Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen Assay zur Quantifizierung der Fütterungsrate von Caenorhabditis elegans , der auf der Messung der Clearance von Bakterien in Flüssigkulturen basiert.

Zusammenfassung

Die Nahrungsaufnahme ist ein wesentlicher biologischer Prozess für das Wachstum, die Fortpflanzung und das Überleben eines Organismus. Dieser Assay zielt darauf ab, die Nahrungsaufnahme von Caenorhabditis elegans (C. elegans) zu messen, ein wichtiger Parameter bei der Untersuchung der Genetik des Alterns oder des Stoffwechsels. Bei den meisten Arten wird die Fütterung durch Messung der Differenz zwischen der bereitgestellten Futtermenge und der nach einem bestimmten Zeitintervall verbleibenden Menge bestimmt. Die hier vorgestellte Methode verwendet die gleiche Strategie, um die Fütterung von C. elegans zu bestimmen. Er misst die Menge an Bakterien, der Nahrungsquelle von C. elegans, die innerhalb von 72 h beseitigt wurden. Diese Methode verwendet 96-Well-Mikrotiterplatten und ermöglichte das Screening von Hunderten von Medikamenten auf ihre Fähigkeit, die Nahrungsaufnahme in einer Geschwindigkeit und Tiefe zu modulieren, die in anderen Tiermodellen nicht möglich ist. Die Stärke dieses Assays besteht darin, dass er es ermöglicht, die Fütterung und die Lebensdauer gleichzeitig zu messen und das Verschwinden von Lebensmitteln direkt zu messen, und somit auf den gleichen Prinzipien basiert, die auch für andere Organismen verwendet werden, was den Vergleich von Art zu Art erleichtert.

Einleitung

Caenorhabditis elegans wurde in der Alternsforschung ausgiebig eingesetzt.  Es war ein leistungsfähiges Modell, um die Genetik zu untersuchen, die der stoffwechselvermittelten Langlebigkeit zugrunde liegt, die durch Ernährungseinschränkungen, verminderte mitochondriale Aktivität oder verminderte Insulinsignalisierung induziert wird. 1,2,3,4,5,6,7. Die Messung der Fütterung im Kontext der Langlebigkeit hat sich für C. elegans jedoch aufgrund der geringen Größe des Tieres als schwierig erwiesen 3,8,9,10,11,12,13,14,15.

Die Fütterung ist ein grundlegendes biologisches Verhalten, das für das Überleben erforderlich ist, und seine strenge Regulierung ist der Kern der Aufrechterhaltung der Stoffwechselgesundheit, der Fortpflanzung und des Alterns. Das Fressverhalten wird durch mehrere Signalwege sowohl im Nervensystem als auch in der Peripherie gesteuert und kann daher nur in vivo untersucht werden 16,17,18,19. Die Ernährung stellt die erste von drei Säulen dar: (i) die Energieaufnahme, (ii) die Energiespeicherung und (iii) der Energieverbrauch, der die Energiehomöostase eines Organismus steuert. Die Fütterung bei C. elegans wurde hauptsächlich durch Messung des Pharynxpumpens untersucht, der durch die Kontraktionsrate des Pharynx definiert wird. Dieser Ansatz hat entscheidende Einblicke in das Fressverhalten von C. elegans geliefert 3,4,8,12,13,20,21; Das Pumpen des Rachens, insbesondere gemessen über kurze Zeiträume von Minuten, korreliert jedoch nicht unbedingt mit der Nahrungsaufnahme.

Die Nahrungsaufnahme wird nicht nur durch die pharyngeale Pumprate bestimmt, sondern auch durch Parameter wie Dauer und Häufigkeit der Fressvorgänge und die Dichte der Nahrungsbakterien. Ein Tier kann einen sehr hohen Rachenpump haben, aber die Länge seiner Fressanfälle kann kürzer sein, was die erhöhte Frequenz ausgleicht. Ein weiterer Störfaktor ist die Effizienz, mit der beim Pumpen Bakterien aufgenommen und zerkleinert werden können oder auch nicht. Ein extremes Beispiel für die Entkopplung der Nahrungsaufnahme vom Rachenpumpen ist die Zugabe von Serotonin ohne Nahrung (Bakterien). In Gegenwart von exogenem Serotonin pumpen die Tiere mit einer hohen Geschwindigkeit, aber ohne Bakterien führt die hohe Pumprate nicht zur Nahrungsaufnahme 2,6,13,22,23.

Die hier vorgestellte Methode zur bakteriellen Clearance misst die Nahrungsaufnahme von Wurmpopulationen in einzelnen Vertiefungen ebenso wie den Rückgang der Bakterienkonzentrationen im Laufe der Zeit (Abbildung 1). Dieser Ansatz ähnelt denen, die bei anderen Arten verwendet werden, bei denen das Verschwinden von Nahrung ein Maß für die Nahrungsaufnahme darstellt 10,11,24,25,26,27,28. In der ursprünglichen Veröffentlichung haben wir diese Methode zur Messung der Nahrungsaufnahme validiert, indem wir C. elegans mit ¹⁵N-Isotopen-markierten Bakterien gefüttert^{haben 11}. Nachfolgende Messungen mittels Massenspektrometrie zeigten, dass die Messung des Verschwindens von Bakterien stark mit dem Auftreten der Isotopenmarkierung korrelierte, was die tatsächliche Aufnahme der Bakterien in das Tier aufzeigte¹¹. Daher sind wir zuversichtlich, dass der bakterielle Clearance-Assay in den meisten Fällen die Nahrungsaufnahme darstellt. Der Zweck des Assays besteht nicht darin, den pharyngealen Pump-Assay zu ersetzen, sondern den Werkzeugkasten der Assays zu erweitern, um die Fütterung und den Stoffwechsel bei C. elegans und deren Zusammenhang mit dem Altern und der Langlebigkeit zu untersuchen.

Protokoll

Abbildung 1: Schematische Darstellung des bakteriellen Clearance-Assays. Grafische Gliederung der Hauptabschnitte des Protokolls (von oben nach unten): Vorbereitung von Bakterien, Synchronisierung der Wurmpopulation, Aussaat in 96-Well-Platten, Sterilisation von Würmern, Hinzufügen von Medikamenten, Messung von OD₆₀₀ an Tag 1 und Tag 4. Eine detaillierte Beschreibung dieser einzelnen Schritte finden Sie links neben jeder Abbildung. Abkürzungen: OD = optische Dichte; FUdR = Fluordeoxyuridin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Vorbereitung der Bakterien

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Vorbereitung der in diesem Assay verwendeten Fütterungsbakterien beschrieben. Der spezifische E. coli-Stamm , der im Assay verwendet wird, wird als OP50 bezeichnet. OP50 ist der am weitesten verbreitete Stamm zur Fütterung von C. elegans. Der verwendete OP50-Stamm ist Carbenicillin/Ampicillin-resistent, was eine Kreuzkontamination der Wurmkultur mit anderen Bakterien verhindert⁹.

1. Bereiten Sie den OP50 4-5 Tage im Voraus vor und bestrahlen Sie ihn einen Tag vor der Anwendung. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien, die auf OP50 treffen, steril sind^29,30.
2. Tag -8: Mittwoch (Woche 1):
   1. Bereiten Sie das Präinokulum vor, indem Sie 5 ml LB mit 100 μg/ml Ampicillin und 0,1 μg/ml Amphotericin B und eine einzelne OP50-Kolonie beimpfen und ca. 6 h bei 37 °C in einem Bakterienschüttler inkubieren. Impfen Sie frühzeitig, damit die Kultur ausreichend wachsen kann, damit sie trüb wird.
   2. Sobald die Kultur trüb ist, verdünnen Sie die Präinokulumkultur von OP50 um 1:2.000 in 250 ml TB mit 100 μg/ml Ampicillin. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht in einem Bakterienschüttler für 17-19 Stunden bei 37 °C.
      HINWEIS: Die Kultur sollte nicht länger als 19 h wachsen dürfen.
3. Tag -7: Donnerstag (Woche 1)
   1. Nach der 17-19-stündigen Inkubation wird die OP50-Flüssigkultur in ein steriles Zentrifugationsröhrchen überführt und 15 Minuten lang bei 3.100 × g in einer Tischzentrifuge bei 4 °C zentrifugiert.
   2. Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das OP50-Pellet mit sterilem Wasser und zentrifugieren Sie es erneut. Wiederholen Sie diese Wäsche 2x.
   3. Nach dem zweiten Waschen den Überstand entsorgen, das OP50-Pellet in sterilem Wasser auf ein Volumen von 50 mL resuspendieren und in ein vorgewogenes konisches 50-ml-Röhrchen umfüllen. Pelletieren Sie den OP50 durch Zentrifugation für 20 min bei 3.100 × g in einer Tischzentrifuge bei 4 °C.
   4. Entfernen Sie nach dem dritten Waschen vorsichtig alle restlichen Überstände und stellen Sie sicher, dass kein Wasser in der Tube verbleibt. Berechnen Sie das Gewicht des Pellets, indem Sie das Gewicht des leeren Zentrifugationsrohrs vom Gewicht des Zentrifugationsrohrs mit dem Pellet abziehen.
      HINWEIS: Die Pelletgewichte liegen in der Regel zwischen 3 und 3,5 g.
   5. Resuspendieren Sie das OP50-Pellet gründlich im S-vollständigen Puffer auf eine Konzentration von 100 mg/ml und stellen Sie sicher, dass keine Klumpen vorhanden sind.
   6. Es ist darauf zu achten, dass die Konzentration von OP50 bei 100 mg/ml 2 ×^{10 10} Bakterien/ml entspricht. Wenn der Zusammenhang zwischen der optischen Dichte und der Anzahl der Bakterien pro mL bekannt ist, ist die Bakterienkonzentration pro mL spektrophotometrisch zu bestimmen. Falls erforderlich, verwenden Sie den S-Complete-Puffer, um die Konzentration der OP50-Fütterungslösung auf 2 × 10¹⁰ Bakterien/ml einzustellen.
   7. Testen Sie das OP50 auf einer Agarplatte, um festzustellen, ob es kontaminiert ist.
   8. Lagern Sie den OP50 in einem S-vollständigen Puffer bei 4 °C.

4. Tag -3: Montag (Woche 2)
   1. Töten Sie die Bakterien durch Röntgenbestrahlung ab, um das Bakterienwachstum während des Assays zu verhindern.

2. Synchrone Vorbereitung der Wurmkultur

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Vorbereitung einer synchronen Wurmpopulation erläutert. Alle Materialien, die mit den Wurmpopulationen in Berührung kommen, sind steril. Alle Platten werden, sofern nicht anders angegeben, bei 20 °C aufbewahrt.

1. Tag -6: Freitag (Woche 1), 16:00 Uhr
   1. Übertragen Sie die Tiere auf einen frischen Teller.
      1. Nehmen Sie eine NGM-Platte, auf der der größte Teil der Wurmpopulation aus ausgehungerten L1-Larven besteht.
         HINWEIS: Eine gemischte Grundgesamtheit führt ebenfalls zu Ergebnissen. Die Verwendung von L1-Würmern, die lange Zeit ausgehungert wurden, kann das Fressverhalten in den aktuellen oder zukünftigen Generationen beeinflussen, da Hunger epigenetische Spuren für mindestens drei Generationen hinterlassen kann.
      2. Waschen Sie die Würmer mit nicht mehr als 1 ml sterilem Wasser ab. Aliquotieren Sie ~300 μL der abgewaschenen Wurmpopulation auf NGM-Platten, die mit konzentriertem OP50 (~300 mg/ml) besiedelt sind. Lassen Sie die Platten entweder unter einem Plattentrockner oder einem Bunsenbrenner trocknen. Inkubieren Sie die Platten bei 20 °C, bis ein Großteil der Population trächtige adulte Tiere enthält (Montag).
         HINWEIS: Dieser Zeitrahmen ist für eine Wildtyp-N2-Wurmpopulation optimiert und kann von Stamm zu Stamm variieren. Würmer mit Entwicklungsverzögerungen sollten berücksichtigt und früher in Stücke geschnitten und/oder früher ausgesät werden, damit alle getesteten Stämme gleichzeitig das Erwachsenenalter erreichen.
2. Tag -3: Montag (Woche 2) 10:00 Uhr
   1. Einrichten einer synchronen Population
      VORSICHT! Bleichmittel sind ätzend für Haut und Augen. Für die Handhabung sind Handschuhe und eine Schutzbrille erforderlich.
      1. Sammeln Sie Würmer, indem Sie sie mit bis zu 10 ml sterilem Wasser von der Platte waschen. Übertragen Sie diese Wurm-Wasser-Lösung in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
      2. Waschen Sie die Würmer durch die Schwerkraft ca. 4 min lang auf der Tischplatte (umgekehrt 2 min durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge bei 310 × g waschen.
      3. Entsorgen Sie den Überstand durch Aspiration mit einer kleinen Spitze und fügen Sie bis zu 15 ml steriles Wasser hinzu. 3x wiederholen.
      4. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 5 mL einer frisch zubereiteten Bleich-/NaOH-Lösung hinzu (1,8 mL Haushaltsbleichmittel, 0,5 mL 10 N NaOH, 7,7 mL dH₂O).
      5. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren oder bis die Würmer aufbrechen. Wirbeln Sie mindestens 10 s lang jede Minute sanft ein. Überwachen Sie den Fortschritt unter dem Präpariermikroskop.
         HINWEIS: Die Zeit, die benötigt wird, um die Würmer aufzubrechen, kann von Stamm zu Stamm variieren. Wenn Sie die Würmer zu lange in der Bleichlösung lassen, kann dies zu nicht lebensfähigen Eiern führen.
      6. Fügen Sie M9-Puffer hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren, sobald alle Erwachsenen aufbrechen oder sich auflösen (das Endvolumen beträgt 15 ml) und zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 1.300 × g.
      7. Wasche die Eier 3x mit 13 mL M9 Puffer.
      8. Waschen Sie die Eier einmal mit 10 mL S-complete-Puffer, indem Sie sie 2 Minuten lang bei 1.300 × g zentrifugieren.
      9. Aspirieren Sie den Überstand, fügen Sie 10 ml S-vollständig hinzu und übertragen Sie die Suspension in ein frisches konisches 15-ml-Röhrchen. Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig bei Raumtemperatur über Nacht auf einem Nähgerät oder einem ähnlichen Gerät.
      10. Optional: Wenn nach der abschließenden Zentrifugation in S-vollständigem Puffer adulte Schlachtkörper vorhanden sind, filtrieren Sie die Wurmlösung durch ein 40-μm-Zellsieb.
3. Tag -2: Dienstag (Woche 2), 13:00 Uhr
   1. Aussaat der Tiere in Teller
      1. Prüfen Sie mit einem Präpariergerät, ob die Würmer geschlüpft sind. Bestimmung der Konzentration von Würmern im S-vollständigen Puffer durch Zählung der Wurmpopulation in 10 μl Tropfen mit einem Präparierfernrohr; Zählen Sie 5-10 Tropfen für jede Probe. Wenn die Konzentration der Würmer in jedem 10-μl-Tropfen 30 Würmer pro Tropfen übersteigt, verdünnen Sie den Gesamtbestand mit S-vollständig auf eine niedrigere Wurmdichte pro Tropfen, um die Zählung zu erleichtern.
      2. Die flüssige Wurmmischung wird in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einem Volumen von 120 μl wie folgt ausgesät (Endkonzentrationen): 60 Würmer/ml in S-vollständig, 50 μg/ml Carbenicillin, 0,1 μg/ml Amphotericin und 6 mg/ml OP50, hergestellt in Abschnitt 1.
         HINWEIS: Das zu präparierende Gesamtvolumen hängt von der Anzahl der Platten ab (~12 mL pro 96-Well-Platte). In jeder Vertiefung sollten sich 6-12 Würmer befinden. Alternativ kann eine große Partikeldurchflusszytometrie, wie z. B. die COPAS FP von Union Biometrica, verwendet werden, um 10 Würmer präzise in jede Vertiefung zu sortieren (siehe Abschnitt Crowding-Effekt).
      3. Fügen Sie auch eine flüssige Mischung ohne Würmer hinzu: 50 μg/ml Carbenicillin, 0,1 μg/ml Amphotericin und 6 mg/ml OP50, die in Abschnitt 1 hergestellt wurden.
      4. Geben Sie 120 μl der No-Worms-Mischung in Reihe H der 96-Well-Platte, die zur Bestimmung der Selbstlysewerte verwendet wird, wie bereits erwähnt. 120 μl pro Vertiefung der Mischung mit den Würmern in den Reihen A-G geben.
         HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Würmer während des Pipettierens in Schwebe gehalten werden (siehe Abbildung 2A, B). Wir verwenden durchsichtige 96-Well-Platten mit flachem Boden. Unser Plattenlayout unterteilt die Platte, um 4 oder 6 Bedingungen zu erzeugen, bei denen jedes Spaltenpaar eine andere medikamentöse Behandlung oder einen anderen Wurmstamm darstellt und die untere Reihe als "No Worm"-Kontrolle dient (Abbildung 2A, B).
      5. Um Kontamination und Verdunstung zu vermeiden, versiegeln Sie die Platte mit einem Klebebandversiegeler. Die Platten werden ca. 65 h bei 20 °C inkubiert, bis die Tiere zu L4-Würmern werden.
4. Tag 0: Donnerstag (Woche 2) vor Mittag.
   1. Sterilisation der Wurmpopulation durch Zugabe von Fluordesoxyuridin (FUdR).
      1. Geben Sie 30 μl einer 0,6 mM FUdR-Stammlösung hinzu, um die Tiere in jeder Vertiefung zu sterilisieren. Verschließen Sie die Platte wieder mit Klebebandversiegelern und schütteln Sie die Platten 20 Minuten lang auf einem Mikrotiterplattenschüttler bei 800 U/min. Platten wieder in den 20 °C Inkubator zurückführen.
         HINWEIS: In diesem Schritt wird die endgültige OP50-Konzentration von 6 mg/ml auf 5 mg/ml (1 × 10⁹ Bakterien/ml) reduziert, und jede Vertiefung hat ein Endvolumen von 150 μl. Es ist wichtig, FUdR zum L4-Stadium hinzuzufügen, bevor die Tiere das Erwachsenenalter erreichen.
5. Tag 1: Freitag (Woche 2)
   1. Fügen Sie der Kultur Drogen hinzu.
      1. Vergewissern Sie sich um 9:00 Uhr, dass die meisten Tiere trächtig sind und jede Vertiefung mehrere Eier enthält. Geben Sie bei Bedarf Medikamente in der gewünschten Konzentration hinzu (siehe Diskussion).
      2. Verschließen Sie die Platten nach der Zugabe des Arzneimittels mit einem Klebeband und schütteln Sie die Platten 20 Minuten lang bei 800 U/min auf einem Plattenschüttler.
         HINWEIS: Das Schütteln stellt sicher, dass alle Bakterienklumpen aufgelöst werden, ohne die Versiegelung zu berühren. Sowohl bakterielle Klumpen als auch Flüssigkeit auf der Versiegelung verfälschen den OD_600-Messwert . Wenn sich Flüssigkeitstropfen auf dem Versiegelungsmittel befinden, schleudern Sie es kurz für 10-20 s bei 310 × g. Nochmals auf dem Shaker 5 min schütteln und abmessen.
      3. Entfernen Sie nach 20 Minuten Schütteln auf dem Mikrotiterplattenschüttler den Deckel und die Versiegelung und messen Sie den OD₆₀₀ in einem Plattenlesegerät. Dies ist die Messung des OD₆₀₀ an Tag 1. Versiegeln Sie die Platten und führen Sie sie in einen 20 °C Inkubator zurück.
         HINWEIS: Da sich Bakterien schnell ansiedeln, sollte die Messung innerhalb von 10 Minuten nach dem Schütteln der Platten erfolgen.
      4. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um die Population der Würmer auf Anzeichen von Kontamination oder Toxizität zu untersuchen, wenn ein Medikament hinzugefügt wurde. Stellen Sie die Platten wieder in den 20 °C heißen Inkubator.
6. Tag 4: Montag (Woche 3)
   1. Nehmen Sie die Messung von Tag 4 OD₆₀₀ .
      1. Wiederholen Sie den Lesevorgang ab Tag 1 (Schritt 2.5.1.3), um den Wert für Tag 4 OD₆₀₀ zu erhalten. Schütteln Sie die Platten vor der OD_600-Messung 20 min lang bei 800 U/min auf dem Mikrotiterplattenschüttler.
      2. Zählen Sie an einem inversen Mikroskop, idealerweise mit einem 2-fach-Objektiv, die Population der Würmer in jeder Vertiefung und notieren Sie sie in einer Tabelle. Stellen Sie die Platten nach dem Zählen wieder in den 20 °C heißen Inkubator.
         HINWEIS: Ein Beispiel unseres Bewertungsbogens finden Sie in den Zusatzmaterialien.
      3. Nach der Messung an Tag 4 sind die Messungen der Nahrungsaufnahme abgeschlossen. Bewahren Sie diese Platten bei Bedarf für die Lebensdaueranalyse auf.
         HINWEIS: Dieses Protokoll ist kompatibel mit Solis und Petrascheck³¹.

3. Analyse der Daten zur Nahrungsaufnahme

Abbildung 2: Design und Analyse. (A, B) Mögliche Plattendesigns für 4 und 6 Bedingungen mit den Kontrollwellen "ohne Wurm" in Reihe H. Diese Vertiefungen sind notwendig, um die Selbstlyserate zu bestimmen. Geben Sie in jeder Platte immer eine unbehandelte N2-Kontrollpopulation als Referenz an. (C) Beispieldaten, die in der bereitgestellten Tabelle gesammelt wurden, mit der Anzahl der Würmer (grüner Kasten), den beiden OD_{600-Messungen} an den Tagen 1 und 4 (orangefarbene Kästchen), den Selbstlysewerten (blauer Kasten) und der Auswertung anhand der Formel (2) ((OD₆₀₀ -Selbstlyse)/X0) im roten Kasten. Das hier gezeigte konkrete Beispiel verwendet das in (B) gezeigte Plattendesign. Abkürzungen: OD = optische Dichte; X0 = Anzahl der Würmer pro Vertiefung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie die Daten zur Nahrungsaufnahme aus Abschnitt 2 dieses Protokolls analysiert werden. Die ersten Werte, die berechnet werden, sind die Selbstlysekontrollwerte . Bakterien lysieren mit der Zeit in Flüssigkeit, auch wenn keine Würmer vorhanden sind. Dieser Selbstlysewert kann auch durch viele Chemikalien beeinflusst werden und muss kontrolliert werden, da er im Vergleich zur Nahrungsaufnahme eines Wurms relativ groß ist. Wie in Schritt 2.3.1.4 beschrieben und in der Plattenanordnung in Abbildung 2A, B, gezeigt, enthält Reihe H die gleiche Lösung, ohne die Würmer. In unserem in Abbildung 2B gezeigten Plattenaufbau gibt es 14 Wells pro Bedingung mit jeweils zwei Selbstlysekontroll-Wells (Reihe H, "keine Würmer").

1. Berechnen Sie die Selbstlysekontrollwerte für die Kontrollwells ohne Würmer in jeder Bedingung mit Hilfe von Gleichung ( 1). Stellen Sie sicher, dass für jede Replikatgruppe von Vertiefungen mindestens zwei Vertiefungen ohne Wurmbekämpfung vorhanden sind, wie in Schritt 2.3.1.4 beschrieben. Verwenden Sie den Mittelwert aus allen Kontrollvertiefungen ohne Würmer für den Selbstlysewert für eine Replikatgruppe.
   Selfysis = Mittelwert(OD6₀₀ Tag 1 - OD6₀₀ Tag 4) (1)
   HINWEIS: Für den in Abbildung 2B gezeigten Plattenaufbau würden wir sechs Selbstlysewerte berechnen, einen für jede der sechs Gruppen, indem wir den Mittelwert der beiden Selbstlysekontrollvertiefungen in Reihe H berechnen.
2. Berechnen Sie die Nahrungsaufnahme pro Wurm mit Hilfe der Gleichung
        (2).
   HINWEIS: Die in der Tabelle verwendete Formel (rotes Feld, Abbildung 2C), wobei X0 die Anzahl der Würmer pro Vertiefung ist.
3. Nachdem die Nahrungsaufnahme pro Wurm für jede Vertiefung bestimmt wurde, berechnen Sie die Durchschnittswerte und die Standardabweichung für die gesamte Erkrankung.
   HINWEIS: Für den in Abbildung 2B gezeigten Plattenaufbau sind 14 Replikat-Wells pro Bedingung für statistische Vergleiche ausreichend.
4. Normalisieren Sie jede Bedingung auf die jeweilige unbehandelte N2-Kontrollpopulation. Geben Sie die Änderung der Fütterung als Faltenänderung oder Prozentsatz der N2-Fütterung an.
   HINWEIS: Die Normalisierung erfolgt, da die absoluten Werte von OD6₀₀/X0 aus Gleichung (2) zwischen Experimenten, die an verschiedenen Tagen durchgeführt werden, variieren können.

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll misst die bakterielle Clearance als Messwert für die Nahrungsaufnahme von C. elegans in 96-Well-Mikrotiterplatten. Die Dosis-Wirkungs-Kurven im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" zeigen, dass der Assay die Nahrungsaufnahme quantitativ misst, eine Vorstellung, die unabhängig von isotopenmarkierten Bakterien bestätigt wurde¹¹. Mit diesem Assay haben wir erfolgreich von der FDA zugelassene Medikamente wie Antipsychotika mit bekannten metabolischen Nebenwirkungen beim Menschen getestet und gezeigt, dass diese Medikamente die Fütterung von C. elegans erhöhen ^10,26. Der Assay ist nützlich, um die Genetik oder Pharmakologie der Fütterung zu untersuchen und stellt ein neues Werkzeug für die C. elegans-Forschung zur Untersuchung des Stoffwechsels dar. Dieser Assay bietet eine kostengünstige Methode, um die Fütterung auf skalierbare und zeitsparende Weise zu untersuchen, was bei den meisten anderen Organismen nicht möglich ist. Unsere Arbeit an von der FDA zugelassenen Medikamenten zeigt, dass viele Nebenwirkungen, die bei menschlichen Patienten beobachtet werden, auch bei C. elegans beobachtet werden, was die evolutionäre Konservierung aufzeigt 24,26,32.

Der Assay ist durch die Bakterienkonzentration begrenzt, die innerhalb des linearen Bereichs der OD_600-Messung gemessen werden kann. Infolgedessen sind die Anzahl der Würmer und der Bereich der Bakterienkonzentrationen, die untersucht werden können, begrenzt. Zu viele Würmer beeinflussen OD₆₀₀ , indem sie die Bakterien zu schnell verzehren und somit die Bakterienkonzentration aus dem linearen OD₆₀₀ "fressen". Unserer Erfahrung nach ist die Variabilität in der bakteriellen Vorbereitung der entscheidende Parameter, der dazu führt, dass die Ergebnisse von Experiment zu Experiment variieren. Wir haben erfolglos versucht, große Mengen von Bakterien einzufrieren oder lyophilisierte Bakterien zu verwenden. In diesen Fällen wurde entweder die Selbstlyserate zu hoch, oder die Bakterien waren von einer Qualität, die die Entwicklung von C. elegans verlangsamte. Unsere Tests waren jedoch nicht erschöpfend, und dieses Problem könnte lösbar sein.

Im Allgemeinen ist die Selbstlyserate der Bakterien am schwierigsten zu kontrollieren und kann zu erheblichen Schwankungen führen. Wir fanden heraus, dass einige Medikamente die Selbstlyserate auf ein Niveau erhöhen können, bei dem der Assay die Nahrungsaufnahme nicht zuverlässig bestimmen konnte. Da die Selbstlyserate im Laufe der Zeit im Assay zunimmt, haben wir die Nahrungsaufnahme über den 5. Tag des Erwachsenenalters hinaus nicht gemessen. In diesem Alter sind die Bakterien ~10 Tage in Kultur. Um die Nahrungsaufnahme nach dem 5. Tag des Erwachsenenalters zu messen, müssen die alten Bakterien abgewaschen und durch frische ersetzt werden.

Der vorgestellte Assay ist eine Erweiterung unseres auf 96-Well-Mikrotiterplatten basierenden Lebensdauer-Assays³¹. Diese Kombination ermöglicht die Messung der Lebensdauer und der Nahrungsaufnahme in derselben Population. Während der hier vorgestellte Bakterien-Clearance-Assay aufgrund der bakteriellen Selbstlyse keine Bestimmung der Nahrungsaufnahme über das gesamte Leben von C. elegans ermöglicht, liefert er solide Daten für die ersten vier Tage des Erwachsenenalters, die Zeit mit der höchsten Nahrungsaufnahme. Insbesondere für die Entdeckung kleiner molekularer Wirkstoffe ist die Kontrolle der Nahrungsaufnahme unerlässlich. Zusammenfassend gehen wir davon aus, dass der vorgestellte Assay für die C. elegans-Gemeinschaft nützlich sein wird und das Instrumentarium zur Untersuchung des Stoffwechsels oder zur Steuerung des Stoffwechsels im Rahmen von Alterungs- und Lebensdauerstudien erweitert.

Planung:

Bevor Sie planen, die Nahrungsaufnahme zu messen, müssen einige Überlegungen angestellt werden.

Abtötung der Bakterien:

Wir töten Bakterien durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen in einer konischen 50-ml-Röhre (900 Gray für 4 h eingestellt auf 160,0 kV und 25,0 mA). Für die Bestrahlung verwenden wir den RS2000 von Rad Source. Je nach Ausstattung können die spezifische Zeit und die Strahlendosis von Einrichtung zu Einrichtung variieren. Die vollständige Abtötung der Bakterien muss durch Plattieren der Bakterien nach der Bestrahlung bestimmt werden, um Überlebende durch Wachstum zu erkennen. Es ist wichtig, alle Bakterien abzutöten, um ein Wachstum während des Assays zu verhindern, da dies zu einer Unterschätzung der Fütterung oder sogar zu negativen Fütterungswerten führt. Wichtig ist, dass die Bakterien abgetötet werden, damit C. elegans sie immer noch frisst. Nach unserer Erfahrung gibt es drei Möglichkeiten, große Mengen an Bakterien zuverlässig abzutöten: (i) Bestrahlung durch Röntgenstrahlen, (ii) durch γ-Strahlen und (iii) die Zugabe von Formaldehyd^29,30. Die Selbstlyseraten zwischen diesen drei Methoden sind vergleichbar, mit einem Variationskoeffizienten von 8 % zwischen den Selbstlyseraten für die in Abbildung 3B gezeigten Experimente. Methoden, die in unseren Händen nicht zuverlässig funktionierten, waren UV-Bestrahlung, Antibiotika-Cocktails, Hitzeinaktivierung und Natriumazid. Diese Methoden töten die Bakterien entweder nicht vollständig ab (UV-Strahlung und Antibiotika), produzieren Bakterien, die C. elegans nicht frisst (Hitze), oder verändern die Nahrungsaufnahme (Natriumazid).

Anzahl der Replikate:

Nach unserer Erfahrung sind die Faltenveränderungen in der Fütterung im Vergleich zu den beobachteten Schwankungen in der Regel gering. Daher erfordert die Messung von Veränderungen in der Nahrungsaufnahme mehrere Replikationsvertiefungen. Abbildung 2A,B zeigt 96-Well-Platten, die für vier oder sechs verschiedene Bedingungen ausgelegt sind, mit 21 oder 14 Replikat-Wells und zwei Selbstlyse-Kontrollwells ohne Würmer. Angesichts der großen Variabilität und der relativ geringen zu erwartenden Veränderungen sind 0,5-2,5-fache Veränderungen in der Fütterung tendenziell die untere und obere Grenze. Wir empfehlen 14 bis 21 Replikationsvertiefungen für jede Bedingung und mindestens zwei Selbstlysekontrollvertiefungen, die im Folgenden beschrieben werden. Diese Replikate reichen aus, um quantitative Dosis-Wirkungs-Kurven für Arzneimittel zu erstellen, die die Fütterung verändern^11,26.

Selbstlyse-Kontrollen:

Der OD₆₀₀ misst die Anzahl der Partikel in einer Lösung, meist unabhängig von der Partikelgröße. Abgestorbene Bakterien werden jedoch lysiert und verlieren ihre Partikelnatur. Wir nennen dies Selbstlyse, die unabhängig von Würmern abläuft und die OD_{600-Messungen} senkt, ohne dass die Würmer fressen. Die Selbstlyse findet während des Assays statt und muss unabhängig voneinander in mindestens zwei Vertiefungen pro Bedingung gemessen werden. Diese Vertiefungen erhalten die gleiche Behandlung wie die anderen unter dem gleichen Zustand, nur dass sie keine Würmer enthalten. Wir fanden heraus, dass viele Medikamente auch die Selbstlyserate verändern können. Daher benötigt jeder Zustand unabhängige Selbstlysekontrollwells mit ihrer jeweiligen Konzentration. Abbildung 2 zeigt einen Plattenaufbau für vier oder sechs Bedingungen, wobei sich alle Selbstlysekontrollwells am unteren Rand der Platte in Reihe H befinden.

N2-Referenzpopulation:

Wir stellten auch fest, dass die absolute Menge der verzehrten Bakterien zwischen den Experimenten schwanken kann, was höchstwahrscheinlich mit der Qualität der Bakterien zusammenhängt. Trotz aller Bemühungen, sie jedes Mal genau gleich zuzubereiten, gibt es Schwankungen. Zum Beispiel können Bakterien geerntet werden, während sie sich während der logarithmischen Wachstumsphase in einem sich teilenden Zustand befinden, und daher viel größer sein als Bakterien, die in der stationären Phase geerntet werden. Daher können diese einfachen Unterschiede in der Bakteriengröße zu Veränderungen in der Anzahl der verzehrten Bakterien und zu unterschiedlichen OD_600-Werten führen, da bei den OD_{600-Messungen} nicht zwischen den Größen unterschieden wird. Aus diesem Grund beziehen wir immer eine Population von unbehandelten N2-Kontrolltieren mit ein, die als Referenzwert dienen, entweder auf 1 oder 100% gesetzt, um festzustellen, ob die Versuchsgruppen mehr oder weniger fressen als die N2-Kontrolle. Diese Praxis ermöglicht Vergleiche zwischen Experimenten, auch wenn die OD_600-Werte variieren.

Zeitintervalle:

Die Verwendung von OD_600-Werten zur Messung der Nahrungsaufnahme erfordert eine messbare Abnahme der Bakterienkonzentration. Da das Kulturvolumen viel größer ist als das der Würmer, müssen sie eine erhebliche Menge an Bakterien fressen, um einen nachweisbaren Unterschied zu machen. Um bei OD_600-Werten im linearen Bereich zu bleiben, muss die Bakterienkonzentration zwischen ~1 mg/ml und 10 mg/ml liegen, so dass eine beträchtliche Menge an Bakterien verschwinden muss, um sie zu erkennen. Würmer fressen vom späten L4. bis zum 4. Tag des Erwachsenenalters aufgrund der Eiproduktion am meisten. Somit ist dieses Intervall ideal. Kürzere Intervalle wie 24 h können gemessen werden¹¹, aber das ist erheblich schwieriger und erfordert ~40 Wells pro Zustand. Eine weitere Möglichkeit, die Nahrungsaufnahme der Larven zu messen, besteht darin, die Anzahl der Tiere pro Vertiefung zu verdoppeln. Das Problem bei diesem Ansatz ist jedoch, dass zu viele Würmer beginnen, die OD_{600-Messwerte} zu beeinflussen, wenn sie erwachsen werden.

Stammlösungen für zu testende Medikamente:

Wenn Medikamente wie Serotonin auf ihre Fähigkeit getestet werden, die Fütterung zu modulieren, sollten Sie bei der Zubereitung von Stammlösungen Folgendes beachten. Wir bereiten in der Regel eine 50-fache Brühe für wasserlösliche Arzneimittel vor und fügen 3 μl zu jeder Vertiefung hinzu (1:50), aber auch andere Stammkonzentrationen (100x, 300x) funktionieren. Wenn die Arzneimittel jedoch in anderen Lösungsmitteln als Wasser (z. B. DMSO) verdünnt werden, sollte die Endkonzentration 0,5 % nicht überschreiten. Lösungsmittel werden schnell schädlich für C. elegans. Daher müssen Stammlösungen von Arzneimitteln, die in organischen Lösungsmitteln wie DMSO gelöst sind, 300x oder höher sein.

Bewertung von lebenden und toten Würmern:

Die Bestimmung von lebenden und toten Tieren basiert auf der Bewegung des Wurms. Es wird starkes Licht, vor allem blaues Licht, verwendet, weil es die Tiere in Bewegung versetzt. Darüber hinaus zeigt die Bewertung der Anzahl der Tiere pro Vertiefung, ob es zu Übersterblichkeit kommt. Übermäßige Todesfälle können bei giftigen Substanzen oder hohen Konzentrationen (>0,5 %) verschiedener Lösungsmittel, einschließlich DMSO, auftreten. In der Regel sollte es weniger als 1:100 (1%) tote Tiere geben. Die Platten können auf dem Mikrotiter-Plattenschüttler 30 s bei 800 U/min geschüttelt werden, wenn sich die Nahrung abgesetzt hat und die Population schwer zu zählen ist. Brunnen mit Männchen oder mehr als 16 Würmern ignorieren (siehe Probleme).

Mögliche Probleme:

Unzureichendes Schütteln:

In einem flüssigen Medium können sich Bakterien leicht verklumpen und sich am Boden der Vertiefungen absetzen. Unserer Erfahrung nach kann ein Schütteln von weniger als 20 Minuten dazu führen, dass bakterielle Klumpen nicht aufgebrochen und wieder suspendiert werden, was zu ungenauen OD_{600-Messungen} führt. OD_{600-Messungen} in Gegenwart von Bakterienklumpen unterschätzen die Bakterienkonzentration. Zu hohe Einstellungen des Schüttlers können dazu führen, dass die Flüssigkeit an der Versiegelung kleben bleibt. Sobald die Versiegelung für den OD_600-Messwert entfernt wird, führt die an der Versiegelung haftende Flüssigkeit zu einem niedrigeren OD_600-Messwert . Wenn sich Flüssigkeit auf dem Versiegelungsmittel befindet, drehen Sie die Platte schnell bei niedriger Geschwindigkeit (500-1.000 U/min) und schütteln Sie sie erneut 5 Minuten lang. Stellen Sie außerdem sicher, dass Sie, wie für die Messungen an Tag 1 und Tag 4 angegeben, innerhalb von 10 Minuten nach dem Schütteln der Platten ablesen, um zu verhindern, dass sich die Bakterien absetzen.

Unterschiedliche absolute Werte für die Nahrungsaufnahme zwischen den Experimenten:

Trotz unserer Bemühungen, die bakteriellen Präparate zu standardisieren, unterscheiden sie sich oft in einer Weise, die sich auf die Nahrungsaufnahme bei Würmern auswirkt. Zum Beispiel unterscheiden sich Bakterien aufgrund ihres sich teilenden Zustands in der Größe, je nachdem, ob sie in der logarithmischen Wachstumsphase oder in der stationären Phase geerntet wurden, wobei die logarithmischen Bakterien größer sind. Da bei OD_{600-Messungen} nicht zwischen den Größen unterschieden wird, können die Unterschiede in der Bakteriengröße aufgrund der Phase, in der die Bakterien geerntet wurden, zu den offensichtlichen Unterschieden in der basalen Nahrungsaufnahme zwischen bakteriellen Präparaten führen. Der beste Weg, zwischen Experimenten zu vergleichen, besteht darin, immer eine unbehandelte N2-Kontrollpopulation einzubeziehen und die Ergebnisse auf diese N2-Population zu normalisieren.

Crowding-Effekte:

Die Bakterienkonzentration in diesem Protokoll reicht aus, um den OD₆₀₀ für 2-16 Würmer pro Vertiefung für ~72 h im linearen Bereich zu halten. Abhängig vom interessierenden Medikament kann eine Vertiefung mit mehr als 16 Würmern die Bakterienkonzentration vor der zweiten Messung verringern. Wir haben auch festgestellt, dass Brunnen mit einem Tier tendenziell unzuverlässig sind. Der Lysefaktor überwiegt das, was ein einzelner Wurm frisst. Kleinere Fehler bei der Bestimmung des Lysefaktors betreffen daher überproportional Vertiefungen mit weniger Würmern.

Wir empfehlen, Bohrlöcher von statistischen Analysen auszunehmen, wenn eine der folgenden Bedingungen erfüllt ist. Es gibt Männchen im Brunnen (wir haben keine Daten, die die Nahrungsaufnahme zwischen Männchen und Hermaphroditen vergleichen); Es befinden sich weniger als 2 Würmer im Brunnen oder mehr als 16 Würmer im Brunnen; Die Würmer sind bei der zweiten Lesung tot; oder ob es Nachkommen in den Vertiefungen gibt, weil die FUdR versagt hat. FUdR ist wärmeempfindlich und wird bereits bei Temperaturen von 37 °C inaktiviert. FUdR immer in Wasser mit Raumtemperatur auftauen.

Negative Werte für die Nahrungsaufnahme:

Die Werte für die Nahrungsaufnahme sind gelegentlich negativ, was darauf hindeutet, dass an Tag 4 mehr Nahrung zu sich genommen wird als an Tag 1. Negative Werte für die Nahrungsaufnahme können auf einen der folgenden Faktoren hinweisen: eine hohe Selbstlyserate , die möglicherweise durch ein zugesetztes Medikament verursacht wird, das auf die Bakterien wirkt, oder negative Werte für die Nahrungsaufnahme, die darauf hindeuten können, dass der Brunnen kontaminiert ist und etwas anderes als Würmer wächst. Auch die Selbstlyseraten steigen mit zunehmendem Alter der Bakterien; Daher empfehlen wir, Bakterien zu verwenden, die nicht älter als eine Woche sind. Es wurde ein Medikament hinzugefügt, das im Laufe der Zeit ausfällt und den OD_600-Wert beeinflusst. Unzureichendes Schütteln an Tag 1 kann aufgrund von Bakterienklumpen zu einem niedrigeren OD_600-Wert führen. Die Würmer wurden hypoxischem Stress ausgesetzt. Dies tritt auf, wenn das Boden-Luft-Verhältnis nicht ausreicht, um einen Sauerstoffaustausch zu ermöglichen. Verwenden Sie die spezielle 96-Well-Platte in Materialien und überschreiten Sie nicht 150 μl (120 μl + 30 μl FUdR) pro Well. Der Abstand zwischen der Oberfläche des Brunnens und dem Boden, wo die Würmer leben, bestimmt die Sauerstoffkonzentration.

Begrenzungen:

Dieser Assay ist auf Flüssigkulturen beschränkt. Das an festen Platten beobachtete Fressverhalten, wie z. B. das Auf- und Verlassen von Rasenflächen, kann mit dem Assay nicht beurteilt werden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	RPI	A40030-0.1	solvent: EtOH
Ampicillin	Fisher Scientific	BP176025	solvent: water
Bacto Peptone	BD Biosciences	211677	use to make NGM plates
Carbenicillin	Fisher Scientific	46-100-RG	solvent: water
Cell strainer	Fisher Scientific	22363547	40 µm to remove adults
Cholesterol	MP Biomedicals	02101380-CF	5 mg/mL stock
Difco, Agar, Bacteriological	BD Biosciences	214510	use to make NGM plates
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich	F0503	to sterilize worms on L4
Luria Broth	RPI	L24045-1000.0	open capsule, mix with 1 L of water, autoclave
M9 Buffer	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L:  15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136)  5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246)  autoclave
Microplate Sealer	Fisher Scientific	236707
OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Plate 96-well	Falcon	351172
Plate reader	Tecan	30016056	use 600 nm filter lens
Potassium Citrate, 1 M , pH 6	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 900 mL of dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave
Potassium Phosphate, 1 M , pH 6	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O  pH to 6 using 5 M KOH autoclave
S-Basal	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58)  50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) add 900 mL dH2O autoclave, cool to 55 °C
S-Complete	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT)  10 mL of 1 M potassium citrate  pH 6, 10 mL of trace metal solutions  3 mL of 1 M CaCl2 3 mL of 1 M MgSO4
Serotonin hydrochloride	Thermo Scientific	AAB2126309	used at 5 mM
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S7653-5KG	to make buffers and NGM plates
Terrific Broth	Thermo Scientific	J75856-A1	12.5 g in 250 mL of water, autoclave
Titer plate Shaker	Thermo Scientific	88880023	shaken at 800 rpm, depends on shaker
Trace Metals Solution	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278)  0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287)  0.016 g CuSO4 (FW: 158) autoclave wrap in aluminum foil to keep in the dark