α-Synuclein 응집체의 비강 내 투여 기법

요약

본 프로토콜은 α-synuclein 응집체의 비강 내 투여 방법을 설명합니다. 이 방법은 파킨슨병에서 후각 점막에서 후각구까지 α-synuclein 전파에 대한 통찰력을 제공합니다.

초록

파킨슨병(PD)은 α-시누클레인(α-Syn)의 응집체인 루이소체(Lewy bodies)의 존재를 특징으로 하는 신경퇴행성 질환입니다. 최근에는 미주신경의 등핵(oabal nucleus 또는 olfactory bulb)에서 α-Syn 응집체의 프리온(prion)과 같은 증식을 통해 발병하고 진행하는 것으로 제안되었습니다. 산부인과에서 α-Syn 응집체의 기원은 불분명하지만, 후각 점막에서 전파되는 것으로 최근 제안되었습니다. 우리는 이전에 마우스 모델에서 α-Syn 응집체의 비강 내 투여가 마우스의 OB에서 α-Syn 병리학을 유발한다는 것을 보여주었습니다. 본 연구에서는 생쥐의 산부인과에서 α-Syn 병리를 유발한 α-Syn 응집체의 비강 내 투여 방법을 제시한다. α-Syn 응집체의 비강 내 투여는 매우 간단하고 간단한 방법이며, 산부인과에서 α-Syn 병리의 기원과 후각계를 통한 α-Syn 증식 경로를 규명하는 연구에 유용한 도구가 될 것이라고 생각합니다.

서문

파킨슨병(PD)은 서동증, 안정시 떨림, 근육 경직과 같은 운동 증상을 특징으로 하며, 두 번째로 흔한 신경퇴행성 질환이다¹. 파킨슨병은 또한 후각 기능 장애, 인지 장애, 우울증, 환각, 변비 및 기립성 저혈압을 포함한 비운동 증상을 나타냅니다. 그것의 병리학적인 특징은 substantia nigra에 있는 도파민 세포 죽음 및 Lewy 몸에게 불린 α-synuclein (α-Syn) 응집체의 존재입니다².

참고로, α-Syn은 정상적인 조건에서 용해성 단량체(또는 사량체) 형태로 존재하는 140-아미노산 단백질입니다. 그러나 비정상적인 조건에서 용해성 단량체는 올리고머 및 피브릴을 포함하는 불용성 고분자량 응집체로 전환됩니다. α-Syn이 올리고머와 피브릴로 전환되는 것은 세포 독성에 관여하는 것으로 보고되었습니다³.

최근 연구에서는 뉴런 사이의 α-Syn 응집체의 프리온과 유사한 전파를 제안했습니다. 2003년 Braak 등은 수많은 사후 검시를 바탕으로 루이소체 병리학이 다소 정형화된 방식으로 뇌에서 점진적으로 퍼진다는 가설을 제안했습니다(Braak의 가설)^4,5. 2008년, 태아 중뇌 이식을 받은 PD 환자에 대한 사후 검사에서 태아 조직에서 유래한 도파민 뉴런에서 루이소체가 발견되었습니다 ^6,7. 이 연구는 α-Syn 응집체가 병든 뇌에서 이식편으로 퍼질 수 있음을 시사하여 Braak의 가설을 뒷받침했습니다.

이러한 관찰에 이어, 1차 신경 세포 배양 및 마우스에서 α-Syn 응집체의 뇌내 주입과 관련된 실험은 Lewy body와 같은 응집체의 확산을 재현하여 프리온과 같은 방식으로 α-Syn 증식에 대한 추가 증거를 제공했습니다 ^8,9.

Braak 등은 PD의 루이소체 병리학이 후각구(OB) 및/또는 미주신경(dmX)의 등핵에서 시작된다는 것을 보여주었습니다⁴. Braak의 가설에 기초하여, 여러 연구에서 PD 뇌의 α-Syn 응집체 또는 루이소체 추출물을 실험 동물의 산부인과 및 위장관으로 투여한다고 보고했습니다 10,11,12. 2018년 한 연구에서는 야생형 마우스의 산부인과에 α-Syn 응집체를 투여하면 후각 경로를 따라 α-Syn 병리학이 증식되어 후각 기능 장애를 유발한다는 사실이 밝혀졌습니다¹³. 우리는 이전에 α-Syn 응집체를 α-Syn 형질전환 마우스의 OB에 접종한 결과 이것이 해마 위축과 기억 장애를 유발한다는 것을 발견했습니다¹⁴.

2022년, 우리는 인간이 아닌 작은 영장류인 마모셋(marmosets)의 OB에 α-Syn 응집체를 접종했습니다. 그 결과 후각 경로를 따라 α-Syn 병리학이 전파되고, 산과 위축이 발생하며, 대뇌 포도당 대사 저하가 광범위하게 발생했다¹⁰.

그러나 α-Syn 응집체의 전파가 OB에서 발생하는 경우 중요한 질문이 발생합니다. α-Syn 응집체는 처음에 어떤 메커니즘에 의해 나타나는가? Saito 등은 이전에 코 점막에서 루이소체(Lewy body)의 존재를 보고했다¹⁵. PD 및 다발성 시스템 위축(MSA) 환자의 코 점막에서 실시간 떨림 유도 변환(RT-QUIC) 분석을 사용하여 α-Syn 응집체의 존재를 감지했습니다¹⁶. 특히, 파킨슨병 전구 단계로 간주되는 급속 안구 운동 수면 행동 장애(RBD) 환자의 코 점막 샘플을 분석한 결과, α-Syn 수치가 증가한 것으로 나타났습니다¹⁷. 이 연구는 α-Syn 병리학이 PD의 전구기에서도 코 점막에 존재할 수 있음을 시사했습니다.

이러한 발견은 코 점막에서 산부인과로 가는 잠재적인 경로를 시사했지만, 이 시나리오를 뒷받침하는 실험적 증거는 제한적이었습니다. 이 간극을 해소하기 위해 α-Syn 응집체를 마우스의 비강에 투여하고 α-Syn 병리학이 코 점막에서 산부인과로 전파되는 것을 조사했습니다. 우리의 실험적 접근 방식은 야생형 마우스에서 α-Syn 응집체의 단일 용량 비강 내 투여가 OB에서 α-Syn 병리학을 유발하여 코 점막에서 OB로의 증식 경로에 대한 실험적 증거를 제공한다는 것을 입증했습니다.

프로토콜

본 연구에는 생후 2개월 된 C57BL/6J 수컷 마우스를 사용하였다. 모든 실험 절차는 국가 지침에 따라 수행되었습니다. 교토 대학의 동물 연구위원회는 이 연구에 대한 윤리적 승인과 허가를 내렸습니다(MedKyo 23,544).

1. α-Syn 미리 형성된 원섬유의 비강 내 투여

1. 이전에 보고된 방법¹¹에 따라 PBS(4mg/mL)에서 마우스 α-Syn 피브릴 용액을 준비합니다. 오염을 방지하기 위해 튜브를 투명 필름으로 감쌉니다.
2. 수조형 초음파 처리기를 사용하여 α-Syn 예비형성된 원섬유(PFF)를 생성하기 위해 200μL의 α-Syn 피브릴 용액을 초음파 처리합니다(재료 표). 초음파 수조에 물을 채우고 얼음 조각을 넣어 초음파 처리를 위해 4 ° C로 식히십시오. 총 5 분 동안 원섬유를 초음파 처리 각 사이클은 30 초의 초음파 처리 후 30 초 간격 (총 5 사이클)으로 구성됩니다.
   알림: 일회용 장갑, 마스크, 보안경과 같은 개인 보호 장비를 사용하여 α-Syn에 노출되지 않도록 하십시오.
3. 10 μL 피펫 팁이 있는 P10 피펫(Table of Materials)을 준비합니다. 복강내(i.p.) 주사로 메데토미딘 하이드로클로라이드, 미다졸람 및 부토르파놀(MMB)의 조합을 사용하여 각 마우스를 마취합니다. MMB 복합 마취제에는 미다졸람(0.3mg/kg), 메데토미딘(4mg/kg) 및 부토르파놀 타르타르산염(5mg/kg)이 포함되어 있습니다. 미다졸람(1mg/mL) 0.3mL, 메데토미딘(5mg/mL) 0.8mL, 부토르판올 주석산염(5mg/mL) 1mL, 식염수 2.9mL를 혼합할 때 0.005mL/g을 i.p. 주사로 사용합니다.
4. 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 10분 동안 기다립니다. 적절한 마취는 마우스가 측면 누운 상태에 있고 스스로 바로설 수 없는 경우 확인할 수 있습니다. 마취가 끝나면 멸균 면 어플리케이터를 사용하여 안과 연고를 바르면 눈이 건조해지는 것을 방지합니다.
   참고: 마취가 없으면 비강을 투여할 때 생쥐를 누운 상태로 유지하고 생쥐가 재채기를 할 때 α-Syn 용액을 적절하게 투여하기 어렵습니다. 이러한 이유로 진정제가 필요했습니다.
5. 마취된 마우스를 누운 자세로 놓습니다. 종이 타월이나 이와 유사한 재료를 몸 아래에 놓고 머리가 약간 아래쪽으로 기울어지도록 합니다(그림 1A, B). 이러한 포지셔닝은 투여된 α-Syn 용액이 폐나 식도로 빠르게 흘러 들어가는 것을 방지하여 비강에 머무르는 것을 용이하게 합니다. 콧구멍은 그림 1C에서 볼 수 있습니다.
6. 1 μL의 α-Syn 용액(4 mg/mL)을 P10 피펫에 주입하고 피펫 팁을 마우스의 코 근처에 놓습니다. 천천히 둥근 방울을 형성하고 피펫 팁 끝에 유지합니다(그림 1D, 빨간색 화살표). 비강 내 투여는 편측성 콧구멍에 대해 수행되며 반대쪽 쪽을 대조측으로 사용합니다.
7. 방울을 마우스 콧구멍의 한쪽 면에 가까이 가져가 마우스가 자연스럽게 흡입할 수 있도록 합니다. 흡입을 관찰하고 30초에서 1분 동안 기다립니다(그림 1E).
8. 1.6.-1.7단계를 반복합니다. 총 부피 20μL의 α-Syn 용액이 투여될 때까지. 모든 절차가 끝나면 장갑을 버리고 표면이 α-Syn으로 오염된 경우 상업용 세제로 벤치를 닦으십시오.
   알림: 전체 절차는 절차를 수행하는 직원이 α-Syn 원섬유를 흡입하는 것을 방지하기 위해 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 이전 보고서에 따르면 25μL의 부피가 코에서 뇌로 약물 투여에 가장 효율적입니다¹⁸. 본 연구에서는 유사한 부피의 20μL를 사용합니다. 또한 이전 보고서¹⁰에서 OB에 주입할 때와 동일한 농도의 PFF를 사용하며, 이는 PFF¹⁹의 400μM(5.6mg/mL)에 가깝습니다.
9. 아티파메졸(3mg/kg; 재료 표) 메데토미딘을 역전시키고 회복을 촉진하기 위해 I.P. 주사로. 아티파메졸(5mg/mL) 0.6mL와 식염수 4.4mL를 혼합할 때 0.005mL/g을 ip. 주사로 사용합니다.
   참고: α-Syn의 비강 내 투여가 얼마나 스트레스가 많은지 완전히 이해되지 않았기 때문에 진통제를 제공하십시오.
10. 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. 완전히 회복된 후 마우스를 케이지로 되돌립니다.

2. 시료 준비

1. α-Syn preformed fibrils의 비강 내 투여 후 1, 3, 6 및 12개월에 처리된 마우스를 희생합니다.
   1. 마우스를 유도 상자에 넣고 세보플루란(>6.5%)을 투여하고 > 60초 동안 호흡 정지가 발생할 때까지 계속합니다. 쥐를 제거하고 안락사를 보장하기 위해 우심방 절개로 신속한 출혈을 수행합니다.
2. 25G 바늘(재료 표)을 심장 정점에 삽입합니다. 15mL의 PBS를 사용하여 4mL/분으로 마우스를 관류한 다음 PBS에 15mL의 4% PFA를 주입합니다.
3. 가위로 머리를 잘라내고 메스로 두피를 2cm 정도 절개한다. 가위로 두개골 뼈를 아래쪽에서 코까지 옆쪽으로 절개합니다(그림 2A, B). OB를 얻으려면 OB의 두개골 뼈를 완전히 제거합니다(그림 2B, 노란색 원).
4. 머리를 뒤집어 뇌 신경을 절단한 다음 집게로 조심스럽게 뇌를 제거합니다(그림 2C, D). OB가 손상되지 않은 뇌를 얻습니다(그림 2E). 온전한 OB를 얻으려면 OB가 두개골 뼈에 부착될 때 집게로 후각 신경을 조심스럽게 절단합니다(그림 2D, 노란색 원).
5. 뇌 샘플을 4% PFA에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 PBS에 넣습니다. 뇌 샘플을 24시간 이상 방치하지 마십시오.
   참고: 과도한 고정은 면역조직화학 염색을 감소시킵니다. 장기 보관이 필요한 경우 뇌 샘플을 0.1% 아지드화나트륨을 함유한 70% 에탄올 또는 PBS에 보관하여 무균 상태를 유지하십시오.

3. OB의 면역조직화학적 염색

1. 아래와 같이 자동 조직 처리기(Table of Materials)를 사용하여 샘플을 파라핀화합니다.
   1. 70% 에탄올에 120분 동안 담근 다음 100% 에탄올에 8배 60분 동안 담그십시오. 그런 다음 100% 자일렌에 3회 120분 동안 담급니다.
   2. 파라핀에 60°C에서 120분 동안 담근 다음 파라핀에 60°C에서 240분 동안 침지합니다.
2. 아래 설명된 대로 샘플을 파라핀에 삽입합니다.
   1. 모듈식 조직 포매 센터(Table of Materials)를 사용하여 60°C의 파라핀에 샘플을 삽입합니다. 얼음에 식히십시오.
3. 마이크로톰(Table of Materials)을 사용하여 샘플을 8μm 두께의 섹션으로 자릅니다¹⁸.
4. 아래와 같이 파라핀화를 수행합니다.
   1. 100% 자일렌에 2회 5분 동안 담근 다음 100% 에탄올에 2회 3분 동안 담그십시오.
   2. 70% 에탄올에 3분 동안 담그십시오. PBS에서 3분 동안 세척합니다.
5. 아래 설명된 대로 항원 회수를 수행합니다.
   1. 100% 포름산에 15분 동안 담급니다. 인산염 완충 식염수(PBS)로 2분 동안 헹굽니다.
   2. 120°C에서 10분 동안 오토클레이브 자연적으로 식히십시오.
6. 메탄올에 1% 과산화수소를 10분 동안 담가둡니다. PBS에서 5분 동안 세척합니다.
7. 슬라이드의 PBS에 5% 탈지유 500μL를 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
8. PBS에 500μL의 항인산화α-Syn 항체(p-α-Syn, 1/10000)를 슬라이드에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. PBS로 각각 5분 동안 2번 세탁합니다.
9. 범용 면역 과산화 효소 중합체, 안티 토끼 (재료 표)로 25 ° C에서 1 시간 동안 배양합니다. PBS로 각각 5분 동안 2번 세탁합니다.
10. 제조업체의 지침에 따라 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 염색 키트(재료 표)를 사용하여 5분 동안 현상합니다.
11. 헤마톡실린 용액에 1분 동안 담급니다(재료 표). 흐르는 물에 10분 동안 탈색합니다.
12. 아래 설명된 대로 장착을 수행합니다.
    1. 70% 에탄올에 5분 동안 담가둡니다. 100% 에탄올에 2회 5분 동안 담그십시오.
    2. 100% 자일렌에 5분 동안 2회 담그십시오. 임베딩 매체를 사용하여 장착합니다(Table of Materials). 100μL의 임베딩 매체를 슬라이드에 적용하고 유리 커버슬립으로 덮습니다.
13. All-in-One 현미경을 사용하여 20x 및 40x 배율로 이미지를 획득합니다(Table of Materials).

결과

그림 3은 OB에서 α-Syn 응집체의 몇 가지 예를 보여줍니다. 본 연구에서는 α-Syn 응집체를 편측 콧구멍에 투여했습니다. 두 개의 비강은 비중격에 의해 분리되어 있으며, 각 산부인과는 후각 감각 뉴런을 각 비강에 개별적으로 투영합니다. 따라서 반대쪽 OB를 대조군으로 사용할 수 있습니다.

P-α-Syn 병리는 1개월 및 3개월 후 치료 ?...

토론

이전 연구에서, 원숭이의 비강에 α-Syn 응집체를 투여하면 도파민 세포의 사멸과 흑질에 철의 침착이 유도되었지만, α-Syn 응집체는 관찰되지 않았다²¹. A53T 인간 α-Syn 응집체를 프리온 프로모터 α-Syn 형질전환 마우스(M83 마우스)의 비강에 28일 동안 매일 투여하면 마우스의 뇌에서 α-Syn 병리학이 유발되고 운동 증상이 유발되는 것으로 보고되었습니다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710	KEYENCE	N/A	All-in-One microscope
Ampicillin Sodium Salt	Nacalai tesque	02739-32
Bioruptor II	Sonicbio	BR2006A	Water bath type sonicator.
Butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	WAK-52850
Cellulose tube	MISUMI	UC20-32-100
DeepWellMaximizer	TAITEC	MBR-022UP	Shaker
DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)	BioDynamics Laboratory Inc.	DS255	Competent cell
Entellan	Sigma-Aldrich	107961	Rapid mounting medium for microscopy
Graefe Extra Fine Forceps Curved Serrated	FST	11152-10	forceps
Hardened Fine Scissors	FST	14090-09	scissors
Histofine Simple stain mouse MAX-PO (R)	Nichirei Bioscience	414341	Universal Immuno-peroxidase Polymer, anti-Rabbit
ImageJ ver 1.52p	NA	NA	https://imagej.net/
innova4200	New Brunswick scientific	9105085	Incubator shaker
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside	Nacalai tesque	19742-94
LB broth, Lennox	Nacalai tesque	20066-24
Leica EG 1150 H	Leica	14 0388 86 108	Modular Tissue Embedding Center
Leica TP 1020	Leica	14 0422 85108	Automatic Tissue Processor
Medetomidine	Fuji Film	135-17473
Microm HM325 Rotary Microtome	Thermo Scientific	902100
Midazolam	Maruishi Seiyaku	4987-211-76210-0
New hematoxylin Type G	Muto	65-9197-38	Hematoxylin solution
Normal winged needle for vein D type, 25G	TERUMO	NN2332R	25G needle
Optima TLX Ultracentrifuge	Beckman Couler	8043-30-1197	Ultracentrifuge
P10 pipette	Gilson	FA10002P
Paraffin	Leica	39601095
paraformaldehyde	Nacalai tesque	30525-89-4
Peroxidase Stain DAB Kit	Nacalai tesque	25985-50
Pirece BCA Protein Assay Kits	Thermo Scientific	23225	BCA assay
pRK172	Addgene	#134504	Plasmid
Q-Sepharose Fast Flow.	cytiva	17051001	Ion exchange resin