Оценка клиренса инсулина у мышей с помощью перфузии печени in situ

Резюме

Печеночный клиренс инсулина имеет решающее значение для регуляции гомеостаза глюкозы. В этой статье описана удобная процедура перфузии печени для непосредственной оценки скорости клиренса печеночного инсулина in situ у мышей.

Аннотация

Печеночный клиренс инсулина необходим для поддержания гомеостаза глюкозы и тесно связан с метаболическими нарушениями, такими как ожирение, резистентность к инсулину и диабет. Точное измерение клиренса инсулина имеет жизненно важное значение для понимания основных механизмов этих состояний. Этот протокол представляет собой простую и удобную для пользователя процедуру перфузии печени у мышей, специально разработанную для непосредственной оценки скорости клиренса печеночного инсулина. Метод включает в себя точную канюляцию воротной вены и надпеченочной нижней полой вены для создания перфузионной системы in situ , имитирующей физиологические условия. Протокол помогает исследователям пройти через каждый этап процедуры, от хирургической подготовки и настройки системы перфузии до сбора и анализа образцов. Предоставляются подробные инструкции, а также репрезентативные результаты и важные советы по оптимизации процедуры. Видеоурок сопровождает письменный протокол, предлагая визуально подробные инструкции и иллюстрации, что делает его доступным и всеобъемлющим справочником для ученых, изучающих молекулярные механизмы метаболизма и клиренса инсулина в печени.

Введение

Открытие инсулина стало одной из вех прошлого века. Много известно о регуляции синтеза, секреции и физиологических функций инсулина в метаболических тканях. Тем не менее, меньше внимания уделялось деградации инсулина и ее регуляторным механизмам. Метаболизм инсулина можно понимать как взаимодействие между функцией бета-клеток, инсулинорезистентностью (ИК) или чувствительностью и клиренсом инсулина. Наряду с секрецией инсулина, печеночный клиренс инсулина играет решающую роль в поддержании гомеостатического уровня инсулина, необходимого для достижения периферических тканей-мишеней и содействия правильному^{действию} инсулина. Многочисленные исследования определили нарушение клиренса инсулина как решающий фактор в патогенезе гиперинсулинемии при метаболическом синдроме, а также при других состояниях, таких как сахарный диабет 2 типа ^2,3, неалкогольный стеатогепатит⁴ и синдром поликистозных яичников⁵. Таким образом, гиперинсулинемия, вторичная по отношению к сниженному клиренсу, может играть роль в патогенезе метаболических заболеваний. Стратегии, которые улучшают клиренс инсулина, могут обратить вспять неблагоприятные последствия гиперинсулинемии у этих людей.

Инсулин имеет уникальную схему распределения. Уровень циркулирующего плазменного инсулина зависит от равновесия между секрецией и выведением инсулина. Поджелудочная железа пульсирующим образом выделяет инсулин в воротную вену, направляя его к гепатоцитам. Будучи первым органом, который сталкивается с секрецией инсулина, печень разрушает большую часть инсулина во время его первого прохождения, составляя 60-70% от общего количества^{инсулина6}. Оставшийся инсулин выводится из печени через печеночную вену, попадая в системный кровоток, где он частично используется периферическими тканями (в первую очередь мышцами, жировой тканью и почками) перед дальнейшим извлечением печенью во время его второго прохождения через печеночную^{артерию}.

Точное измерение клиренса инсулина имеет решающее значение. Прямое измерение клиренса печеночного инсулина в исследованиях на людях является сложной задачей, поскольку получение образцов крови из воротных и печеночных вен затруднено. Для оценки клиренса инсулина у людей и животных моделей используются как прямые, так и косвенные методы. Для косвенного измерения клиренса инсулина используются примерно три стратегии. Наиболее часто используемые в клинической практике оценки включают методы, основанные на молярном соотношении С-пептид/инсулин⁸. Этот подход основан на эквимолярной секреции обоих пептидов и отсутствии экстракции С-пептидов печенью⁹. Вторая группа методов основана на математическом анализе кривых распада инсулина в плазме крови после известного и специфического ввода гормона в кровоток ^2,10,11. Третий метод основан на том, что вливание инсулина с постоянной скоростью приводит к стабильному уровню гормона в крови, где скорость выведения соответствует скорости введения¹². Эти косвенные методы в первую очередь отражают общий клиренс инсулина в организме. Учитывая, что печень является основным местом клиренса инсулина и играет решающую роль в этом процессе, важно непосредственно оценить печеночный клиренс инсулина.

В предыдущих исследованиях непосредственно измеряли экстракцию инсулина в печени у здоровых собак^13,14. В исследованиях также использовалась изолированная перфузированная модель печени крысы для оценки экстракции инсулина из печени^15,16. Благодаря высокой доступности генетически модифицированных штаммов, мыши служат ценными моделями для исследования молекулярных путей. В нескольких исследованиях¹⁷ перфузия печени использовалась для непосредственной оценки печеночного клиренса инсулина на мышиной модели. В этих исследованиях перфузат, содержащий человеческий инсулин, вводится в воротную вену и собирается из нижней полой вены. Доля инсулина, поглощаемого печенью, указывает на его клиренс. Метод перфузии печени поддерживает печень в условиях, близких к физиологическим, путем циркуляции теплого, насыщенного кислородом и обогащенного питательными веществами перфузата через сосудистую сеть печени. Тем не менее, нет достаточных практических указаний и важных советов по продвижению и распространению этой техники.

Таким образом, в то время как печеночный клиренс инсулина привлекает все больше внимания, его роль в расстройствах, а также его молекулярные механизмы^{остаются неясными}. Поэтому в области научных исследований очень нужны передовые методики. Этот протокол устанавливает детальную процедуру модифицированной перфузии печени у мышей для оценки клиренса печеночного инсулина. Кроме того, этот метод также может быть использован для изучения влияния лекарств на печень, включая эффект первого прохождения, процессы транспортировки лекарств и различные другие аспекты.

протокол

Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию Нанкинским медицинским университетом (IACUC-2105018) и соответствует рекомендациям Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию. Все мыши C57BL/6N содержались в 12-часовом цикле свет/темнота со свободным доступом к пище и воде. Шестинедельные мыши были случайным образом разделены на группу диеты Чау (CD) и группу диеты с высоким содержанием жиров (HFD). Группа HFD получала пищу с 60% высоким содержанием жиров и продолжала придерживаться этой диеты до 10-недельного возраста. Средняя масса тела составила 28,55 г ± 1,2 г в группе HFD и 24,3 г ± 0,48 г в контрольной группе. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка

1. Выполняйте необходимую стерилизацию хирургических инструментов и расходных материалов с помощью автоклавирования.
2. Положите на операционный стол хирургические инструменты, шелковый шовный материал 6-0, стерильный маленький ватный аппликатор, инъекцию хлорида натрия (500 мл), ватные палочки и губки.
3. Приготовьте 30 мл гепаринизированного физиологического раствора с конечной концентрацией 200 МЕ/мл.
4. Подготовьте две силиконовые трубки с внутренним диаметром 0,31 мм и внешним диаметром 0,64 мм; Один длиной 4 см для использования в качестве катетера воротной вены, а другой 10 см в длину для использования в качестве катетера нижней полой вены.
5. Приготовьте перфузионный буфер Krebs-Henseleit (KRBH), содержащий 5,0 ммоль/л глюкозы и 0,25% BSA.
6. Приготовьте перфузионный буфер Krebs-Henseleit (KRBH), содержащий 5,0 ммоль/л глюкозы, 0,25% BSA и 4,0 нг/мл человеческого инсулина.
7. Настройте систему перфузии печени. На рисунке 1 представлены основные компоненты системы перфузии печени.

2. Хирургическая катетеризация

1. Приготовьте обезболивающую смесь, выполнив следующие действия:
   1. Развести Золетил 50 (250 мг/5 мл) в 10 раз с 0,9% раствором натрия хлорида.
   2. Ксилазина гидрохлорид (200 мг/2 мл) развести в 10 раз с 0,9% раствором натрия хлорида.
   3. Смешайте 0,5% раствор Zoletil 50 с 1% раствором гидрохлорида ксилазина в соотношении 1:1.
2. Обезболите мышей.
   1. Проверьте и запишите вес тела мыши. Вводят смесь анестетиков путем внутрибрюшинного введения в дозе 5 мл/кг массы тела (2,5 мг/мл Золетил 50; 5 мг/мл ксилазина гидрохлорида). Начало анестезии обычно происходит в течение 5-10 минут после инъекции, о чем свидетельствует потеря выпрямляющего рефлекса и снижение реакции на внешние раздражители.
   2. Перенесите мышь на операционный стол. Закрепите конечности с помощью скотча. Вводите 2,5 ЕД/г гепарина внутрибрюшинно для достижения гепаринизации.
   3. С помощью электробритвы подстригите шерсть на коже живота и продезинфицируйте участок раствором повидон-йода.
3. Провести катетеризацию воротной вены.
   1. Сделайте продольный разрез на 4 см от нижней части живота в сторону мечевидного отростка по средней линии живота. Аккуратно разрежьте брюшину ножницами, чтобы не повредить висцеральные органы. Вставьте брюшной ретрактор мыши, чтобы обнажить операционное поле.
   2. Сдвиньте кишечник вправо, чтобы открыть воротную вену, правую почку и нижнюю полую вену (рисунок 2A). С помощью артериальных щипцов зажмите полую вену у верхнего края почки.
   3. Изолируйте воротную вену (рис. 2A) и перевяжите дистальный конец шелковым швом 6-0. Неплотно завяжите еще один шов на проксимальном конце оголенного сосуда.
   4. Сделайте надрез возле перевязанного конца пружинными ножницами и вставьте катетер. Продвигайте катетер через разрез до уровня бифуркации портала.
   5. Закрепите обе лигатуры вокруг катетера и подтвердите правильность забора проб, подключив свободный конец катетера к шприцу для забора проб. Промойте гепаринизированным физиологическим раствором и зажмите катетер (рисунок 2C).
   6. Снимите тракционное устройство и внушите кишечник. Накройте операционную область стерильной марлей, пропитанной солевым раствором, или ватой.
4. Провести катетеризацию надпеченочной нижней полой вены.
   1. Сделайте разрез вдоль грудины из мечевидного отростка, обнажая грудину.
   2. Вертикально разрежьте грудину и прорежьте диафрагму по краю ребра, чтобы обнажить грудную полость.
   3. Обнажите и изолируйте надпеченочную нижнюю полую вену (рис. 2B). Аккуратно перевязайте дистальный конец шелковым швом 6-0. Неплотно завяжите еще один шов на проксимальном конце сосуда.
   4. Сделайте разрез чуть ниже перевязанного конца пружинными ножницами и вставьте катетер длиной 10 см. Продвигайте катетер до тех пор, пока кончик катетера не приблизится к печени, и надежно завяжите обе лигатуры. Подтвердите правильность отбора проб и зажмите свободный конец катетера (рисунок 2D).
   5. Промойте операционную область солевым раствором. Накройте поверхность стерильной марлей, пропитанной солевым раствором.

3. Перфузия печени

1. Усыпьте мышь с помощью передозировки анестетика и торакотомии в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу за животными и их использованию, гарантируя, что все процедуры выполняются таким образом, чтобы свести к минимуму страдания.
2. Настройте систему перфузии печени, которая включает в себя оксигенатор, устройство модуляции температуры, инфузионный насос и инфузионные трубки, как показано на рисунке 1.
3. Обеспечивают непрерывный поток газа 95% кислорода и 5% углекислого газа в оксигенатор.
4. Включите водяную баню и прогрейте комнату органа до 37 °C.
5. Приготовьте перфузионный буфер KRBH с инсулином и без него. Загрунтуйте систему трубок с перфузионным буфером, инкубированным в водяной бане при температуре 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: KRBH не содержит BSA и глюкозы. Перфузионный буфер KRBH без человеческого инсулина содержит 5,0 ммоль/л глюкозы и 0,25% BSA, в то время как перфузионный буфер KRBH с человеческим инсулином содержит 5,0 ммоль/л глюкозы, 0,25% BSA и 4,0 нг/мл человеческого инсулина.
6. Поместите мышь в контейнер с температурой окружающей среды, поддерживаемой на уровне около 37 °C. Используйте греющую подушечку, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37 °C.
7. Введите буфер KRBH через катетер воротной вены. Установите скорость инфузии на уровне 0,2 мл/мин с помощью мини-помпы.
8. Обратите внимание, что печень бледнеет в течение нескольких секунд, что указывает на то, что перфузионный буфер протекает через печень. Чтобы вымыть больше оставшихся клеток крови в печени, приостановите инфузию на 1 минуту через 4 и 8 минут, начав время с начала перфузии.
9. Перфузируйте печень буфером KRBH в течение 10 минут (без учета двух пауз по 1 минуте), что соответствует периоду равновесия. Соберите базальный образец из катетера нижней полой вены.
10. Перфузируйте печень тем же раствором, обогащенным инсулином (4,0 нг/мл человеческого инсулина) еще на 30 мин.
11. Отбирайте все образцы из нижней полой вены каждые 2 минуты.
12. Запишите вес печени после перфузии. Соберите образцы печени из разных долей, сразу заморозьте их в жидком азоте, а затем перенесите на хранение при температуре -80 °C.
13. Центрифугируйте все собранные образцы перфузии при температуре ~1 000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость и перенесите их на хранение при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация инсулина в образцах перфузии измеряется с помощью наборов иммуноферментного анализа человека (ИФА).
14. После процедуры убедитесь, что все биологические отходы утилизированы в соответствии с правилами безопасности.

4. Анализ данных

1. Представьте данные в виде графиков XY, показывающих выход концентрации инсулина с течением времени.
2. Рассчитайте среднюю скорость клиренса печеночного инсулина (HICR_AVE) по следующей формуле:
   HICR_AVE = (1−C_f/C_i) × 100%
   где C_i = начальная концентрация инсулина в инфузионном буфере, C_f = конечная средняя концентрация инсулина за последние 10 мин из надпеченочной нижней полой вены.

Результаты

В этом протоколе описана процедура инфузии печени для непосредственного расчета клиренса печеночного инсулина. Эта модель надежна и воспроизводима. Пример результатов, полученных в результате эксперимента, показан на рисунке 3. После 10-минутного пер?...

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
Описанные выше хирургические процедуры должны выполняться с бережной осторожностью, чтобы избежать образования каких-либо повреждений в печени. Кроме того, хрупкая структура стенки сосуда вены печени делает его уязвимым для п...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
60% high-fat diet	Research Diets, USA	D12492
Alanine aminotransferase Assay Kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C009-2-1
Anhydrous Glucose	Sangon Biotech	50-99-7	500 G
Aspartate aminotransferase Assay Kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C010-2-1
Bovine Serum Albumin	GeminiBio	700-107P	Fatty Acid-Free
Contour TS Blood Glucose Meter	Bayer	PH220800019
Contour TS Blood Glucose Test Strips	Bayer	DP38M3F05A
Heparin Sodium	Changzhou Qian hong Bio-pharma	H32022088	12500 U/2mL
Human insulin	Novo Nordisk	S20191007	300 U/3mL
Human insulin immunoassay kit	Ezassay Biotechnology	HM200
KRBH buffer (Sugar, BSA free)	coolaber	SL65501	500 mL
Membrane oxygenator	Xi'an Xijing Medical Appliance	5
Microscopic scissors	Shanghai Jinzhong	YBC020
Micro-serrefine clamp	Ningbo Medical Needle	180709
Microsurgery forceps	Shanghai Jinzhong	WA3010, WA3020
Needle type filter	N-buliv	LG05-133-2
Povidone-iodine Solution	Shanghai likang Disinfectant Hi-Tech	20231016J
pump 11 Elite	Harvard Apparatus	PC5 70-4500
Retractor	Globalebio (Beijing) Technology	GEKK-10mm	10 mm
Silicone Tubing	scientific commodities	#BB518-12	0.31 mm × 0.64 mm
Silicone Tubing	Fisher Scientific	#11-189-15A	ID 0.5 mm
Sodium Chloride Injection	Baxter	S2402023	4.5 g/500 mL
Surgical silk suture	Yangzhou Huanyu Medical Equipment	6-0
Temperature modulation	Xi'an Xijing Medical Appliance	6
Thermostatic water bath	Jiaxing Junsi Electronics	HIH-1	220 V 50 HZ
Three-way Joint	YISAI	AQTCY1.6	ID 0.4 mm
Xylazine Hydrochloride Injection	ShengXin	20240106	200 mg/2mL
Zoletil 50	Virbac	WK001	250 mg/5mL