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Method Article
* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Die hepatische Insulinclearance ist entscheidend für die Regulierung der Glukosehomöostase. Dieser Artikel beschreibt ein benutzerfreundliches hepatisches Perfusionsverfahren zur direkten Bewertung der hepatischen Insulinclearance-Rate in situ bei Mäusen.
Die hepatische Insulinclearance ist für die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase unerlässlich und steht in engem Zusammenhang mit Stoffwechselstörungen wie Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Diabetes. Eine genaue Messung der Insulinclearance ist entscheidend für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen dieser Erkrankungen. Dieses Protokoll stellt ein unkompliziertes und benutzerfreundliches Verfahren zur Leberperfusion bei Mäusen dar, das speziell für die direkte Bewertung der hepatischen Insulinclearance-Rate entwickelt wurde. Die Methode beinhaltet eine präzise Kanülierung der Pfortader und der suprahepatischen unteren Hohlvene, um ein in situ Perfusionssystem zu schaffen, das physiologische Bedingungen nachahmt. Das Protokoll führt die Forscher durch jede Phase des Eingriffs, von der chirurgischen Vorbereitung über die Einrichtung des Perfusionssystems bis hin zur Probenentnahme und -analyse. Es gibt eine detaillierte Anleitung, zusammen mit repräsentativen Ergebnissen und wichtigen Tipps zur Optimierung des Verfahrens. Ein Video-Tutorial begleitet das schriftliche Protokoll mit visuell detaillierten Anweisungen und Illustrationen, was es zu einem zugänglichen und umfassenden Nachschlagewerk für Wissenschaftler macht, die die molekularen Mechanismen hinter dem hepatischen Insulinstoffwechsel und der Insulinclearance erforschen.
Die Entdeckung des Insulins ist zu einem der Meilensteine des letzten Jahrhunderts geworden. Über die Regulation der Insulinsynthese, der Insulinsekretion und ihrer physiologischen Funktionen in Stoffwechselgeweben ist viel bekannt. Der Insulinabbau und seine Regulationsmechanismen wurden jedoch weniger in den Fokus gerückt. Unter dem Insulinstoffwechsel versteht man das Zusammenspiel zwischen der Funktion der Betazelle, der Insulinresistenz (IR) bzw. -sensitivität und der Insulinclearance. Neben der Insulinsekretion spielt die hepatische Insulinclearance eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des homöostatischen Insulinspiegels, der für das Erreichen des peripheren Zielgewebes und die Erleichterung der richtigen Insulinwirkung erforderlich ist1. Mehrere Studien haben eine gestörte Insulinclearance als entscheidenden Faktor für die Pathogenese der Hyperinsulinämie beim metabolischen Syndrom sowie bei anderen Erkrankungen wie Typ-2-Diabetes 2,3, nichtalkoholischer Steatohepatitis4 und polyzystischem Ovarialsyndrom5 identifiziert. Daher kann Hyperinsulinämie als Folge einer verminderten Clearance eine Rolle bei der Pathogenese von Stoffwechselerkrankungen spielen. Strategien, die die Insulinclearance verbessern, haben das Potenzial, die ungünstigen Auswirkungen der Hyperinsulinämie bei diesen Personen umzukehren.
Insulin hat ein einzigartiges Verteilungsmuster. Die Höhe des zirkulierenden Plasmainsulins hängt vom Gleichgewicht zwischen Insulinsekretion und -entfernung ab. Die Bauchspeicheldrüse schüttet pulsierend Insulin in die Pfortader aus und leitet es zu den Hepatozyten. Als erstes Organ, das mit einer Insulinsekretion konfrontiert ist, baut die Leber während ihrer ersten Passage den Großteil des Insulins ab und macht 60 % bis 70 % des Gesamtinsulinsaus 6. Das verbleibende Insulin verlässt die Leber durch die Lebervene und gelangt in den systemischen Kreislauf, wo es teilweise von peripheren Geweben (hauptsächlich Muskeln, Fettgewebe und Nieren) verwertet wird, bevor es von der Leber während seines zweiten Durchgangs durch die Leberarterie weiter extrahiert wird7.
Die genaue Messung der Insulinclearance ist entscheidend. Die direkte Messung der hepatischen Insulinclearance in Humanstudien ist eine Herausforderung, da die Entnahme von Blutproben aus den Pfortadern und Lebervenen schwierig ist. Sowohl direkte als auch indirekte Methoden werden verwendet, um die Insulinclearance bei Menschen und Tiermodellen abzuschätzen. Es werden ungefähr drei Strategien angewendet, um die Insulinclearance indirekt zu messen. Bei den in der klinischen Praxis am häufigsten verwendeten Assessments handelt es sich um Methoden, die auf dem molaren Verhältnis von C-Peptidzu Insulin basieren 8. Dieser Ansatz beruht auf der äquimolaren Sekretion beider Peptide und dem Fehlen einer C-Peptid-Extraktion durch die Leber9. Die zweite Gruppe von Methoden beruht auf der mathematischen Analyse der Plasmazerfallskurven von Insulin nach einer bekannten und spezifischen Eintragung des Hormons in den Blutkreislauf 2,10,11. Die dritte Methode basiert auf der Tatsache, dass die Infusion von Insulin mit einer konstanten Rate zu stabilen Hormonspiegeln im Blut führt, wobei die Entfernungsrate der Verabreichungsrate entspricht12. Diese indirekten Methoden spiegeln in erster Linie die gesamte Insulinclearance im Körper wider. Da die Leber der primäre Ort der Insulinclearance ist und eine entscheidende Rolle in diesem Prozess spielt, ist es wichtig, die hepatische Insulinclearance direkt zu bewerten.
Frühere Studien haben die hepatische Insulinextraktion bei gesunden Hunden direkt gemessen13,14. In Studien wurde auch ein isoliertes perfundiertes Rattenlebermodell verwendet, um die Insulinextraktion aus der Leber zu beurteilen15,16. Aufgrund der hohen Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Stämmen dienen Mäuse als wertvolle Modelle für die Untersuchung molekularer Signalwege. In einigen Studien17 wurde die Leberperfusion verwendet, um die hepatische Insulinclearance in einem Mausmodell direkt zu beurteilen. In diesen Studien wird ein Perfusat, das Humaninsulin enthält, in die Pfortader infundiert und aus der unteren Hohlvene entnommen. Der Anteil des von der Leber aufgenommenen Insulins zeigt ihre Clearance an. Die Leberperfusionstechnik hält die Leber unter nahezu physiologischen Bedingungen, indem ein warmes, sauerstoffreiches und mit Nährstoffen angereichertes Perfusat durch das Lebergefäßsystem zirkuliert. Es gibt jedoch nicht genügend praktische Anleitungen und wichtige Tipps, um diese Technik voranzutreiben und zu verbreiten.
Während die hepatische Insulinclearance zunehmend Aufmerksamkeit erfährt, bleibt ihre Rolle bei Erkrankungen sowie ihre molekularen Mechanismen unklar18. Daher sind fortschrittliche Techniken im Bereich der wissenschaftlichen Forschung dringend erforderlich. Dieses Protokoll legt ein detailliertes modifiziertes Leberperfusionsverfahren bei Mäusen zur Beurteilung der hepatischen Insulinclearance fest. Darüber hinaus kann diese Methode auch verwendet werden, um die Auswirkungen von Medikamenten auf die Leber zu untersuchen, einschließlich des First-Pass-Effekts, der Wirkstofftransportprozesse und verschiedener anderer Aspekte.
Dieses Protokoll wurde vom Animal Care and Use Committee der Nanjing Medical University (IACUC-2105018) genehmigt und folgte den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee. Alle C57BL/6N-Mäuse wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Sechs Wochen alte Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in eine Chow-Diät-Gruppe (CD) und eine Gruppe mit fettreicher Diät (HFD) eingeteilt. Die HFD-Gruppe erhielt eine 60% fettreiche Diät und setzte diese Diät bis zum Alter von 10 Wochen fort. Das durchschnittliche Körpergewicht betrug 28,55 g ± 1,2 g für die HFD-Gruppe und 24,3 g ± 0,48 g für die Kontrollgruppe. Die Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung
2. Chirurgische Katheterisierung
3. Durchblutung der Leber
4. Datenanalyse
Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren für die Leberinfusion zur direkten Berechnung der hepatischen Insulinclearance. Dieses Modell ist zuverlässig und reproduzierbar. Ein Beispiel für die Ergebnisse eines Experiments ist in Abbildung 3 dargestellt. Nach einer 10-minütigen Äquilibrierungsphase wurde KRBH-Puffer, der mit 4,0 ng/ml Humaninsulin supplementiert wurde, 30 Minuten lang durch die Pfortader perfundiert. In Abständen von 2 Minuten wurde Per...
Kritische Schritte im Protokoll
Die oben beschriebenen chirurgischen Eingriffe sollten mit sanfter Sorgfalt durchgeführt werden, um Läsionen in der Leber zu vermeiden. Darüber hinaus macht die fragile Struktur der Lebervenengefäßwand sie anfällig für Punktionen und nachfolgende Blutungen, wenn sie während der Kanülierung nicht vorsichtig behandelt wird. In diesem Protokoll werden weichere Silikonschläuche verwendet, um die Schädigung der Blutgefäße zu min...
Es wurden keine Interessenkonflikte erklärt.
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82200948, 82270921, 82170882) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
60% high-fat diet | Research Diets, USA | D12492 | |
Alanine aminotransferase Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C009-2-1 | |
Anhydrous Glucose | Sangon Biotech | 50-99-7 | 500 G |
Aspartate aminotransferase Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C010-2-1 | |
Bovine Serum Albumin | GeminiBio | 700-107P | Fatty Acid-Free |
Contour TS Blood Glucose Meter | Bayer | PH220800019 | |
Contour TS Blood Glucose Test Strips | Bayer | DP38M3F05A | |
Heparin Sodium | Changzhou Qian hong Bio-pharma | H32022088 | 12500 U/2mL |
Human insulin | Novo Nordisk | S20191007 | 300 U/3mL |
Human insulin immunoassay kit | Ezassay Biotechnology | HM200 | |
KRBH buffer (Sugar, BSA free) | coolaber | SL65501 | 500 mL |
Membrane oxygenator | Xi'an Xijing Medical Appliance | 5 | |
Microscopic scissors | Shanghai Jinzhong | YBC020 | |
Micro-serrefine clamp | Ningbo Medical Needle | 180709 | |
Microsurgery forceps | Shanghai Jinzhong | WA3010, WA3020 | |
Needle type filter | N-buliv | LG05-133-2 | |
Povidone-iodine Solution | Shanghai likang Disinfectant Hi-Tech | 20231016J | |
pump 11 Elite | Harvard Apparatus | PC5 70-4500 | |
Retractor | Globalebio (Beijing) Technology | GEKK-10mm | 10 mm |
Silicone Tubing | scientific commodities | #BB518-12 | 0.31 mm × 0.64 mm |
Silicone Tubing | Fisher Scientific | #11-189-15A | ID 0.5 mm |
Sodium Chloride Injection | Baxter | S2402023 | 4.5 g/500 mL |
Surgical silk suture | Yangzhou Huanyu Medical Equipment | 6-0 | |
Temperature modulation | Xi'an Xijing Medical Appliance | 6 | |
Thermostatic water bath | Jiaxing Junsi Electronics | HIH-1 | 220 V 50 HZ |
Three-way Joint | YISAI | AQTCY1.6 | ID 0.4 mm |
Xylazine Hydrochloride Injection | ShengXin | 20240106 | 200 mg/2mL |
Zoletil 50 | Virbac | WK001 | 250 mg/5mL |
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