Количественная оценка потребления пищи при Caenorhabditis elegans путем измерения бактериального клиренса

Резюме

В этом протоколе описан анализ для количественной оценки скорости кормления Caenorhabditis elegans на основе измерения клиренса бактерий в жидкой культуре.

Аннотация

Кормление является важным биологическим процессом для роста, размножения и выживания организма. Этот анализ направлен на измерение потребления пищи Caenorhabditis elegans (C. elegans), что является важным параметром при изучении генетики старения или метаболизма. У большинства видов кормление определяется путем измерения разницы между количеством предоставленной пищи и количеством, оставшимся после определенного временного интервала. Представленный здесь метод использует ту же стратегию для определения кормления C. elegans. Он измеряет количество бактерий, источника пищи C. elegans, выведенных в течение 72 часов. Этот метод использует 96-луночные микротитровальные планшеты и позволил провести скрининг сотен препаратов на предмет их способности модулировать потребление пищи со скоростью и глубиной, невозможными в других моделях животных. Преимущество этого анализа заключается в том, что он позволяет измерять питание и продолжительность жизни одновременно и напрямую измерять исчезновение пищи и, таким образом, основан на тех же принципах, которые используются для других организмов, облегчая сравнение между видами.

Введение

Caenorhabditis elegans широко используется в исследованиях старения.  Это была мощная модель для изучения генетики, лежащей в основе опосредованного метаболизмом долголетия, вызванного диетическими ограничениями, снижением митохондриальной активности или снижением передачи сигналов инсулина. 1,2,3,4,5,6,7. Тем не менее, измерение кормления в контексте долголетия оказалось сложным для C. elegans из-за небольшого размера животного 3,8,9,10,11,12,13,14,15.

Питание является фундаментальным биологическим поведением, необходимым для выживания, и его жесткое регулирование лежит в основе поддержания метаболического здоровья, размножения и старения. Пищевое поведение контролируется несколькими сигнальными путями как в нервной системе, так и на периферии и, таким образом, может быть изучено только in vivo 16,17,18,19. Питание представляет собой первый из трех столпов: (i) потребление энергии, (ii) хранение энергии и (iii) расход энергии, который регулирует энергетический гомеостаз организма. Кормление у C. elegans в основном изучалось путем измерения глоточной насосной работы, определяемой скоростью сокращений глотки. Этот подход позволил получить важнейшее представление о пищевом поведении C. elegans 3,4,8,12,13,20,21; Тем не менее, откачка глотки, особенно измеряемая в течение коротких интервалов времени, не обязательно коррелирует с приемом пищи.

Прием пищи определяется не только скоростью откачивания глотки, но и такими параметрами, как продолжительность и частота кормления и плотность пищевых бактерий. Животное может иметь очень высокую глоточную качку, но продолжительность его кормления может быть короче, что компенсирует повышенную скорость. Еще одним осложняющим фактором является эффективность, с которой насос может поглощать или не поглощать и измельчать бактерии. Крайним примером отделения приема пищи от сцеживания глотки является добавление серотонина без присутствия пищи (бактерий). В присутствии экзогенного серотонина животные сцеживаются с высокой скоростью, но без присутствия бактерий высокая скорость сцеживания не приводит к приему пищи 2,6,13,22,23.

Представленный здесь метод очистки от бактерий измеряет потребление пищи популяциями червей в отдельных лунках как снижение концентрации бактерий с течением времени (рис. 1). Этот подход аналогичен тем, которые используются у других видов, где исчезновение пищи представляет собой меру потребления пищи 10,11,24,25,26,27,28. В оригинальной публикации мы проверили этот метод измерения потребления пищи путем кормления C. elegans бактериями, меченными изотопами ¹⁵N. Последующие измерения с помощью масс-спектрометрии показали, что измерение исчезновения бактерий сильно коррелирует с возникновением мечения изотопами, раскрывая фактическое поглощение^{бактерий в организме} животного. Таким образом, мы уверены, что анализ бактериального клиренса отражает потребление пищи в большинстве случаев. Цель анализа состоит не в том, чтобы заменить анализ накачивания глотки, а в том, чтобы добавить в набор анализов инструментарий для изучения питания и метаболизма у C. elegans и того, как это связано со старением и долголетием.

протокол

Рисунок 1: Схема анализа бактериального клиренса. Графическая схема основных разделов протокола (сверху вниз): Подготовка бактерий, синхронизация популяции червей, посев в 96-луночные планшеты, стерилизация червей, добавление лекарств, измерение наружного диаметра₆₀₀ в день 1 и день 4. Подробное описание этих конкретных шагов указано слева от каждого изображения. Сокращения: OD = оптическая плотность; FUdR = фтордезоксиуридин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Подготовка бактерий

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе подробно описана подготовка питательных бактерий, используемых в данном анализе. Специфический штамм E. coli, используемый в анализе, называется OP50. OP50 является наиболее широко используемым штаммом для кормления C. elegans. Используемый штамм OP50 устойчив к карбенициллину/ампициллину, что предотвращает перекрестное загрязнение культуры червей другими бактериями⁹.

1. Подготовьте OP50 за 4-5 дней до использования, а облучите рентгеном за день до использования. Убедитесь, что все материалы, контактирующие с OP50, стерильны ^29,30.
2. День -8: Среда (неделя 1):
   1. Приготовьте преинокулят, введя 5 мл LB в 100 мкг/мл ампициллина и 0,1 мкг/мл амфотерицина B, а также в одну колонию OP50 и инкубируйте в течение примерно 6 ч при 37 °C в бактериальном шейкере. Делайте прививку рано, чтобы обеспечить достаточный рост для того, чтобы культура помутнела.
   2. Как только культура помутнеет, разведите преинокулятную культуру OP50 в соотношении 1:2000 в 250 мл ТБ, содержащем 100 мкг/мл ампициллина. Инкубируйте культуру в течение ночи в бактериальном шейкере в течение 17-19 часов при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Культуре нельзя позволять расти дольше 19 часов.
3. День -7: Четверг (неделя 1)
   1. После инкубации в течение 17-19 часов жидкую культуру OP50 переложить в стерильную центрифужную пробирку и центрифугировать в течение 15 мин при 3 100 × г в настольной центрифуге при температуре 4 °C.
   2. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу OP50 стерильной водой и повторно центрифугируйте. Повторите эту стирку 2 раза.
   3. После второй промывки выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу OP50 в стерильной воде до объема 50 мл и переложите в предварительно взвешенную коническую пробирку объемом 50 мл. Гранулируйте OP50 центрифугированием в течение 20 мин при концентрации 3 100 × г в настольной центрифуге при 4 °C.
   4. После третьей промывки тщательно удалите всю оставшуюся надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы в трубке не осталось воды. Рассчитайте вес гранулы, вычитая вес пустой центрифужной трубки из веса центрифужной трубки с гранулой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вес гранул обычно колеблется от 3 до 3,5 г.
   5. Тщательно суспендируйте гранулу OP50 в буфере S-complete до концентрации 100 мг/мл, убедившись, что в ней нет комков.
   6. Следите за тем, чтобы концентрация OP50 на уровне 100 мг/мл соответствовала 2 ×^{10 10} бактерий/мл. Если известна взаимосвязь между оптической плотностью и количеством бактерий на мл, определяют концентрацию бактерий на мл спектрофотометрическим способом. При необходимости используйте буфер S-complete для регулировки концентрации питательного раствора OP50 до 2 × 10¹⁰ бактерий/мл.
   7. Испытайте OP50 на агаровой пластине, чтобы определить, был ли он загрязнен.
   8. Храните OP50 во взвешенном состоянии в S-полном буфере при температуре 4 °C.

4. День -3: Понедельник (неделя 2)
   1. Убейте бактерии с помощью рентгеновского облучения, чтобы предотвратить рост бактерий во время анализа.

2. Синхронная подготовка культивирования червей

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе рассматривается подготовка синхронной популяции червей. Все материалы, которые вступают в контакт с популяциями червей, стерильны. Все пластины должны храниться при температуре 20 °C, если не указано иное.

1. День -6: Пятница (неделя 1), 16:00
   1. Переложите животных в свежую тарелку.
      1. Возьмем пластину NGM, на которой большая часть популяции червей состоит из голодающих личинок L1.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Смешанная популяция также даст результаты. Использование червей L1, которые голодали в течение длительного времени, может повлиять на пищевое поведение в нынешнем или будущих поколениях, так как голод может оставить эпигенетические метки как минимум на три поколения.
      2. Смойте гельминтов не более чем 1 мл стерильной воды. Аликвота ~300 мкл смытой популяции червей на планшеты NGM, засеянные концентрированным OP50 (~300 мг/мл). Дайте тарелкам высохнуть под сушилкой для тарелок или горелкой Бунзена. Инкубируйте планшеты при температуре 20°C до тех пор, пока большая часть популяции не соберет взрослых особей (понедельник).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот временной интервал оптимизирован для популяции червей N2 дикого типа и может варьироваться от штамма к штамму. Следует принимать во внимание червей с задержкой в развитии и раньше удалять и/или сеять раньше, чтобы все тестируемые штаммы достигли взрослого возраста одновременно.
2. День -3: Понедельник (неделя 2) 10:00
   1. Создание синхронной популяции
      ОСТОРОЖНОСТЬ! Отбеливатель разъедает кожу и глаза. Для работы с ним требуются перчатки и защитные очки.
      1. Соберите червей, смыв их с тарелки до 10 мл стерильной воды. Перелейте этот раствор червей и воды в коническую пробирку объемом 15 мл.
      2. Промойте червей гравитационной раковиной на столе примерно 4 минуты (наоборот, промойте центрифугированием в течение 2 минут в настольной центрифуге при 310 × г).
      3. Выбросьте надосадочную жидкость через аспирацию с помощью маленького наконечника и добавьте до 15 мл стерильной воды. Повторите 3 раза.
      4. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 5 мл свежеприготовленного раствора отбеливателя/NaOH (1,8 мл бытового отбеливателя, 0,5 мл 10 Н NaOH, 7,7 мл dH₂O).
      5. Выдерживать 5 минут при комнатной температуре или до тех пор, пока черви не раскроются. Осторожно делайте вихрь каждую минуту в течение не менее 10 с. Следите за ходом работы под микроскопом.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для вскрытия червей, может варьироваться от штамма к штамму. Если оставить червей в растворе отбеливателя слишком долго, яйца могут стать нежизнеспособными.
      6. Добавьте буфер M9 для нейтрализации реакции, как только все взрослые особи вскрываются или растворятся (конечный объем должен составлять 15 мл) и центрифугируйте в течение 2 минут при 1300 × г.
      7. Промойте яйца 3 раза 13 мл буфера M9.
      8. Один раз промойте яйца 10 мл буфера S-complete, центрифугируя в течение 2 минут при 1 300 × г.
      9. Отсадите надосадочную жидкость, добавьте 10 мл S-комплекта и переложите суспензию в свежую коническую пробирку объемом 15 мл. Аккуратно вращайте трубку при комнатной температуре в течение ночи на нутаторе или аналогичном устройстве.
      10. Необязательно: Если после окончательного центрифугирования в S-полном буфере присутствуют взрослые туши, отфильтруйте раствор червя через сетчатое фильтр для клеток размером 40 мкм.
3. День -2: Вторник (неделя 2), 13:00
   1. Засеивание животных в тарелки
      1. С помощью препарирующего эндоскопа проверьте, не вылупились ли черви. Определить концентрацию червей в S-полном буфере путем подсчета популяции червей в каплях 10 мкл с помощью препарирующего эндоскопа; Подсчитайте по 5-10 капель на каждый образец. Если концентрация червей в каждых 10 μл капли превышает 30 червей на каплю, разбавьте общий запас S-полным до меньшей плотности червей на каплю для облегчения подсчета.
      2. Высевают жидкую червячную смесь в каждую лунку 96-луночного планшета в объеме 120 мкл следующим образом (конечные концентрации): 60 червей/мл в S-комплекте, 50 мкг/мл карбенициллина, 0,1 мкг/мл амфотерицина и 6 мг/мл OP50, приготовленного в разделе 1.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем подготавливаемого материала зависит от количества планшетов (~12 мл на 96-луночный планшет). В каждой лунке должно быть 6-12 червей. В качестве альтернативы можно использовать проточную цитометрию с большими частицами, такую как COPAS FP от Union Biometrica, чтобы точно отсортировать 10 червей в каждой лунке (см. раздел «Эффект скученности»).
      3. Также включите жидкую смесь без глистов : 50 мкг/мл карбенициллина, 0,1 мкг/мл амфотерицина и 6 мг/мл ОП50, приготовленного в разделе 1.
      4. Добавьте 120 мкл смеси без червей в ряд H 96-луночного планшета, который используется для определения значений самолиза, как упоминалось ранее. Положите 120 мкл на лунку смеси с червями в рядах А-Г.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что черви находятся во взвешенном состоянии во время пипетирования (см. Рисунок 2A, B). Мы используем прозрачные 96-луночные планшеты с плоским дном. Наша схема планшетов делит пластину на 4 или 6 условий, в которых каждая пара столбцов будет представлять собой различное лекарственное лечение или штамм червей, а нижний ряд будет служить контролем «без червей» (рис. 2A, B).
      5. Во избежание загрязнения и испарения заклейте пластину скотчем-герметиком. Инкубируйте планшеты в течение примерно 65 часов при температуре 20 °C, пока животные не станут червями L4.
4. День 0: Четверг (неделя 2) до полудня.
   1. Стерилизация популяции червей путем добавления фтордезоксиуридина (FUdR).
      1. Добавьте 30 мкл 0,6 мл исходного раствора FUdR для стерилизации животных в каждой лунке. Повторно запечатайте пластину с помощью ленточных запайщиков и встряхивайте пластины в течение 20 минут на встряхивателе для пластин с микротитрованием при скорости 800 об/мин. Верните тарелки в инкубатор с температурой 20 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе конечная концентрация OP50 снижается с 6 мг/мл до 5 мг/мл (1 × 10⁹ бактерий/мл), и каждый лунка имеет конечный объем 150 μл. Крайне важно добавить FUdR к стадии L4 до того, как животные достигнут взрослого возраста.
5. День 1: Пятница (неделя 2)
   1. Добавьте в культуру препараты.
      1. К 9:00 утра убедитесь, что большинство животных являются гравидными и в каждой лунке содержится несколько яиц. При необходимости добавьте любые препараты до нужной концентрации (см. обсуждение).
      2. После добавления препарата запечатайте пластины скотчем-герметиком и встряхивайте пластины в течение 20 мин при 800 об/мин на встряхивателе для пластин.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхивание гарантирует, что все бактериальные комки растворятся, не касаясь запайщика. Как бактериальные комки, так и жидкость на герметике исказят показания наружного диаметра₆₀₀ . Если на герметике оказались капли жидкости, кратковременно раскрутите его в течение 10-20 с при 310 × г. Снова встряхните на шейкере в течение 5 минут и отмерьте.
      3. После 20 минут встряхивания на вибростенде с микротитровкой снимите крышку и пломбу и измерьте внешний диаметр₆₀₀ в считывателе пластин; Это измерение Наружного диаметра₆₀₀ в день 1. Запечатайте и верните планшеты в инкубатор с температурой 20 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку бактерии быстро оседают, показания должны произойти в течение 10 минут после встряхивания планшетов.
      4. Используйте инвертированный микроскоп для проверки популяции червей на наличие признаков загрязнения или токсичности, если был добавлен препарат. Верните пластины в инкубатор с температурой 20 °C.
6. День 4: Понедельник (неделя 3)
   1. Возьмите показания Day 4 OD₆₀₀ .
      1. Повторите процедуру считывания с Дня 1 (шаг 2.5.1.3), чтобы получить значение Наружного диаметра Дня 4 ₆₀₀ . Перед измерением наружного диаметра₆₀₀ встряхните пластины в течение 20 минут при 800 об/мин на вибростенде для микротитровальных пластин.
      2. На инвертированном микроскопе, в идеале с 2-кратным объективом, подсчитайте популяцию червей в каждой лунке и запишите ее в электронную таблицу. После подсчета верните тарелки в инкубатор при температуре 20 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите образец нашего оценочного листа, предоставленный в Дополнительных материалах.
      3. После показаний на 4-й день измерения потребления пищи завершены. При необходимости сохраните эти пластины для анализа срока службы.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол совместим с Solis и Petrascheck³¹.

3. Анализ данных о потреблении пищи

Рисунок 2: Проектирование и анализ. (A, B) Возможные конструкции пластин для условий 4 и 6 с контрольными скважинами «без червяка» в ряду H. Эти лунки необходимы для определения скорости самолиза. На каждой пластине всегда указывайте N2 необработанной контрольной популяции в качестве эталона. (C) Выборка данных, собранных в предоставленной таблице, с указанием количества червей (зеленая рамка), двух измерений OD₆₀₀ в дни 1 и 4 (оранжевые прямоугольники), значений самолиза (синяя рамка) и оценки с использованием формулы (2) ((OD₆₀₀ -selflysis)/X0) в красном поле. В конкретном примере, показанном здесь, используется конструкция пластины, показанная на рисунке (B). Сокращения: OD = оптическая плотность; X0 = количество червей в колодце. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается, как анализируются данные о потреблении пищи из раздела 2 настоящего протокола. Первыми значениями, которые необходимо вычислить, являются контрольные значения самолиза . Бактерии со временем лизируются в жидкости, даже при отсутствии глистов. На этот показатель самолиза также могут влиять многие химические вещества, и его необходимо контролировать, поскольку он относительно велик по сравнению с потреблением пищи червями. Как описано в шаге 2.3.1.4 и показано на схеме на рисунке 2A, B, строка H содержит тот же раствор, за исключением червей. В нашей схеме планшетов, показанной на рисунке 2B, имеется 14 скважин на одно условие с двумя соответствующими контрольными лунками для самоэпиляции (строка H, «без червей»).

1. Рассчитайте контрольные значения самолиза для контрольных скважин без червей в каждом условии с помощью уравнения (1). Для каждой повторяющейся группы скважин убедитесь, что имеется по крайней мере две контрольные скважины без червячных скважин, как указано в шаге 2.3.1.4. Используйте среднее значение из всех контрольных лунок без червей в качестве значения самолиза для реплицируемой группы.
   Селфизис = среднее(OD6₀₀ День 1 - OD6₀₀ День 4) (1)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для конфигурации планшета, показанной на рисунке 2B, мы рассчитаем шесть значений самолиза , по одному для каждой из шести групп, рассчитав среднее значение двух контрольных лунок для самолиза в строке H.
2. Рассчитайте потребление пищи на одного червя с помощью уравнения
        (2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Формула используется в таблице (красный прямоугольник, рисунок 2C), где X0 - количество червей в лунке.
3. После того как для каждой скважины определена норма потребления пищи на одного червя, рассчитайте средние значения и стандартное отклонение для всего состояния.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки пластины, показанной на рисунке 2B, для статистического сравнения достаточно 14 повторяющихся скважин на одно условие.
4. Нормализуйте каждое состояние для соответствующей N2 необработанной контрольной популяции. Укажите изменение кормления в виде кратного изменения или процента от N2 кормления.
   Примечание: Нормализация выполняется потому, что абсолютные значения OD6_00/X0 из уравнения (2) могут варьироваться между экспериментами, проводимыми в разные дни.

Результаты

Рисунок 3: Репрезентативные данные. (А) На графике показаны кривые зависимости «доза-реакция» кратного изменения потребления пищи в зависимости от концентрации серотонина. Все данные показывают, что нестимулированное базальное потребление пищи нормализовано до N2-базального питания. Обратите внимание, что животные daf-16 (mu86) едят больше, чем животные дикого типа N2, когда серотонин не добавлялся, но демонстрируют притупленный диапазон их способности контролировать питание. (B) На графике показана диаграмма скрипичного изменения потребления пищи червями, получавшими 50 мкМ антипсихотика локсапина, но которых кормили бактериями, убитыми рентгеновскими лучами, γ-лучами или параформальдегидом (C). На графике показана диаграмма скрипки изменения потребления пищи различными мутантами с их генотипами, указанными по оси x. Эти данные свидетельствуют о том, что мутанты exc-4 и cgr-1 едят меньше, в то время как мутанты srp-6 едят больше. Звездочками обозначены ** p < 0,001, ****p < 0,0001, как определено ANOVA и Brown-Forsythe-Welch, скорректированные post hoc для учета проверки нескольких гипотез. Полосы погрешностей показывают ±S.E.M. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 1 показан общий рабочий процесс этого протокола. Он иллюстрирует весь процесс, от создания бактерий до получения показаний наружного диаметра₆₀₀ в 1-й и 4-й день. Кроме того, инфографика ссылается на конкретные этапы используемых методов. На рисунках 2A, B показаны две возможные схемы расположения экспериментальных планшетов, включая контрольные скважины без червей в строке H, необходимые для расчета скоростей самолиза , описанных в разделе обсуждения. По опыту нашей лаборатории, необходимо, чтобы одним из условий был контроль N2 без лечения, учитывалась вариабельность потребления червей бактериями, наблюдаемая между экспериментами (см. обсуждение: Планирование [референтная популяция N2]).

На рисунке 2C показан пример электронной таблицы, используемой для анализа данных, сгенерированных в этом протоколе. Зеленым цветом выделено количество червей, оранжевым — день 1 OD₆₀₀ и день 4 OD₆₀₀ , а потребление пищи на одного червя — красным. Кроме того, каждая скважина отслеживается на предмет штамма, препарата, концентрации, даты эксперимента и других добавленных методов обработки. Более подробную информацию о конкретных используемых уравнениях можно найти в разделе 3 протокола. В целом, эти электронные таблицы (шаблон предоставлен в качестве дополнительных материалов) обеспечивают эффективный сбор и анализ данных по этому протоколу.

На рисунке 3A представлены репрезентативные результаты кривой «доза-реакция» того, как серотонин модулирует питание у мутантов N2 и daf-16 с использованием этого протокола. В этом эксперименте кратное изменение по сравнению с базальным потреблением пищи (первая точка на кривой) было рассчитано для пяти возрастающих доз серотонина. Как показывают эти результаты, штамм N2 способен переедать дозозависимым образом. Однако для мутанта daf-16(mu86), несмотря на то, что базальное питание выше, чем N2, мутант не может реагировать на серотонин таким же дозозависимым образом, как штамм N2. Этот протокол позволяет нам определить пищевое поведение между двумя штаммами, где концентрация серотонина была переменным фактором для построения кривых «доза-ответ». На рисунке 3B показано потребление пищи червями, получавшими антипсихотик локсапин, но получавшими бактерии, убитые рентгеновскими, γ-лучами или параформальдегидом. Обратите внимание, что эти эксперименты не проводились параллельно и что различия не являются репрезентативными для различных методов уничтожения бактерий, а обусловлены межэкспериментальной изменчивостью. На рисунке 3C показано потребление пищи рядом генетических штаммов, при этом два штамма демонстрируют снижение, а один штамм демонстрирует увеличение пищевого поведения по сравнению с N2. Такое применение протокола позволяет тестировать один препарат в одной концентрации на различных генетических фонах. Он подходит для идентификации генетических фонов, которые демонстрируют иную реакцию на потребление пищи, чем контрольная группа N2 дикого типа при приеме того же препарата. Он может быть сопряжен с нашим протоколом срока службы для быстрой проверки потребления пищи и срока службы в одной и той же конфигурации тарелки³¹.

Дополнительный материал: Шаблоны электронных таблиц, показанные на рисунке 2C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эти материалы.

Обсуждение

Представленный протокол измеряет бактериальный клиренс в качестве показателя потребления пищи C. elegans в 96-луночных микротитровальных планшетах. Кривые «доза-реакция» в разделе репрезентативных результатов показывают, что анализ количественно измеряет потребление пищи, что было независимо подтверждено с использованием меченых изотопами бактерий¹¹. Используя этот анализ, мы успешно протестировали одобренные FDA препараты, такие как антипсихотики, с известными метаболическими побочными эффектами у человека и показали, что эти препараты увеличивают кормление у C. elegans^10,26. Анализ полезен для изучения генетики или фармакологии кормления и добавляет новый инструмент для исследований C. elegans для изучения метаболизма. Этот анализ представляет собой недорогой метод изучения кормления масштабируемым и экономичным по времени способом, что невозможно для большинства других организмов. Наша работа над препаратами, одобренными FDA, показывает, что многие побочные эффекты, наблюдаемые у людей, также наблюдаются у C. elegans, демонстрируя эволюционную консервацию 24,26,32.

Анализ ограничен концентрацией бактерий, которая может быть измерена в линейном диапазоне измерения наружного диаметра₆₀₀ . В результате количество червей и диапазон концентраций бактерий, которые могут быть проанализированы, ограничены. Слишком большое количество червей повлияет на внешний диаметр₆₀₀ , потребляя бактерии слишком быстро, следовательно, «съедая» концентрацию бактерий из линейного наружного диаметра₆₀₀. По нашему опыту, изменчивость бактериального препарата является критическим параметром, который заставляет результаты варьироваться от одного эксперимента к другому. Мы безуспешно пытались заморозить большие партии бактерий или использовать лиофилизированные бактерии. В этих случаях либо скорость самолиза становилась слишком высокой, либо бактерии были такого качества, что замедляли развитие C. elegans . Однако наши тесты не были исчерпывающими, и эта проблема может быть решена.

В целом, скорость самолиза бактерий сложнее всего контролировать, и это может привести к значительной изменчивости. Мы обнаружили, что некоторые препараты могут увеличивать скорость самолиза до уровней, при которых анализ не может надежно определить потребление пищи. Поскольку скорость самолиза увеличивается с течением времени в анализе, мы не измеряли потребление пищи после 5-го дня взрослой жизни. К этому возрасту бактерии находятся в культуре ~10 дней. Чтобы измерить потребление пищи после 5-го дня взрослой жизни, старые бактерии необходимо смыть и заменить свежими.

Представленный анализ является продолжением нашего 96-луночного анализа на основе микротитровых планшетов³¹. Эта комбинация позволяет измерять продолжительность жизни и потребление пищи в одной и той же популяции. В то время как представленный здесь анализ бактериального клиренса не позволяет определить потребление пищи в течение всей жизни C. elegans из-за бактериального самолиза, он предоставляет надежные данные для первых четырех дней взрослой жизни, времени с наибольшим потреблением пищи. Особенно для открытия низкомолекулярных лекарств контроль за потреблением пищи имеет важное значение. Таким образом, мы ожидаем, что представленный анализ будет полезен сообществу C. elegans и расширит набор инструментов для изучения метаболизма или контроля над ним в контексте исследований старения и продолжительности жизни.

Планирование:

Прежде чем планировать измерение потребления пищи, необходимо принять во внимание несколько соображений.

Уничтожение бактерий:

Мы убиваем бактерии путем облучения рентгеновскими лучами в конической трубке объемом 50 мл (900 Грей за 4 ч при напряжении 160,0 кВ и 25,0 мА). Для облучения мы используем RS2000 от Rad Source. В зависимости от оборудования, конкретное время и доза облучения могут варьироваться от объекта к учреждению. Полное уничтожение бактерий должно быть определено путем нанесения на бактерии покрытия после облучения, чтобы обнаружить выживших по росту. Важно убить все бактерии, чтобы предотвратить рост во время анализа, так как это приведет к занижению корма или даже к отрицательным значениям кормления. Важно отметить, что бактерии должны быть уничтожены, чтобы C. elegans все еще мог их есть. По нашему опыту, существует три способа надежного уничтожения большого количества бактерий: (i) облучение рентгеновскими лучами, (ii) γ-лучами, и (iii) добавление формальдегида^29,30. Скорости самолиза между этими тремя методами сопоставимы, с коэффициентом вариации 8% между скоростями самолиза для экспериментов, показанных на рисунке 3B. Методы, которые не работали надежно в наших руках, включали УФ-облучение, коктейли с антибиотиками, тепловую инактивацию и азид натрия. Эти методы либо не могут полностью убить бактерии (ультрафиолет и антибиотики), либо производят бактерии, которые C. elegans не едят (нагревание), либо изменяют потребление пищи (азид натрия).

Количество тиражей:

По нашему опыту, изменения складчатости при кормлении, как правило, невелики по сравнению с наблюдаемыми вариациями. Таким образом, для измерения изменений в потреблении пищи требуется несколько повторяющихся лунок. На рисунках 2A, B показаны 96-луночные планшеты, предназначенные для четырех или шести различных условий, с 21 или 14 повторяющимися лунками и двумя контрольными лунками для самолиза без червей. Учитывая большую изменчивость и относительно небольшие изменения, которые следует ожидать, 0,5-2,5-кратные изменения в кормлении, как правило, являются нижним и верхним пределом. Мы рекомендуем использовать от 14 до 21 повторяющейся лунки для каждого условия и по крайней мере две контрольные лунки для самолиза, описанные ниже. Этих репликатов достаточно для построения количественных кривых «доза-реакция» для препаратов, которые изменяют кормление^11,26.

Управление самолизом:

OD₆₀₀ измеряет количество частиц в растворе, в основном независимо от размера частиц. Однако мертвые бактерии будут лизироваться, теряя свою природу частиц. Мы называем это самолизом, который происходит независимо в присутствии червей и снижает измерения наружного диаметра₆₀₀ без поедания червями. Самолиз происходит во время анализа и должен быть независимо измерен по крайней мере в двух лунках для каждого состояния. Эти колодцы обрабатываются так же, как и другие в том же состоянии, за исключением того, что они не содержат червей. Мы обнаружили, что многие препараты также могут изменять скорость самолиза. Таким образом, для каждого состояния необходимы независимые контрольные лунки для самоэпиляции с соответствующей их концентрацией. На рисунке 2 показана схема планшета для четырех или шести условий со всеми контрольными лунками для самолиза в нижней части планшета в строке H.

Референтная популяция N2:

Мы также отметили, что абсолютное количество потребляемых бактерий может колебаться между экспериментами, скорее всего, в зависимости от качества бактерий. Несмотря на все наши усилия каждый раз готовить их точно таким же образом, есть колебания. Например, бактерии могут быть собраны в деловом состоянии во время логарифмической фазы роста и, следовательно, быть намного больше по размеру, чем бактерии, собранные в стационарной фазе. Следовательно, эти простые различия в размерах бактерий могут привести к изменениям в количестве потребляемых бактерий и различным значениям наружного диаметра₆₀₀ , поскольку измерения наружного диаметра₆₀₀ не различают размеры. По этой причине мы всегда включаем одну популяцию необработанных контрольных животных N2, которая служит референсным значением, установленным либо на 1, либо на 100%, чтобы определить, едят ли экспериментальные группы больше или меньше, чем контрольная N2. Эта практика позволяет проводить сравнения между экспериментами, даже если значения наружного диаметра₆₀₀ различаются.

Временные интервалы:

Использование значений OD₆₀₀ для измерения потребления пищи требует заметного снижения концентрации бактерий. Поскольку объем культуры намного больше, чем у червей, они должны съесть значительное количество бактерий, чтобы произвести заметную разницу. Пребывание в линейном диапазоне для значений наружного диаметра₆₀₀ требует, чтобы концентрация бактерий оставалась в диапазоне от ~1 мг/мл до 10 мг/мл, чтобы значительное количество бактерий исчезло для ее обнаружения. Черви едят больше всего с конца L4 до 4 дня взрослой жизни из-за яйценоскости. Таким образом, этот интервал является идеальным. Более короткие интервалы, такие как 24 часа, можно измерить^{за 11} часов, но это значительно сложнее и требует ~40 скважин на одно условие. Еще один вариант измерения потребления пищи личинками – удвоить количество животных на лунку. Однако проблема с этим подходом заключается в том, что слишком большое количество червей начнет влиять на показания OD₆₀₀ , когда они вырастут.

Стоковые растворы для тестируемых препаратов:

Если такие препараты, как серотонин, проверяются на их способность модулировать кормление, учитывайте следующее при приготовлении исходных растворов. Обычно мы готовим 50-кратный запас водорастворимых препаратов и добавляем 3 μЛ в каждую лунку (1:50), но другие концентрации запаса (100x, 300x) также работают. Однако, если препараты разводят в растворителях, отличных от воды (например, ДМСО), конечная концентрация не должна превышать 0,5%. Растворители быстро становятся вредными для C. elegans. Таким образом, исходные растворы лекарственных средств, растворенных в органических растворителях, таких как ДМСО, должны быть в 300 раз или выше.

Оценка живых и мертвых червей:

Определение живых и мертвых животных основано на движении червя. Используется сильный свет, особенно синий, потому что он заставляет животных двигаться. Кроме того, подсчет количества животных в скважине покажет, есть ли избыточная смертность. Избыточная смертность может произойти при возникновении токсичных веществ или высоких концентраций (>0,5%) нескольких растворителей, включая ДМСО. Как правило, мертвых животных должно быть менее 1:100 (1%). Тарелки можно встряхивать в течение 30 с при 800 об/мин на вибростенде для микротитрования, если пища осела и популяцию становится трудно подсчитать. Игнорируйте лунки с самцами или более 16 червей (см. проблемы).

Возможные проблемы:

Недостаточное встряхивание:

В жидкой среде бактерии могут легко слипаться и оседать на дне лунок. По нашему опыту, встряхивание в течение менее 20 минут может не привести к разрушению бактериальных комков и их ресуспендированию, что приведет к неточным измерениям наружного диаметра₆₀₀ . Измерения наружного диаметра₆₀₀ в присутствии бактериальных комков будут недооценивать концентрацию бактерий. Чрезмерные настройки шейкера могут привести к прилипанию жидкости к герметику. После того, как герметик будет снят для показаний наружного диаметра₆₀₀ , жидкость, прилипшая к герметику, приведет к снижению внешнего диаметра₆₀₀ . Если на герметике есть жидкость, быстро раскрутите пластину на низкой скорости (500-1 000 об/мин) и снова встряхните в течение 5 минут. Кроме того, убедитесь, что, как указано для показаний в День 1 и День 4, показания были сделаны в течение 10 минут после встряхивания планшетов, чтобы избежать оседания бактерий.

Различные абсолютные значения потребления пищи между экспериментами:

Несмотря на все наши усилия по стандартизации бактериальных препаратов, они часто различаются по способам, влияющим на потребление пищи червями. Например, из-за своего делительного состояния бактерии различаются по размеру в зависимости от того, были ли они собраны в логарифмической фазе роста или в стационарной фазе, причем логарифмические бактерии крупнее. Из-за того, что измерения OD₆₀₀ не различают размеры, различия в размере бактерий из-за фазы, в которой бактерии были собраны, могут привести к очевидным различиям, наблюдаемым в базальном потреблении пищи между бактериальными препаратами. Лучший способ сравнения экспериментов — всегда включать необработанную контрольную популяцию N2 и нормализовать результаты для этой популяции N2.

Эффекты скученности:

Концентрация бактерий в этом протоколе достаточна для поддержания наружного диаметра₆₀₀ в линейном диапазоне для 2-16 червей на лунку в течение ~72 ч. В зависимости от интересующего препарата, лунка, содержащая более 16 червей, может истощить бактериальную концентрацию до второго измерения. Мы также обнаружили, что скважины с одним животным, как правило, ненадежны. Фактор лизиса перевешивает то, что ест один червь. Следовательно, незначительные погрешности в определении фактора лизиса непропорционально влияют на скважины с меньшим количеством червей.

Мы рекомендуем исключить скважины из статистического анализа при выполнении одного из приведенных ниже условий. В колодце есть самцы (у нас нет данных, сравнивающих потребление пищи самцами и гермафродитами); в колодце менее 2 червей или более 16 червей в скважине; черви мертвы при втором чтении; или если в скважинах есть потомство из-за отказа FUdR. FUdR чувствителен к теплу и инактивируется даже при низких температурах до 37 °C. Всегда размораживайте FUdR в воде комнатной температуры.

Отрицательные значения потребления пищи:

Значения потребления пищи иногда бывают отрицательными, что говорит о большем количестве пищи в 4-й день, чем в 1-й. Отрицательные значения потребления пищи могут указывать на один из следующих факторов: высокая скорость самолиза , возможно, вызванная добавлением препарата, действующего на бактерии, или отрицательные значения потребления пищи, которые могут указывать на то, что колодец загрязнен и растет что-то другое, а не черви. Скорость самолиза также увеличивается по мере взросления бактерий; Поэтому мы рекомендуем использовать бактерии не старше недели. Добавлен препарат, который со временем выпадает в осадок, влияя на значение OD₆₀₀ . Недостаточное встряхивание в 1-й день может привести к снижению значения наружного диаметра₆₀₀ из-за бактериальных комков. Черви подвергались гипоксическому стрессу. Это происходит, когда соотношение поверхности и воздуха недостаточно для обеспечения кислородного обмена. Используйте в материалах специальный 96-луночный планшет и не превышайте 150 мкл (120 мкл + 30 мкл FUdR) на лунку. Расстояние между поверхностью скважины и дном, где обитают черви, определяет концентрацию кислорода.

Ограничения:

Этот анализ ограничен жидкой культурой. Пищевое поведение, наблюдаемое в твердых тарелках, например, перемещение по лужайкам и отходам от них, не может быть оценено с помощью анализа.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	RPI	A40030-0.1	solvent: EtOH
Ampicillin	Fisher Scientific	BP176025	solvent: water
Bacto Peptone	BD Biosciences	211677	use to make NGM plates
Carbenicillin	Fisher Scientific	46-100-RG	solvent: water
Cell strainer	Fisher Scientific	22363547	40 µm to remove adults
Cholesterol	MP Biomedicals	02101380-CF	5 mg/mL stock
Difco, Agar, Bacteriological	BD Biosciences	214510	use to make NGM plates
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich	F0503	to sterilize worms on L4
Luria Broth	RPI	L24045-1000.0	open capsule, mix with 1 L of water, autoclave
M9 Buffer	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L:  15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136)  5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246)  autoclave
Microplate Sealer	Fisher Scientific	236707
OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Plate 96-well	Falcon	351172
Plate reader	Tecan	30016056	use 600 nm filter lens
Potassium Citrate, 1 M , pH 6	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 900 mL of dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave
Potassium Phosphate, 1 M , pH 6	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O  pH to 6 using 5 M KOH autoclave
S-Basal	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58)  50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) add 900 mL dH2O autoclave, cool to 55 °C
S-Complete	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT)  10 mL of 1 M potassium citrate  pH 6, 10 mL of trace metal solutions  3 mL of 1 M CaCl2 3 mL of 1 M MgSO4
Serotonin hydrochloride	Thermo Scientific	AAB2126309	used at 5 mM
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S7653-5KG	to make buffers and NGM plates
Terrific Broth	Thermo Scientific	J75856-A1	12.5 g in 250 mL of water, autoclave
Titer plate Shaker	Thermo Scientific	88880023	shaken at 800 rpm, depends on shaker
Trace Metals Solution	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278)  0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287)  0.016 g CuSO4 (FW: 158) autoclave wrap in aluminum foil to keep in the dark