1D_primaryMetabolites_noIS_log_scaled_sorted.csv.
2. Дважды щелкните загруженный файл примера, чтобы открыть его.
   1. Убедитесь, что файл содержит примеры имен в столбце 1 и назначения групп в столбце 2. Убедитесь, что остальные столбцы содержат метаболиты/липиды.
   2. Убедитесь, что каждая строка представляет собой образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения метаболитов должны быть логарифмически преобразованы и автоматически масштабированы, если не выполняется агрегация признаков, в этом случае измерения должны быть преобразованы только по логарифму.
3. Загрузите Java-приложение Filigree (http://metscape.med.umich.edu/filigree.html).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное руководство пользователя доступно на сайте http://metscape.ncibi.org/v0.1.2Filigree_UserManual.pdf.
4. Дважды щелкните загруженный файл .jar, чтобы запустить приложение.
5. На вкладке Данные нажмите кнопку Обзор , чтобы загрузить входной файл.
6. В разделе «Указать столбцы/строки» щелкните стрелку раскрывающегося списка рядом с пунктом «Идентификатор образца», чтобы выбрать соответствующее имя столбца/строки из входного файла. Выберите Образец.
7. В разделе «Указать столбцы/строки» нажмите на стрелку раскрывающегося списка рядом с пунктом «Группа», чтобы выбрать соответствующий столбец/строку из входного файла. Выберите Группа.
8. В разделе «Указать группы образцов» нажмите на стрелки раскрывающегося списка рядом с каждой группой , чтобы выбрать соответствующий столбец группы из входного файла. Для Группы 1 выберите Диабетический. Для Группы 2 выберите Недиабетический.
9. В разделе Группировка объектов отметьте маркер рядом с нужным методом, Вычислить группы объектов.
10. Нажмите кнопку Просмотреть тепловые карты . Просмотрите тепловую карту и определите желаемое процентное снижение.
11. Используйте ползунок Уменьшение объектов , чтобы выбрать желаемое процентное уменьшение объектов. Сдвиньте маленький кружок до тех пор, пока процентное уменьшение не покажет отношение признака к выборке, равное 1,25 (дополнительный рисунок 4).
12. Перейдите на вкладку Анализ , нажав кнопку Далее >> в правом нижнем углу окна.
13. В разделе « Выбор выходного каталога» нажмите кнопку «Обзор» и выберите нужный каталог для хранения сгенерированных выходных файлов.
14. Нажмите кнопку Запустить анализ , расположенную в левом нижнем углу окна. Индикаторы выполнения обновляются для каждого компонента анализа (дополнительный рисунок 5). Нажмите кнопку OK во всплывающем окне, в котором появится сообщение Анализ завершен успешно.
15. На вкладке Анализ щелкните кнопку Обзор сетей , чтобы открыть интерактивные филигранные подсети на вкладке браузера.
16. Щелкните ссылку Подсеть 1 в столбце Имя подсети .
17. Исследуйте интерактивную подсеть с помощью различных кнопок. Нажмите кнопку + и увеличьте масштаб части сети. Нажмите кнопку - и уменьшите масштаб (дополнительный рисунок 6).
18. Щёлкните по групповому узлу и перетащите его, чтобы переместить в подсети.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет узла представляет собой регулировку вверх/вниз, а непрозрачность цвета представляет изменение сгиба в большую/меньшую сторону. Цвет кромки представляет собой дифференциальное состояние между группами.
19. Щелкните кнопку Развернуть объекты в правом верхнем углу страницы, чтобы развернуть все узлы группы. Просмотрите конкретные соединения, из которых состоят узлы группы.
20. Щелкните кнопку Свернуть объекты в правом верхнем углу страницы, чтобы свернуть недавно развернутые узлы группы.
21. Щелкните кнопку По группе выборки в правом верхнем углу страницы, чтобы изменить вид с одной подсети на несколько подсетей, разделенных группой. Исследуйте и сравните группы, используя это представление подсетей (дополнительный рисунок 7).
22. Щелкните кнопку Все выборки , чтобы вернуться к виду одной подсети.
23. Просмотрите следующую подсеть, нажав кнопку Далее в правом верхнем углу страницы.
24. Повторите шаги 2.19-2.23 для каждой подсети.
25. Щелкните ссылку Результаты анализа обогащения дифференциальной сети в верхней середине окна, чтобы вернуться к сводной таблице, в которой перечислены все подсети.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Импортируйте выходные файлы ребер и/или узлов в другой программный инструмент, например Cytoscape²³, для создания дополнительных визуализаций сети.

3. Дополнительные соображения

1. На компьютерах Mac под управлением Big Sur (OSX 11.2) или более поздней версии одобрите инструмент в меню Apple > «Системные настройки» > «Безопасность и конфиденциальность» > «Основные» и выберите «Разрешить » в нижней части вкладки.
2. Кроме того, разрешите Filigree доступ к файлам в меню Apple > «Системные настройки» > «Безопасность и конфиденциальность» > «Конфиденциальность », выбрав «Файлы и папки » в меню слева, а затем выбрав « Филигрань » в меню справа.

Результаты

Чтобы проиллюстрировать использование CorrelationCalculator, мы построили сеть частичной корреляции, используя подмножество данных метаболомики из популяционного исследования KURA, описанного в Krumsiek et ^al.24. Набор данных содержал 151 метаболит и 240 образцов. На рисунке 1

Обсуждение

Методы сетевого анализа, основанные на частичной корреляции, реализованные в CorrelationCalculator и Filigree, помогают преодолеть некоторые ограничения анализа метаболических путей, основанных на знаниях, особенно для наборов данных с высокой распространенностью неизвестных метаболитов и ограни...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorrelationCalculator	JAVA	http://metscape.med.umich.edu/calculator.html
clusterNet		https://github.com/Karnovsky-Lab/clusterNet
Cytoscape	Cytoscape	https://cytoscape.org/
Filigree	JAVA	http://metscape.med.umich.edu/filigree.html
MetScape	Cytoscape	https://apps.cytoscape.org/apps/metscape	Cytoscape application that allows for the creation and exploration of correlation networks.