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Method Article
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
La clairance hépatique de l’insuline est essentielle pour réguler l’homéostasie du glucose. Cet article décrit une procédure de perfusion hépatique conviviale permettant d’évaluer directement le taux de clairance hépatique de l’insuline in situ chez la souris.
La clairance hépatique de l’insuline est essentielle au maintien de l’homéostasie du glucose et est étroitement liée aux troubles métaboliques tels que l’obésité, la résistance à l’insuline et le diabète. Une mesure précise de la clairance de l’insuline est essentielle pour comprendre les mécanismes sous-jacents de ces affections. Ce protocole présente une procédure de perfusion hépatique simple et conviviale chez la souris, spécialement conçue pour évaluer directement le taux de clairance hépatique de l’insuline. La méthode implique une canulation précise de la veine porte et de la veine cave inférieure suprahépatique pour créer un système de perfusion in situ qui imite les conditions physiologiques. Le protocole guide les chercheurs à travers toutes les étapes de la procédure, de la préparation chirurgicale et la mise en place du système de perfusion à la collecte et à l’analyse des échantillons. Des instructions détaillées sont fournies, ainsi que des résultats représentatifs et des conseils importants pour optimiser la procédure. Un tutoriel vidéo accompagne le protocole écrit, offrant des instructions et des illustrations visuellement approfondies, ce qui en fait une référence accessible et complète pour les scientifiques qui explorent les mécanismes moléculaires à l’origine du métabolisme et de la clairance de l’insuline hépatique.
La découverte de l’insuline est devenue l’un des jalons du siècle dernier. On sait beaucoup de choses sur la régulation de la synthèse et de la sécrétion d’insuline et de ses fonctions physiologiques dans les tissus métaboliques. Cependant, l’accent a été moins mis sur la dégradation de l’insuline et ses mécanismes de régulation. Le métabolisme de l’insuline peut être compris comme l’interaction entre la fonction des cellules bêta, la résistance à l’insuline (IR) ou la sensibilité et la clairance de l’insuline. Parallèlement à la sécrétion d’insuline, la clairance hépatique de l’insuline joue un rôle crucial dans le maintien du niveau homéostatique d’insuline nécessaire pour atteindre les tissus cibles périphériques et faciliter l’action correcte de l’insuline1. De nombreuses études ont identifié l’altération de la clairance de l’insuline comme un facteur crucial dans la pathogenèse de l’hyperinsulinémie dans le syndrome métabolique, ainsi que dans d’autres affections telles que le diabète de type 2 2,3, la stéatohépatite non alcoolique 4 et le syndrome des ovaires polykystiques5. Ainsi, l’hyperinsulinémie secondaire à une clairance réduite peut jouer un rôle dans la pathogenèse de la maladie métabolique. Les stratégies qui améliorent la clairance de l’insuline ont le potentiel d’inverser les effets défavorables de l’hyperinsulinémie chez ces personnes.
L’insuline a un mode de distribution unique. Le taux d’insuline plasmatique circulante dépend de l’équilibre entre la sécrétion et l’élimination de l’insuline. Le pancréas sécrète de l’insuline dans la veine porte de manière pulsatile, en la dirigeant vers les hépatocytes. En tant que premier organe à rencontrer la sécrétion d’insuline, le foie dégrade la majorité de l’insuline lors de son premier passage, représentant 60 à 70 % de l’insuline totale6. L’insuline restante sort du foie par la veine hépatique, entrant dans la circulation systémique, où elle est partiellement utilisée par les tissus périphériques (principalement les muscles, le tissu adipeux et les reins) avant d’être extraite par le foie lors de son deuxième passage dans l’artère hépatique7.
La mesure précise de la clairance de l’insuline est cruciale. Il est difficile de mesurer directement la clairance hépatique de l’insuline dans les études humaines, car il est difficile d’obtenir des échantillons de sang dans les veines porte et hépatiques. Des méthodes directes et indirectes sont utilisées pour estimer la clairance de l’insuline chez l’homme et les modèles animaux. Environ trois stratégies sont employées pour mesurer indirectement la clairance de l’insuline. Les évaluations les plus fréquemment utilisées dans la pratique clinique impliquent des méthodes basées sur le rapport molaire C-peptide/insuline8. Cette approche est fondée sur la sécrétion équimolaire des deux peptides et l’absence d’extraction du peptide C par le foie9. Le deuxième groupe de méthodes dépend de l’analyse mathématique des courbes de décroissance plasmatique de l’insuline après une entrée connue et spécifique de l’hormone dans la circulation 2,10,11. La troisième méthode est basée sur le fait que la perfusion d’insuline à un taux constant conduit à des niveaux stables de l’hormone dans le sang, où le taux d’élimination correspond au taux d’administration12. Ces méthodes indirectes reflètent principalement la clairance globale de l’insuline dans le corps. Étant donné que le foie est le principal site de clairance de l’insuline et joue un rôle crucial dans ce processus, il est essentiel d’évaluer directement la clairance hépatique de l’insuline.
Des études antérieures ont mesuré directement l’extraction hépatique de l’insuline chez des chiens en bonne santé13,14. Des études ont également utilisé un modèle isolé de foie de rat perfusé pour évaluer l’extraction de l’insuline du foie15,16. En raison de la grande disponibilité des souches génétiquement modifiées, les souris servent de modèles précieux pour l’étude des voies moléculaires. Quelques étudesont utilisé la perfusion hépatique pour évaluer directement la clairance hépatique de l’insuline dans un modèle murin. Dans ces études, un perfusat contenant de l’insuline humaine est perfusé dans la veine porte et prélevé dans la veine cave inférieure. La proportion d’insuline absorbée par le foie indique sa clairance. La technique de perfusion hépatique maintient le foie dans des conditions quasi physiologiques en faisant circuler un perfusat chaud, oxygéné et enrichi en nutriments à travers le système vasculaire hépatique. Cependant, il n’y a pas suffisamment d’orientations pratiques et de conseils essentiels pour faire progresser et diffuser cette technique.
Ainsi, alors que la clairance hépatique de l’insuline a fait l’objet d’une attention croissante, son rôle dans les troubles, ainsi que ses mécanismes moléculaires, restent incertains18. Par conséquent, les techniques de pointe sont grandement nécessaires dans le domaine de la recherche scientifique. Ce protocole établit une procédure détaillée de perfusion hépatique modifiée chez la souris pour évaluer la clairance hépatique de l’insuline. De plus, cette méthode peut également être utilisée pour étudier les effets des médicaments sur le foie, y compris l’effet de premier passage, les processus de transport des médicaments et divers autres aspects.
Ce protocole a été approuvé par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine de Nanjing (IACUC-2105018) et a suivi les directives du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux. Toutes les souris C57BL/6N ont été maintenues sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Des souris âgées de six semaines ont été divisées au hasard en un groupe de régime Chow (CD) et un groupe de régime riche en graisses (HFD). Le groupe HFD a été nourri avec un régime riche en graisses à 60 % et a continué à suivre ce régime jusqu’à l’âge de 10 semaines. Le poids corporel moyen était de 28,55 g ± 1,2 g pour le groupe HFD et de 24,3 g ± 0,48 g pour le groupe témoin. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.
1. Préparation
2. Cathétérisme chirurgical
3. Perfusion hépatique
4. Analyse des données
Ce protocole décrit la procédure de perfusion hépatique pour calculer directement la clairance hépatique de l’insuline. Ce modèle est fiable et reproductible. La figure 3 donne un exemple des résultats obtenus à partir d’une expérience. Après une période d’équilibre de 10 minutes, le tampon KRBH complété par 4,0 ng/mL d’insuline humaine a été perfusé par la veine porte pendant 30 min. Le liquide de perfusion a été prélevé à parti...
Étapes critiques du protocole
Les interventions chirurgicales décrites ci-dessus doivent être effectuées avec soin afin d’éviter de créer des lésions hépatiques. De plus, la structure fragile de la paroi vasculaire veineuse du foie la rend vulnérable à la ponction et aux saignements ultérieurs si elle n’est pas manipulée avec soin lors de la canulation. Des tubes en silicone plus souples sont utilisés dans ce protocole pour minimiser les dommages aux ...
Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82200948, 82270921, 82170882).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
60% high-fat diet | Research Diets, USA | D12492 | |
Alanine aminotransferase Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C009-2-1 | |
Anhydrous Glucose | Sangon Biotech | 50-99-7 | 500 G |
Aspartate aminotransferase Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C010-2-1 | |
Bovine Serum Albumin | GeminiBio | 700-107P | Fatty Acid-Free |
Contour TS Blood Glucose Meter | Bayer | PH220800019 | |
Contour TS Blood Glucose Test Strips | Bayer | DP38M3F05A | |
Heparin Sodium | Changzhou Qian hong Bio-pharma | H32022088 | 12500 U/2mL |
Human insulin | Novo Nordisk | S20191007 | 300 U/3mL |
Human insulin immunoassay kit | Ezassay Biotechnology | HM200 | |
KRBH buffer (Sugar, BSA free) | coolaber | SL65501 | 500 mL |
Membrane oxygenator | Xi'an Xijing Medical Appliance | 5 | |
Microscopic scissors | Shanghai Jinzhong | YBC020 | |
Micro-serrefine clamp | Ningbo Medical Needle | 180709 | |
Microsurgery forceps | Shanghai Jinzhong | WA3010, WA3020 | |
Needle type filter | N-buliv | LG05-133-2 | |
Povidone-iodine Solution | Shanghai likang Disinfectant Hi-Tech | 20231016J | |
pump 11 Elite | Harvard Apparatus | PC5 70-4500 | |
Retractor | Globalebio (Beijing) Technology | GEKK-10mm | 10 mm |
Silicone Tubing | scientific commodities | #BB518-12 | 0.31 mm × 0.64 mm |
Silicone Tubing | Fisher Scientific | #11-189-15A | ID 0.5 mm |
Sodium Chloride Injection | Baxter | S2402023 | 4.5 g/500 mL |
Surgical silk suture | Yangzhou Huanyu Medical Equipment | 6-0 | |
Temperature modulation | Xi'an Xijing Medical Appliance | 6 | |
Thermostatic water bath | Jiaxing Junsi Electronics | HIH-1 | 220 V 50 HZ |
Three-way Joint | YISAI | AQTCY1.6 | ID 0.4 mm |
Xylazine Hydrochloride Injection | ShengXin | 20240106 | 200 mg/2mL |
Zoletil 50 | Virbac | WK001 | 250 mg/5mL |
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