Technik zur intranasalen Verabreichung von α-Synuclein-Aggregaten

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur intranasalen Verabreichung von α-Synuclein-Aggregaten. Diese Methode gibt Aufschluss über die α-Synuclein-Ausbreitung von der Riechschleimhaut zum Riechkolben bei der Parkinson-Krankheit.

Zusammenfassung

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die durch das Vorhandensein von Lewy-Körperchen gekennzeichnet ist, bei denen es sich um Aggregate von α-Synuclein (α-Syn) handelt. Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass sich die Krankheit durch die prionenartige Vermehrung von α-Syn-Aggregaten aus dem Riechkolben (OB) oder dem dorsalen Kern des Vagusnervs entwickelt und fortschreitet. Obwohl der Ursprung der α-Syn-Aggregate im OB unklar bleibt, wurde ihre Vermehrung aus der Riechschleimhaut in jüngster Zeit vermutet. Wir haben bereits gezeigt, dass die intranasale Verabreichung von α-Syn-Aggregaten in einem Mausmodell eine α-Syn-Pathologie im OB von Mäusen induziert. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur intranasalen Verabreichung von α-Syn-Aggregaten vor, die eine α-Syn-Pathologie im OB von Mäusen induzierte. Die intranasale Verabreichung von α-Syn-Aggregaten ist eine sehr einfache und unkomplizierte Methode, und wir glauben, dass sie ein nützliches Werkzeug in der Forschung sein wird, um den Ursprung der α-Syn-Pathologie im OB und den Weg der α-Syn-Ausbreitung durch das olfaktorische System aufzuklären.

Einleitung

Die Parkinson-Krankheit (PD), die durch motorische Symptome wie Bradykinesie, Ruhezittern und Muskelsteifigkeit gekennzeichnet ist, ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung¹. Parkinson zeigt auch nicht-motorische Symptome, einschließlich olfaktorischer Dysfunktion, kognitiver Beeinträchtigung, Depressionen, Halluzinationen, Verstopfung und orthostatischer Hypotonie. Seine pathologischen Kennzeichen sind der dopaminerge Zelltod in der Substantia nigra und das Vorhandensein von α-Synuclein (α-Syn)-Aggregaten, den sogenannten Lewy-Körperchen².

Bemerkenswert ist, dass α-Syn ein Protein mit 140 Aminosäuren ist, das unter normalen Bedingungen in Form eines löslichen Monomers (oder Tetramers) vorliegt. Unter abnormalen Bedingungen wird das lösliche Monomer jedoch in unlösliche hochmolekulare Aggregate, einschließlich Oligomere und Fibrillen, umgewandelt. Der Übergang von α-Syn in Oligomere und Fibrillen ist Berichten zufolge an der zellulären Toxizität beteiligt³.

Neuere Studien deuten auf die Prionen-ähnliche Ausbreitung von α-Syn-Aggregaten zwischen Neuronen hin. Basierend auf zahlreichen postmortalen Untersuchungen stellten Braak et al. im Jahr 2003 die Hypothese auf, dass sich die Lewy-Körperchen-Pathologie progressiv und in einer etwas stereotypen Weise im Gehirn ausbreitet (Braak-Hypothese)^4,5. Im Jahr 2008 ergab die postmortale Untersuchung von Patienten mit Parkinson, die eine fetale Mittelhirntransplantation erhielten, Lewy-Körperchen in dopaminergen Neuronen, die aus fötalem Gewebe stammten ^6,7. Diese Studien deuteten darauf hin, dass sich α-Syn-Aggregate vom erkrankten Gehirn auf die Transplantate ausbreiten könnten, was Braaks Hypothese unterstützt.

Nach diesen Beobachtungen haben Experimente mit primären neuronalen Kulturen und intrazerebraler Injektion von α-Syn-Aggregaten in Mäusen die Ausbreitung von Lewy-Körper-ähnlichen Aggregaten reproduziert, was einen weiteren Beweis für die α-Syn-Ausbreitung in prionenähnlicher Weise liefert ^8,9.

Braak et al. zeigten, dass die Lewy-Körperchen-Pathologie bei Parkinson im Riechkolben (OB) und/oder im dorsalen Kern des Vagusnervs (dmX) ^beginnt4. Basierend auf Braaks Hypothese haben mehrere Studien über die Verabreichung von α-Syn-Aggregaten oder Lewy-Körper-Extrakten aus Parkinson-Gehirnen in den OB und den Magen-Darm-Trakt von Versuchstieren berichtet 10,11,12. Im Jahr 2018 zeigte eine Studie, dass die Verabreichung von α-Syn-Aggregaten in den OB von Wildtyp-Mäusen die Ausbreitung der α-Syn-Pathologie entlang des Geruchswegs induzierte, was zu einer olfaktorischen Dysfunktion führte¹³. Wir haben zuvor α-Syn-Aggregate in den OB von α-Syn-transgenen Mäusen inokuliert und festgestellt, dass dies zu Hippocampus-Atrophie und Gedächtnisstörungen führte¹⁴.

Im Jahr 2022 impften wir α-Syn-Aggregate in den OB von Weißbüschelaffen, einem kleinen nicht-menschlichen Primaten; Dies führte zur Ausbreitung der α-Syn-Pathologie entlang des Geruchswegs, zur OB-Atrophie und zum weit verbreiteten zerebralen Glukose-Hypometabolismus¹⁰.

Erfolgt die Ausbreitung von α-Syn-Aggregaten jedoch aus dem OB, stellt sich eine kritische Frage: Durch welchen Mechanismus entstehen α-Syn-Aggregate erstmals? Saito et al. berichteten bereits über das Vorhandensein von Lewy-Körperchen in der Nasenschleimhaut¹⁵. Das Vorhandensein von α-Syn-Aggregaten wurde in der Nasenschleimhaut von Patienten mit Parkinson und Multisystematrophie (MSA) mittels Echtzeit-Quaking-induzierter Konversion (RT-QUIC) nachgewiesen¹⁶. Bemerkenswert ist, dass die Analyse von Nasenschleimhautproben von Patienten mit Rapid Eye Movement Sleep Behavior Disorder (RBD), die als Prodromalstadium der Parkinson-Krankheit gilt, einen Anstieg der α-Syn-Spiegel^{ergab 17}. Diese Studie deutete darauf hin, dass eine α-Syn-Pathologie in der Nasenschleimhaut auch ab der Prodromalphase der Parkinson-Krankheit existieren könnte.

Während diese Ergebnisse auf einen möglichen Weg von der Nasenschleimhaut zum Geburtshelfer hindeuteten, gab es nur begrenzte experimentelle Beweise, die dieses Szenario unterstützen. Um diese Lücke zu schließen, verabreichten wir α-Syn-Aggregate in die Nasenhöhle von Mäusen und untersuchten die Ausbreitung der α-Syn-Pathologie von der Nasenschleimhaut in den OB. Unser experimenteller Ansatz zeigte, dass eine intranasale Verabreichung von α-Syn-Aggregaten in Wildtyp-Mäusen eine α-Syn-Pathologie im OB induzierte, was einen experimentellen Beweis für den Ausbreitungsweg von der Nasenschleimhaut zum OB lieferte.

Protokoll

Für diese Studie wurden männliche Mäuse von C57BL/6J im Alter von 2 Monaten verwendet. Alle experimentellen Verfahren wurden nach nationalen Richtlinien durchgeführt. Das Tierforschungskomitee der Universität Kyoto erteilte die ethische Genehmigung und Erlaubnis für diese Studie (MedKyo 23,544).

1. Intranasale Verabreichung von α-Syn-vorgeformten Fibrillen

1. Bereiten Sie Maus-α-Syn-Fibrillenlösung in PBS (4 mg/ml) gemäß den zuvor berichteten Methoden¹¹ vor. Wickeln Sie die Tube mit einer transparenten Folie ein, um eine Kontamination zu vermeiden.
2. Beschallung von 200 μl α-Syn-Fibrillenlösung, um vorgeformte Fibrillen (PFFs) von α-Syn mit einem Wasserbad-Ultraschallgerät zu erzeugen (Materialtabelle). Füllen Sie das Ultraschallbad mit Wasser und fügen Sie Eiswürfel hinzu, um sie für die Beschallung auf 4 °C abzukühlen. Beschallung der Fibrillen für insgesamt 5 Minuten, wobei jeder Zyklus aus 30 s Beschallung besteht, gefolgt von einem 30 s Intervall (insgesamt fünf Zyklen).
   HINWEIS: Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung wie Einweghandschuhe, Maske und Schutzbrille, um die Exposition von α-Syn zu verhindern.
3. Bereiten Sie eine P10-Pipette (Materialtabelle) mit einer 10-μl-Pipettenspitze vor. Anästhesieren Sie jede Maus mit einer Kombination aus Medetomidinhydrochlorid, Midazolam und Butorphanol (MMB) durch intraperitoneale (i.p.) Injektion. Das MMB-Kombinationsanästhetikum enthielt Midazolam (0,3 mg/kg), Medetomidin (4 mg/kg) und Butorphanoltartrat (5 mg/kg). Verwenden Sie 0,005 ml/g durch i.p. Injektion, wenn Sie Midazolam (1 mg/ml) 0,3 ml, Medetomidin (5 mg/ml) 0,8 ml, Butorphanoltartrat (5 mg/ml) 1 ml und Kochsalzlösung 2,9 ml mischen.
4. Warten Sie 10 Minuten, um sicherzustellen, dass die Mäuse vollständig betäubt wurden. Eine korrekte Anästhesie kann bestätigt werden, wenn sich die Maus in der Seitenlage befindet und sich nicht aufrichten kann. Tragen Sie nach der Betäubung eine Augensalbe mit einem sterilen Baumwollapplikator auf, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.
   HINWEIS: Ohne Anästhesie ist es bei der Verabreichung nasaler Dosen schwierig, die Mäuse in Rückenlage zu halten und α-Syn-Lösung richtig zu verabreichen, wenn die Mäuse niesen. Aus diesen Gründen war eine Sedierung notwendig.
5. Platzieren Sie die betäubte Maus in Rückenlage. Legen Sie ein Papiertuch oder ähnliches Material unter den Körper und achten Sie darauf, dass der Kopf leicht nach unten geneigt ist (Abbildung 1A,B). Diese Positionierung verhindert, dass die verabreichte α-Syn-Lösung schnell in die Lunge oder die Speiseröhre fließt, was die Retention in der Nasenhöhle erleichtert. Die Nasenlöcher sind in Abbildung 1C zu sehen.
6. Ziehen Sie 1 μl α-Syn-Lösung (4 mg/ml) in eine P10-Pipette und platzieren Sie die Pipettenspitze in der Nähe der Nase der Maus. Formen Sie langsam einen runden Tropfen und halten Sie ihn am Ende der Pipettenspitze (Abbildung 1D, roter Pfeil). Die intranasale Verabreichung erfolgt für das einseitige Nasenloch, verwenden Sie die kontralaterale Seite als Kontrollseite.
7. Bringen Sie den Tropfen in die Nähe einer Seite der Nasenlöcher der Maus und lassen Sie die Maus ihn auf natürliche Weise einatmen. Beobachten Sie die Inhalation und warten Sie 30 s bis 1 min (Abbildung 1E).
8. Wiederholen Sie die Schritte 1.6.-1.7. bis ein Gesamtvolumen von 20 μl α-Syn-Lösung verabreicht wird. Entsorgen Sie nach allen Eingriffen die Handschuhe und wischen Sie eine Bank mit handelsüblichen Reinigungsmitteln ab, wenn die Oberfläche mit α-Syn verunreinigt ist
   HINWEIS: Der gesamte Eingriff sollte in einer Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, um das Einatmen von α-Syn-Fibrillen durch das Personal, das den Eingriff durchführt, zu verhindern. Ein früherer Bericht hat gezeigt, dass das Volumen von 25 μl am effizientesten für die Verabreichung von Medikamenten von der Nase zum Gehirn ist¹⁸. Wir verwenden in der vorliegenden Studie ein ähnliches Volumen von 20 μL. Wir verwenden auch die gleiche Konzentration von PFFs wie für die Injektion in den OB im vorherigen Bericht¹⁰, die nahe an den 400 μM (5,6 mg/ml) von PFFs¹⁹ liegt.
9. Verabreichen Sie Atipamezol (3 mg/kg; Tabelle der Materialien) durch IP-Injektion zur Umkehrung von Medetomidin und zur Erleichterung der Genesung. Verwenden Sie 0,005 ml/g durch i.p. Injektion, wenn Sie Atipamezol (5 mg/ml) 0,6 mL und Kochsalzlösung 4,4 mL mischen.
   HINWEIS: Geben Sie Analgesie, da nicht vollständig verstanden wird, wie belastend die intranasale Verabreichung von α-Syn wäre.
10. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Bringen Sie die Maus nach vollständiger Wiederherstellung wieder in den Käfig zurück.

2. Vorbereitung der Probe

1. Die behandelten Mäuse wurden 1, 3, 6 und 12 Monate nach intranasaler Verabreichung von α-Syn-vorgeformten Fibrillen getötet.
   1. Legen Sie die Mäuse in die Induktionsbox, verabreichen Sie Sevofluran (>6,5%) und fahren Sie fort, bis > 60 s lang ein Atemstillstand auftritt. Entfernen Sie die Mäuse und führen Sie eine schnelle Exsanguination durch rechtsatrialen Schnitt durch, um die Euthanasie zu gewährleisten.
2. Führen Sie eine 25G-Nadel (Table of Materials) in die Spitze des Herzens ein. Perfusionieren Sie die Maus bei 4 ml/min mit 15 mL PBS und dann 15 mL 4 % PFA in PBS.
3. Schneiden Sie den Kopf mit einer Schere ab und machen Sie mit einem Skalpell einen 2 cm langen Schnitt in die Kopfhaut. Schneiden Sie den Schädelknochen mit einer Schere an der lateralen Seite von unten bis zur Nase ein (Abbildung 2A,B). Um die OBs zu erhalten, entfernen Sie den Schädelknochen an den OBs vollständig (Abbildung 2B, gelber Kreis).
4. Drehen Sie den Kopf um, durchtrennen Sie die Hirnnerven und entfernen Sie dann vorsichtig mit einer Pinzette das Gehirn (Abbildung 2C, D). Erhalten Sie das Gehirn mit intakten OBs (Abbildung 2E). Um die intakten OBs zu erhalten, schneiden Sie die Riechnerven vorsichtig mit einer Pinzette durch, während die OBs am Schädelknochen ansetzen (Abbildung 2D, gelber Kreis).
5. Die Gehirnproben werden über Nacht bei 4 °C in das 4%ige PFA in PBS gegeben. Lassen Sie die Gehirnproben nicht länger als 24 Stunden stehen.
   HINWEIS: Eine übermäßige Fixierung verringert die immunhistochemische Färbung. Wenn eine Langzeitlagerung erforderlich ist, bewahren Sie Gehirnproben in 70 % Ethanol oder PBS mit 0,1 % Natriumazid auf, um die Sterilität zu erhalten.

3. Immunhistochemische Färbung des OB

1. Paraffinisieren Sie die Proben mit einem automatischen Gewebeprozessor (Materialtabelle), wie unten beschrieben.
   1. 120 min in 70% Ethanol eintauchen, anschließend 60 min lang 8x in 100% Ethanol eintauchen. Dann 3x für 120 min in 100% Xylol tauchen.
   2. 120 min lang bei 60 °C in Paraffin tauchen, anschließend 240 min bei 60 °C in Paraffin eintauchen.
2. Betten Sie die Proben wie unten beschrieben in Paraffin ein.
   1. Betten Sie die Proben bei 60 °C mit einem modularen Gewebeeinbettungszentrum in Paraffin ein (Table of Materials). Kühle sie auf Eis ab.
3. Schneiden Sie die Proben mit einem Mikrotom in 8 μm dicke Abschnitte (Table of Materials)¹⁸.
4. Führen Sie die Entparaffinierung wie unten beschrieben durch.
   1. 2x für 5 min in 100% Xylol tauchen, anschließend 2x für 3 min in 100% Ethanol tauchen.
   2. 3 Minuten lang in 70%iges Ethanol eintauchen. 3 Min. in PBS waschen.
5. Führen Sie die Antigen-Entnahme wie unten beschrieben durch.
   1. 15 min in 100%ige Ameisensäure tauchen. 2 Min. in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) spülen.
   2. Autoklav bei 120 °C für 10 min. Lassen Sie es natürlich abkühlen.
6. Tauchen Sie 10 min lang in 1% Wasserstoffperoxid in Methanol. 5 Min. in PBS waschen.
7. Geben Sie 500 μl 5%ige Magermilch in PBS auf die Objektträger und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
8. Geben Sie die 500 μL antiphosphorylierten α-Syn-Antikörper (p-α-Syn, 1/10000) in PBS auf die Objektträger und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C. 2x mit PBS für je 5 min waschen.
9. Inkubieren Sie mit einem universellen Immunperoxidase-Polymer, Anti-Kaninchen (Materialtabelle) für 1 h bei 25 °C. 2x mit PBS für je 5 min waschen.
10. Entwickeln Sie mit dem 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Färbekit (Materialtabelle) für 5 Minuten gemäß den Anweisungen des Herstellers.
11. 1 Minute lang in Hämatoxylinlösung eintauchen (Materialtabelle). Unter fließendem Wasser 10 min entfärben.
12. Führen Sie die Montage wie unten beschrieben durch.
    1. 5 Minuten lang in 70%iges Ethanol eintauchen. 2x für 5 min in 100% Ethanol tauchen.
    2. 2x für 5 min in 100% Xylol tauchen. Montieren Sie mit einem Einbettungsmedium (Materialtabelle). Tragen Sie die 100 μl eines Einbettmediums auf die Objektträger auf und bedecken Sie sie mit einem Glasdeckglas.
13. Nehmen Sie Bilder mit einem All-in-One-Mikroskop mit 20- und 40-facher Vergrößerung auf (Materialtabelle).

Ergebnisse

Abbildung 3 zeigt mehrere Beispiele für α-Syn-Aggregate im OB. In der vorliegenden Studie haben wir α-Syn-Aggregate in das einseitige Nasenloch verabreicht. Die beiden Nasenhöhlen sind durch die Nasenscheidewand getrennt, und jeder OB projiziert die olfaktorischen sensorischen Neuronen separat in jede Nasenhöhle. Daher kann der OB auf der kontralateralen Seite als Kontrolle verwendet werden.

Eine P-α-Syn-Pathologie wurde im ...

Diskussion

In einer früheren Studie führte die Verabreichung von α-Syn-Aggregaten in die Nasenhöhle von Makaken zum Absterben dopaminerger Zellen und zur Eisenablagerung in der Substantia nigra, obwohl keine α-Syn-Aggregate beobachtet wurden²¹. Es wurde berichtet, dass die tägliche Verabreichung von humanen A53T-α-Syn-Aggregaten in die Nasenhöhle von transgenen Mäusen mit Prionen-Promotor α-Syn (M83-Mäusen) über einen Zeitraum von 28 Tagen eine α-Syn-Pathologie ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710	KEYENCE	N/A	All-in-One microscope
Ampicillin Sodium Salt	Nacalai tesque	02739-32
Bioruptor II	Sonicbio	BR2006A	Water bath type sonicator.
Butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	WAK-52850
Cellulose tube	MISUMI	UC20-32-100
DeepWellMaximizer	TAITEC	MBR-022UP	Shaker
DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)	BioDynamics Laboratory Inc.	DS255	Competent cell
Entellan	Sigma-Aldrich	107961	Rapid mounting medium for microscopy
Graefe Extra Fine Forceps Curved Serrated	FST	11152-10	forceps
Hardened Fine Scissors	FST	14090-09	scissors
Histofine Simple stain mouse MAX-PO (R)	Nichirei Bioscience	414341	Universal Immuno-peroxidase Polymer, anti-Rabbit
ImageJ ver 1.52p	NA	NA	https://imagej.net/
innova4200	New Brunswick scientific	9105085	Incubator shaker
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside	Nacalai tesque	19742-94
LB broth, Lennox	Nacalai tesque	20066-24
Leica EG 1150 H	Leica	14 0388 86 108	Modular Tissue Embedding Center
Leica TP 1020	Leica	14 0422 85108	Automatic Tissue Processor
Medetomidine	Fuji Film	135-17473
Microm HM325 Rotary Microtome	Thermo Scientific	902100
Midazolam	Maruishi Seiyaku	4987-211-76210-0
New hematoxylin Type G	Muto	65-9197-38	Hematoxylin solution
Normal winged needle for vein D type, 25G	TERUMO	NN2332R	25G needle
Optima TLX Ultracentrifuge	Beckman Couler	8043-30-1197	Ultracentrifuge
P10 pipette	Gilson	FA10002P
Paraffin	Leica	39601095
paraformaldehyde	Nacalai tesque	30525-89-4
Peroxidase Stain DAB Kit	Nacalai tesque	25985-50
Pirece BCA Protein Assay Kits	Thermo Scientific	23225	BCA assay
pRK172	Addgene	#134504	Plasmid
Q-Sepharose Fast Flow.	cytiva	17051001	Ion exchange resin