В этом протоколе описан анализ для количественной оценки скорости кормления Caenorhabditis elegans на основе измерения клиренса бактерий в жидкой культуре.
Кормление является важным биологическим процессом для роста, размножения и выживания организма. Этот анализ направлен на измерение потребления пищи Caenorhabditis elegans (C. elegans), что является важным параметром при изучении генетики старения или метаболизма. У большинства видов кормление определяется путем измерения разницы между количеством предоставленной пищи и количеством, оставшимся после определенного временного интервала. Представленный здесь метод использует ту же стратегию для определения кормления C. elegans. Он измеряет количество бактерий, источника пищи C. elegans, выведенных в течение 72 часов. Этот метод использует 96-луночные микротитровальные планшеты и позволил провести скрининг сотен препаратов на предмет их способности модулировать потребление пищи со скоростью и глубиной, невозможными в других моделях животных. Преимущество этого анализа заключается в том, что он позволяет измерять питание и продолжительность жизни одновременно и напрямую измерять исчезновение пищи и, таким образом, основан на тех же принципах, которые используются для других организмов, облегчая сравнение между видами.
Caenorhabditis elegans широко используется в исследованиях старения. Это была мощная модель для изучения генетики, лежащей в основе опосредованного метаболизмом долголетия, вызванного диетическими ограничениями, снижением митохондриальной активности или снижением передачи сигналов инсулина. 1,2,3,4,5,6,7. Тем не менее, измерение кормления в контексте долголетия оказалось сложным для C. elegans из-за небольшого размера животного 3,8,9,10,11,12,13,14,15.
Питание является фундаментальным биологическим поведением, необходимым для выживания, и его жесткое регулирование лежит в основе поддержания метаболического здоровья, размножения и старения. Пищевое поведение контролируется несколькими сигнальными путями как в нервной системе, так и на периферии и, таким образом, может быть изучено только in vivo 16,17,18,19. Питание представляет собой первый из трех столпов: (i) потребление энергии, (ii) хранение энергии и (iii) расход энергии, который регулирует энергетический гомеостаз организма. Кормление у C. elegans в основном изучалось путем измерения глоточной насосной работы, определяемой скоростью сокращений глотки. Этот подход позволил получить важнейшее представление о пищевом поведении C. elegans 3,4,8,12,13,20,21; Тем не менее, откачка глотки, особенно измеряемая в течение коротких интервалов времени, не обязательно коррелирует с приемом пищи.
Прием пищи определяется не только скоростью откачивания глотки, но и такими параметрами, как продолжительность и частота кормления и плотность пищевых бактерий. Животное может иметь очень высокую глоточную качку, но продолжительность его кормления может быть короче, что компенсирует повышенную скорость. Еще одним осложняющим фактором является эффективность, с которой насос может поглощать или не поглощать и измельчать бактерии. Крайним примером отделения приема пищи от сцеживания глотки является добавление серотонина без присутствия пищи (бактерий). В присутствии экзогенного серотонина животные сцеживаются с высокой скоростью, но без присутствия бактерий высокая скорость сцеживания не приводит к приему пищи 2,6,13,22,23.
Представленный здесь метод очистки от бактерий измеряет потребление пищи популяциями червей в отдельных лунках как снижение концентрации бактерий с течением времени (рис. 1). Этот подход аналогичен тем, которые используются у других видов, где исчезновение пищи представляет собой меру потребления пищи 10,11,24,25,26,27,28. В оригинальной публикации мы проверили этот метод измерения потребления пищи путем кормления C. elegans бактериями, меченными изотопами 15N. Последующие измерения с помощью масс-спектрометрии показали, что измерение исчезновения бактерий сильно коррелирует с возникновением мечения изотопами, раскрывая фактическое поглощениебактерий в организме животного. Таким образом, мы уверены, что анализ бактериального клиренса отражает потребление пищи в большинстве случаев. Цель анализа состоит не в том, чтобы заменить анализ накачивания глотки, а в том, чтобы добавить в набор анализов инструментарий для изучения питания и метаболизма у C. elegans и того, как это связано со старением и долголетием.
Рисунок 1: Схема анализа бактериального клиренса. Графическая схема основных разделов протокола (сверху вниз): Подготовка бактерий, синхронизация популяции червей, посев в 96-луночные планшеты, стерилизация червей, добавление лекарств, измерение наружного диаметра600 в день 1 и день 4. Подробное описание этих конкретных шагов указано слева от каждого изображения. Сокращения: OD = оптическая плотность; FUdR = фтордезоксиуридин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
1. Подготовка бактерий
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе подробно описана подготовка питательных бактерий, используемых в данном анализе. Специфический штамм E. coli, используемый в анализе, называется OP50. OP50 является наиболее широко используемым штаммом для кормления C. elegans. Используемый штамм OP50 устойчив к карбенициллину/ампициллину, что предотвращает перекрестное загрязнение культуры червей другими бактериями9.
2. Синхронная подготовка культивирования червей
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе рассматривается подготовка синхронной популяции червей. Все материалы, которые вступают в контакт с популяциями червей, стерильны. Все пластины должны храниться при температуре 20 °C, если не указано иное.
3. Анализ данных о потреблении пищи
Рисунок 2: Проектирование и анализ. (A, B) Возможные конструкции пластин для условий 4 и 6 с контрольными скважинами «без червяка» в ряду H. Эти лунки необходимы для определения скорости самолиза. На каждой пластине всегда указывайте N2 необработанной контрольной популяции в качестве эталона. (C) Выборка данных, собранных в предоставленной таблице, с указанием количества червей (зеленая рамка), двух измерений OD600 в дни 1 и 4 (оранжевые прямоугольники), значений самолиза (синяя рамка) и оценки с использованием формулы (2) ((OD600 -selflysis)/X0) в красном поле. В конкретном примере, показанном здесь, используется конструкция пластины, показанная на рисунке (B). Сокращения: OD = оптическая плотность; X0 = количество червей в колодце. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается, как анализируются данные о потреблении пищи из раздела 2 настоящего протокола. Первыми значениями, которые необходимо вычислить, являются контрольные значения самолиза . Бактерии со временем лизируются в жидкости, даже при отсутствии глистов. На этот показатель самолиза также могут влиять многие химические вещества, и его необходимо контролировать, поскольку он относительно велик по сравнению с потреблением пищи червями. Как описано в шаге 2.3.1.4 и показано на схеме на рисунке 2A, B, строка H содержит тот же раствор, за исключением червей. В нашей схеме планшетов, показанной на рисунке 2B, имеется 14 скважин на одно условие с двумя соответствующими контрольными лунками для самоэпиляции (строка H, «без червей»).
Рисунок 3: Репрезентативные данные. (А) На графике показаны кривые зависимости «доза-реакция» кратного изменения потребления пищи в зависимости от концентрации серотонина. Все данные показывают, что нестимулированное базальное потребление пищи нормализовано до N2-базального питания. Обратите внимание, что животные daf-16 (mu86) едят больше, чем животные дикого типа N2, когда серотонин не добавлялся, но демонстрируют притупленный диапазон их способности контролировать питание. (B) На графике показана диаграмма скрипичного изменения потребления пищи червями, получавшими 50 мкМ антипсихотика локсапина, но которых кормили бактериями, убитыми рентгеновскими лучами, γ-лучами или параформальдегидом (C). На графике показана диаграмма скрипки изменения потребления пищи различными мутантами с их генотипами, указанными по оси x. Эти данные свидетельствуют о том, что мутанты exc-4 и cgr-1 едят меньше, в то время как мутанты srp-6 едят больше. Звездочками обозначены ** p < 0,001, ****p < 0,0001, как определено ANOVA и Brown-Forsythe-Welch, скорректированные post hoc для учета проверки нескольких гипотез. Полосы погрешностей показывают ±S.E.M. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
На рисунке 1 показан общий рабочий процесс этого протокола. Он иллюстрирует весь процесс, от создания бактерий до получения показаний наружного диаметра600 в 1-й и 4-й день. Кроме того, инфографика ссылается на конкретные этапы используемых методов. На рисунках 2A, B показаны две возможные схемы расположения экспериментальных планшетов, включая контрольные скважины без червей в строке H, необходимые для расчета скоростей самолиза , описанных в разделе обсуждения. По опыту нашей лаборатории, необходимо, чтобы одним из условий был контроль N2 без лечения, учитывалась вариабельность потребления червей бактериями, наблюдаемая между экспериментами (см. обсуждение: Планирование [референтная популяция N2]).
На рисунке 2C показан пример электронной таблицы, используемой для анализа данных, сгенерированных в этом протоколе. Зеленым цветом выделено количество червей, оранжевым — день 1 OD600 и день 4 OD600 , а потребление пищи на одного червя — красным. Кроме того, каждая скважина отслеживается на предмет штамма, препарата, концентрации, даты эксперимента и других добавленных методов обработки. Более подробную информацию о конкретных используемых уравнениях можно найти в разделе 3 протокола. В целом, эти электронные таблицы (шаблон предоставлен в качестве дополнительных материалов) обеспечивают эффективный сбор и анализ данных по этому протоколу.
На рисунке 3A представлены репрезентативные результаты кривой «доза-реакция» того, как серотонин модулирует питание у мутантов N2 и daf-16 с использованием этого протокола. В этом эксперименте кратное изменение по сравнению с базальным потреблением пищи (первая точка на кривой) было рассчитано для пяти возрастающих доз серотонина. Как показывают эти результаты, штамм N2 способен переедать дозозависимым образом. Однако для мутанта daf-16(mu86), несмотря на то, что базальное питание выше, чем N2, мутант не может реагировать на серотонин таким же дозозависимым образом, как штамм N2. Этот протокол позволяет нам определить пищевое поведение между двумя штаммами, где концентрация серотонина была переменным фактором для построения кривых «доза-ответ». На рисунке 3B показано потребление пищи червями, получавшими антипсихотик локсапин, но получавшими бактерии, убитые рентгеновскими, γ-лучами или параформальдегидом. Обратите внимание, что эти эксперименты не проводились параллельно и что различия не являются репрезентативными для различных методов уничтожения бактерий, а обусловлены межэкспериментальной изменчивостью. На рисунке 3C показано потребление пищи рядом генетических штаммов, при этом два штамма демонстрируют снижение, а один штамм демонстрирует увеличение пищевого поведения по сравнению с N2. Такое применение протокола позволяет тестировать один препарат в одной концентрации на различных генетических фонах. Он подходит для идентификации генетических фонов, которые демонстрируют иную реакцию на потребление пищи, чем контрольная группа N2 дикого типа при приеме того же препарата. Он может быть сопряжен с нашим протоколом срока службы для быстрой проверки потребления пищи и срока службы в одной и той же конфигурации тарелки31.
Дополнительный материал: Шаблоны электронных таблиц, показанные на рисунке 2C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эти материалы.
Представленный протокол измеряет бактериальный клиренс в качестве показателя потребления пищи C. elegans в 96-луночных микротитровальных планшетах. Кривые «доза-реакция» в разделе репрезентативных результатов показывают, что анализ количественно измеряет потребление пищи, что было независимо подтверждено с использованием меченых изотопами бактерий11. Используя этот анализ, мы успешно протестировали одобренные FDA препараты, такие как антипсихотики, с известными метаболическими побочными эффектами у человека и показали, что эти препараты увеличивают кормление у C. elegans10,26. Анализ полезен для изучения генетики или фармакологии кормления и добавляет новый инструмент для исследований C. elegans для изучения метаболизма. Этот анализ представляет собой недорогой метод изучения кормления масштабируемым и экономичным по времени способом, что невозможно для большинства других организмов. Наша работа над препаратами, одобренными FDA, показывает, что многие побочные эффекты, наблюдаемые у людей, также наблюдаются у C. elegans, демонстрируя эволюционную консервацию 24,26,32.
Анализ ограничен концентрацией бактерий, которая может быть измерена в линейном диапазоне измерения наружного диаметра600 . В результате количество червей и диапазон концентраций бактерий, которые могут быть проанализированы, ограничены. Слишком большое количество червей повлияет на внешний диаметр600 , потребляя бактерии слишком быстро, следовательно, «съедая» концентрацию бактерий из линейного наружного диаметра600. По нашему опыту, изменчивость бактериального препарата является критическим параметром, который заставляет результаты варьироваться от одного эксперимента к другому. Мы безуспешно пытались заморозить большие партии бактерий или использовать лиофилизированные бактерии. В этих случаях либо скорость самолиза становилась слишком высокой, либо бактерии были такого качества, что замедляли развитие C. elegans . Однако наши тесты не были исчерпывающими, и эта проблема может быть решена.
В целом, скорость самолиза бактерий сложнее всего контролировать, и это может привести к значительной изменчивости. Мы обнаружили, что некоторые препараты могут увеличивать скорость самолиза до уровней, при которых анализ не может надежно определить потребление пищи. Поскольку скорость самолиза увеличивается с течением времени в анализе, мы не измеряли потребление пищи после 5-го дня взрослой жизни. К этому возрасту бактерии находятся в культуре ~10 дней. Чтобы измерить потребление пищи после 5-го дня взрослой жизни, старые бактерии необходимо смыть и заменить свежими.
Представленный анализ является продолжением нашего 96-луночного анализа на основе микротитровых планшетов31. Эта комбинация позволяет измерять продолжительность жизни и потребление пищи в одной и той же популяции. В то время как представленный здесь анализ бактериального клиренса не позволяет определить потребление пищи в течение всей жизни C. elegans из-за бактериального самолиза, он предоставляет надежные данные для первых четырех дней взрослой жизни, времени с наибольшим потреблением пищи. Особенно для открытия низкомолекулярных лекарств контроль за потреблением пищи имеет важное значение. Таким образом, мы ожидаем, что представленный анализ будет полезен сообществу C. elegans и расширит набор инструментов для изучения метаболизма или контроля над ним в контексте исследований старения и продолжительности жизни.
Планирование:
Прежде чем планировать измерение потребления пищи, необходимо принять во внимание несколько соображений.
Уничтожение бактерий:
Мы убиваем бактерии путем облучения рентгеновскими лучами в конической трубке объемом 50 мл (900 Грей за 4 ч при напряжении 160,0 кВ и 25,0 мА). Для облучения мы используем RS2000 от Rad Source. В зависимости от оборудования, конкретное время и доза облучения могут варьироваться от объекта к учреждению. Полное уничтожение бактерий должно быть определено путем нанесения на бактерии покрытия после облучения, чтобы обнаружить выживших по росту. Важно убить все бактерии, чтобы предотвратить рост во время анализа, так как это приведет к занижению корма или даже к отрицательным значениям кормления. Важно отметить, что бактерии должны быть уничтожены, чтобы C. elegans все еще мог их есть. По нашему опыту, существует три способа надежного уничтожения большого количества бактерий: (i) облучение рентгеновскими лучами, (ii) γ-лучами, и (iii) добавление формальдегида29,30. Скорости самолиза между этими тремя методами сопоставимы, с коэффициентом вариации 8% между скоростями самолиза для экспериментов, показанных на рисунке 3B. Методы, которые не работали надежно в наших руках, включали УФ-облучение, коктейли с антибиотиками, тепловую инактивацию и азид натрия. Эти методы либо не могут полностью убить бактерии (ультрафиолет и антибиотики), либо производят бактерии, которые C. elegans не едят (нагревание), либо изменяют потребление пищи (азид натрия).
Количество тиражей:
По нашему опыту, изменения складчатости при кормлении, как правило, невелики по сравнению с наблюдаемыми вариациями. Таким образом, для измерения изменений в потреблении пищи требуется несколько повторяющихся лунок. На рисунках 2A, B показаны 96-луночные планшеты, предназначенные для четырех или шести различных условий, с 21 или 14 повторяющимися лунками и двумя контрольными лунками для самолиза без червей. Учитывая большую изменчивость и относительно небольшие изменения, которые следует ожидать, 0,5-2,5-кратные изменения в кормлении, как правило, являются нижним и верхним пределом. Мы рекомендуем использовать от 14 до 21 повторяющейся лунки для каждого условия и по крайней мере две контрольные лунки для самолиза, описанные ниже. Этих репликатов достаточно для построения количественных кривых «доза-реакция» для препаратов, которые изменяют кормление11,26.
Управление самолизом:
OD600 измеряет количество частиц в растворе, в основном независимо от размера частиц. Однако мертвые бактерии будут лизироваться, теряя свою природу частиц. Мы называем это самолизом, который происходит независимо в присутствии червей и снижает измерения наружного диаметра600 без поедания червями. Самолиз происходит во время анализа и должен быть независимо измерен по крайней мере в двух лунках для каждого состояния. Эти колодцы обрабатываются так же, как и другие в том же состоянии, за исключением того, что они не содержат червей. Мы обнаружили, что многие препараты также могут изменять скорость самолиза. Таким образом, для каждого состояния необходимы независимые контрольные лунки для самоэпиляции с соответствующей их концентрацией. На рисунке 2 показана схема планшета для четырех или шести условий со всеми контрольными лунками для самолиза в нижней части планшета в строке H.
Референтная популяция N2:
Мы также отметили, что абсолютное количество потребляемых бактерий может колебаться между экспериментами, скорее всего, в зависимости от качества бактерий. Несмотря на все наши усилия каждый раз готовить их точно таким же образом, есть колебания. Например, бактерии могут быть собраны в деловом состоянии во время логарифмической фазы роста и, следовательно, быть намного больше по размеру, чем бактерии, собранные в стационарной фазе. Следовательно, эти простые различия в размерах бактерий могут привести к изменениям в количестве потребляемых бактерий и различным значениям наружного диаметра600 , поскольку измерения наружного диаметра600 не различают размеры. По этой причине мы всегда включаем одну популяцию необработанных контрольных животных N2, которая служит референсным значением, установленным либо на 1, либо на 100%, чтобы определить, едят ли экспериментальные группы больше или меньше, чем контрольная N2. Эта практика позволяет проводить сравнения между экспериментами, даже если значения наружного диаметра600 различаются.
Временные интервалы:
Использование значений OD600 для измерения потребления пищи требует заметного снижения концентрации бактерий. Поскольку объем культуры намного больше, чем у червей, они должны съесть значительное количество бактерий, чтобы произвести заметную разницу. Пребывание в линейном диапазоне для значений наружного диаметра600 требует, чтобы концентрация бактерий оставалась в диапазоне от ~1 мг/мл до 10 мг/мл, чтобы значительное количество бактерий исчезло для ее обнаружения. Черви едят больше всего с конца L4 до 4 дня взрослой жизни из-за яйценоскости. Таким образом, этот интервал является идеальным. Более короткие интервалы, такие как 24 часа, можно измеритьза 11 часов, но это значительно сложнее и требует ~40 скважин на одно условие. Еще один вариант измерения потребления пищи личинками – удвоить количество животных на лунку. Однако проблема с этим подходом заключается в том, что слишком большое количество червей начнет влиять на показания OD600 , когда они вырастут.
Стоковые растворы для тестируемых препаратов:
Если такие препараты, как серотонин, проверяются на их способность модулировать кормление, учитывайте следующее при приготовлении исходных растворов. Обычно мы готовим 50-кратный запас водорастворимых препаратов и добавляем 3 μЛ в каждую лунку (1:50), но другие концентрации запаса (100x, 300x) также работают. Однако, если препараты разводят в растворителях, отличных от воды (например, ДМСО), конечная концентрация не должна превышать 0,5%. Растворители быстро становятся вредными для C. elegans. Таким образом, исходные растворы лекарственных средств, растворенных в органических растворителях, таких как ДМСО, должны быть в 300 раз или выше.
Оценка живых и мертвых червей:
Определение живых и мертвых животных основано на движении червя. Используется сильный свет, особенно синий, потому что он заставляет животных двигаться. Кроме того, подсчет количества животных в скважине покажет, есть ли избыточная смертность. Избыточная смертность может произойти при возникновении токсичных веществ или высоких концентраций (>0,5%) нескольких растворителей, включая ДМСО. Как правило, мертвых животных должно быть менее 1:100 (1%). Тарелки можно встряхивать в течение 30 с при 800 об/мин на вибростенде для микротитрования, если пища осела и популяцию становится трудно подсчитать. Игнорируйте лунки с самцами или более 16 червей (см. проблемы).
Возможные проблемы:
Недостаточное встряхивание:
В жидкой среде бактерии могут легко слипаться и оседать на дне лунок. По нашему опыту, встряхивание в течение менее 20 минут может не привести к разрушению бактериальных комков и их ресуспендированию, что приведет к неточным измерениям наружного диаметра600 . Измерения наружного диаметра600 в присутствии бактериальных комков будут недооценивать концентрацию бактерий. Чрезмерные настройки шейкера могут привести к прилипанию жидкости к герметику. После того, как герметик будет снят для показаний наружного диаметра600 , жидкость, прилипшая к герметику, приведет к снижению внешнего диаметра600 . Если на герметике есть жидкость, быстро раскрутите пластину на низкой скорости (500-1 000 об/мин) и снова встряхните в течение 5 минут. Кроме того, убедитесь, что, как указано для показаний в День 1 и День 4, показания были сделаны в течение 10 минут после встряхивания планшетов, чтобы избежать оседания бактерий.
Различные абсолютные значения потребления пищи между экспериментами:
Несмотря на все наши усилия по стандартизации бактериальных препаратов, они часто различаются по способам, влияющим на потребление пищи червями. Например, из-за своего делительного состояния бактерии различаются по размеру в зависимости от того, были ли они собраны в логарифмической фазе роста или в стационарной фазе, причем логарифмические бактерии крупнее. Из-за того, что измерения OD600 не различают размеры, различия в размере бактерий из-за фазы, в которой бактерии были собраны, могут привести к очевидным различиям, наблюдаемым в базальном потреблении пищи между бактериальными препаратами. Лучший способ сравнения экспериментов — всегда включать необработанную контрольную популяцию N2 и нормализовать результаты для этой популяции N2.
Эффекты скученности:
Концентрация бактерий в этом протоколе достаточна для поддержания наружного диаметра600 в линейном диапазоне для 2-16 червей на лунку в течение ~72 ч. В зависимости от интересующего препарата, лунка, содержащая более 16 червей, может истощить бактериальную концентрацию до второго измерения. Мы также обнаружили, что скважины с одним животным, как правило, ненадежны. Фактор лизиса перевешивает то, что ест один червь. Следовательно, незначительные погрешности в определении фактора лизиса непропорционально влияют на скважины с меньшим количеством червей.
Мы рекомендуем исключить скважины из статистического анализа при выполнении одного из приведенных ниже условий. В колодце есть самцы (у нас нет данных, сравнивающих потребление пищи самцами и гермафродитами); в колодце менее 2 червей или более 16 червей в скважине; черви мертвы при втором чтении; или если в скважинах есть потомство из-за отказа FUdR. FUdR чувствителен к теплу и инактивируется даже при низких температурах до 37 °C. Всегда размораживайте FUdR в воде комнатной температуры.
Отрицательные значения потребления пищи:
Значения потребления пищи иногда бывают отрицательными, что говорит о большем количестве пищи в 4-й день, чем в 1-й. Отрицательные значения потребления пищи могут указывать на один из следующих факторов: высокая скорость самолиза , возможно, вызванная добавлением препарата, действующего на бактерии, или отрицательные значения потребления пищи, которые могут указывать на то, что колодец загрязнен и растет что-то другое, а не черви. Скорость самолиза также увеличивается по мере взросления бактерий; Поэтому мы рекомендуем использовать бактерии не старше недели. Добавлен препарат, который со временем выпадает в осадок, влияя на значение OD600 . Недостаточное встряхивание в 1-й день может привести к снижению значения наружного диаметра600 из-за бактериальных комков. Черви подвергались гипоксическому стрессу. Это происходит, когда соотношение поверхности и воздуха недостаточно для обеспечения кислородного обмена. Используйте в материалах специальный 96-луночный планшет и не превышайте 150 мкл (120 мкл + 30 мкл FUdR) на лунку. Расстояние между поверхностью скважины и дном, где обитают черви, определяет концентрацию кислорода.
Ограничения:
Этот анализ ограничен жидкой культурой. Пищевое поведение, наблюдаемое в твердых тарелках, например, перемещение по лужайкам и отходам от них, не может быть оценено с помощью анализа.
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Мы хотим поблагодарить Сяолань Е, так как этот протокол был разработан в результате наблюдения, которое она первоначально сделала. Мы благодарим всех бывших и нынешних членов лаборатории Petrascheck за их помощь в разработке и оптимизации этого протокола. Эта работа была профинансирована R21 AG080376 (M.P.). Некоторые штаммы были предоставлены CGC, который финансируется Управлением программ исследовательской инфраструктуры NIH (P40 OD010440).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amphotericin B | RPI | A40030-0.1 | solvent: EtOH |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | solvent: water |
Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | use to make NGM plates |
Carbenicillin | Fisher Scientific | 46-100-RG | solvent: water |
Cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 µm to remove adults |
Cholesterol | MP Biomedicals | 02101380-CF | 5 mg/mL stock |
Difco, Agar, Bacteriological | BD Biosciences | 214510 | use to make NGM plates |
Fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich | F0503 | to sterilize worms on L4 |
Luria Broth | RPI | L24045-1000.0 | open capsule, mix with 1 L of water, autoclave |
M9 Buffer | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136) 5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246) autoclave | |
Microplate Sealer | Fisher Scientific | 236707 | |
OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
Plate 96-well | Falcon | 351172 | |
Plate reader | Tecan | 30016056 | use 600 nm filter lens |
Potassium Citrate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 900 mL of dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave | |
Potassium Phosphate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave | |
S-Basal | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58) 50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) add 900 mL dH2O autoclave, cool to 55 °C | |
S-Complete | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT) 10 mL of 1 M potassium citrate pH 6, 10 mL of trace metal solutions 3 mL of 1 M CaCl2 3 mL of 1 M MgSO4 | |
Serotonin hydrochloride | Thermo Scientific | AAB2126309 | used at 5 mM |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653-5KG | to make buffers and NGM plates |
Terrific Broth | Thermo Scientific | J75856-A1 | 12.5 g in 250 mL of water, autoclave |
Titer plate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | shaken at 800 rpm, depends on shaker |
Trace Metals Solution | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278) 0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287) 0.016 g CuSO4 (FW: 158) autoclave wrap in aluminum foil to keep in the dark |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены