Tecnica per la somministrazione intranasale di aggregati di α-sinucleina

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un metodo per la somministrazione intranasale di aggregati di α-sinucleina. Questo metodo fornisce informazioni sulla propagazione della α-sinucleina dalla mucosa olfattiva al bulbo olfattivo nella malattia di Parkinson.

Abstract

La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa caratterizzata dalla presenza di corpi di Lewy, che sono aggregati della α-sinucleina (α-Syn). Recentemente, è stato proposto che la malattia si sviluppi e progredisca attraverso la propagazione simile a quella prionica di aggregati α-Syn dal bulbo olfattivo (OB) o nucleo dorsale del nervo vago. Sebbene l'origine degli aggregati α-Syn nell'OB rimanga poco chiara, la loro propagazione dalla mucosa olfattiva è stata recentemente suggerita. In precedenza abbiamo dimostrato che la somministrazione intranasale di aggregati α-Syn in un modello murino induce la patologia α-Syn nell'ostetricia dei topi. In questo studio, presentiamo un metodo di somministrazione intranasale di aggregati α-Syn che inducono la patologia α-Syn nell'ostetricia dei topi. La somministrazione intranasale di aggregati α-Syn è un metodo molto semplice e diretto e riteniamo che sarà uno strumento utile nella ricerca per chiarire l'origine della patologia α-Syn nell'ostetricia e la via di propagazione di α-Syn attraverso il sistema olfattivo.

Introduzione

La malattia di Parkinson (PD), caratterizzata da sintomi motori come bradicinesia, tremori a riposo e rigidità muscolare, è la seconda malattia neurodegenerativa più comune¹. La malattia di Parkinson presenta anche sintomi non motori, tra cui disfunzione olfattiva, deterioramento cognitivo, depressione, allucinazioni, costipazione e ipotensione ortostatica. I suoi segni patologici sono la morte cellulare dopaminergica nella substantia nigra e la presenza di aggregati di α-sinucleina (α-Syn), chiamati corpi di Lewy².

Da notare che α-Syn è una proteina di 140 aminoacidi che esiste sotto forma di monomero solubile (o tetramero) in condizioni normali. Tuttavia, in condizioni anomale, il monomero solubile viene convertito in aggregati insolubili ad alto peso molecolare, inclusi oligomeri e fibrille. La transizione di α-Syn in oligomeri e fibrille è coinvolta nella tossicità cellulare³.

Studi recenti hanno suggerito la propagazione simile ai prioni di aggregati α-Syn tra i neuroni. Sulla base di numerosi esami post mortem, Braak et al. hanno proposto nel 2003 l'ipotesi che la patologia dei corpi di Lewy si diffonda progressivamente nel cervello in modo alquanto stereotipato (ipotesi di Braak)^4,5. Nel 2008, l'esame post mortem di pazienti con PD che hanno ricevuto trapianti di mesencefalo fetale ha rivelato corpi di Lewy in neuroni dopaminergici derivati da tessuti fetali ^6,7. Questi studi hanno suggerito che gli aggregati α-Syn potrebbero diffondersi dal cervello malato agli innesti, supportando l'ipotesi di Braak.

A seguito di queste osservazioni, esperimenti che hanno coinvolto colture neuronali primarie e iniezione intracerebrale di aggregati α-Syn nei topi hanno riprodotto la diffusione di aggregati simili a corpi di Lewy, fornendo ulteriori prove della propagazione di α-Syn in modo simile ai prioni ^8,9.

Braak et al. hanno dimostrato che la patologia a corpi di Lewy nel PD inizia nel bulbo olfattivo (OB) e/o nel nucleo dorsale del nervo vago (dmX)⁴. Sulla base dell'ipotesi di Braak, diversi studi hanno riportato la somministrazione di aggregati α-Syn o estratti di corpi di Lewy da cervelli PD nell'ostetricia e nel tratto gastrointestinale di animali da esperimento 10,11,12. Nel 2018, uno studio ha dimostrato che la somministrazione di aggregati di α-Syn nell'OB di topi wild-type ha indotto la propagazione della patologia α-Syn lungo la via olfattiva, con conseguente disfunzione olfattiva¹³. In precedenza abbiamo inoculato aggregati α-Syn nell'OB di topi transgenici α-Syn e abbiamo scoperto che questo portava all'atrofia dell'ippocampo e alla compromissione della memoria¹⁴.

Nel 2022 abbiamo inoculato aggregati di α-Syn nell'OB degli uistitì, un piccolo primate non umano; ciò ha comportato la propagazione della patologia α-Syn lungo la via olfattiva, l'atrofia OB e l'ipometabolismo cerebrale diffuso^{del glucosio 10}.

Tuttavia, se la propagazione degli aggregati α-Syn avviene dall'OB, sorge una domanda critica: con quale meccanismo compaiono inizialmente gli aggregati α-Syn? Saito et al. hanno precedentemente riportato la presenza di corpi di Lewy nella mucosa nasale¹⁵. La presenza di aggregati α-Syn è stata rilevata nella mucosa nasale di pazienti con PD e atrofia multisistemica (MSA) utilizzando l'analisi RT-QUIC (Real-time Quaking-Induced Conversion)¹⁶. In particolare, l'analisi di campioni di mucosa nasale di pazienti con disturbo del comportamento del sonno (RBD) con movimenti oculari rapidi, che è considerato uno stadio prodromico della PD, ha rivelato un aumento dei livelli di α-Syn¹⁷. Questo studio ha suggerito che la patologia α-Syn potrebbe esistere nella mucosa nasale anche dalla fase prodromica del PD.

Sebbene questi risultati suggeriscano un potenziale percorso dalla mucosa nasale all'ostetricia, ci sono state prove sperimentali limitate a sostegno di questo scenario. Per colmare questa lacuna, abbiamo somministrato aggregati α-Syn nella cavità nasale dei topi e studiato la propagazione della patologia α-Syn dalla mucosa nasale all'ostetricia. Il nostro approccio sperimentale ha dimostrato che una somministrazione intranasale a dose singola di aggregati α-Syn in topi wild-type induce la patologia α-Syn nell'OB, fornendo prove sperimentali per la via di propagazione dalla mucosa nasale all'OB.

Protocollo

Per questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di 2 mesi. Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite secondo le linee guida nazionali. Il Comitato per la Ricerca sugli Animali dell'Università di Kyoto ha concesso l'approvazione etica e il permesso per questo studio (MedKyo 23.544).

1. Somministrazione intranasale di fibrille preformate α-Syn

1. Preparare la soluzione di fibrille α-Syn di topo in PBS (4 mg/mL) secondo i metodi precedentemente riportati¹¹. Avvolgere il tubo con una pellicola trasparente per evitare contaminazioni.
2. Sonicare 200 μl di soluzione di fibrille α-Syn per generare fibrille preformate (PFF) α-Syn utilizzando un sonicatore a bagno d'acqua (Tabella dei materiali). Riempire il bagno a ultrasuoni con acqua e aggiungere cubetti di ghiaccio per raffreddare a 4 °C per la sonicazione. Sonicare le fibrille per un totale di 5 minuti con ogni ciclo composto da 30 s di sonicazione seguiti da un intervallo di 30 s (per un totale di cinque cicli).
   NOTA: Utilizzare dispositivi di protezione individuale come guanti monouso, maschera e occhiali di sicurezza per prevenire l'esposizione di α-Syn.
3. Preparare una pipetta P10 (Tabella dei materiali) con un puntale da 10 μl. Anestetizzare ciascun topo utilizzando una combinazione di medetomidina cloridrato, midazolam e butorfanolo (MMB) mediante iniezione intraperitoneale (i.p.). L'agente anestetico combinato MMB conteneva midazolam (0,3 mg/kg), medetomidina (4 mg/kg) e butorfanolo tartrato (5 mg/kg). Utilizzare 0,005 ml/g per iniezione endovenosa quando si mescolano midazolam (1 mg/mL) 0,3 mL, medetomidina (5 mg/mL) 0,8 mL, butorfanolo tartrato (5 mg/mL) 1 mL e soluzione fisiologica 2,9 mL.
4. Attendere 10 minuti per assicurarsi che i topi siano stati completamente anestetizzati. Una corretta anestesia può essere confermata se il topo è in decubito laterale e non può raddrizzarsi. Una volta anestetizzato, applicare un unguento oftalmico utilizzando un applicatore di cotone sterile per prevenire la secchezza degli occhi.
   NOTA: Senza anestesia, quando si somministrano dosi nasali, è difficile mantenere i topi supini e somministrare correttamente la soluzione di α-Syn mentre i topi starnutiscono. Per questi motivi, la sedazione era necessaria.
5. Posizionare il mouse anestetizzato in posizione supina. Posizionare un tovagliolo di carta o materiale simile sotto il corpo, assicurandosi di inclinare leggermente la testa verso il basso (Figura 1A, B). Questo posizionamento impedisce alla soluzione somministrata di α-Syn di fluire rapidamente nei polmoni o nell'esofago, facilitandone la ritenzione nella cavità nasale. Le narici sono visibili nella Figura 1C.
6. Aspirare 1 μL di soluzione α-Syn (4 mg/mL) in una pipetta P10 e posizionare la punta della pipetta vicino al naso del topo. Formare lentamente una goccia rotonda e tenerla all'estremità del puntale della pipetta (Figura 1D, freccia rossa). La somministrazione intranasale viene eseguita per la narice unilaterale, utilizzare il lato controlaterale come lato di controllo.
7. Porta la goccia vicino a un lato delle narici del topo e lascia che il topo la inali naturalmente. Osservare l'inalazione e attendere da 30 s a 1 min (Figura 1E).
8. Ripetere i passaggi 1.6.-1.7. fino a quando non viene somministrato un volume totale di 20 μl di soluzione α-Syn. Dopo tutte le procedure, gettare i guanti e pulire un banco con detergenti commerciali se la superficie è contaminata da α-Syn
   NOTA: L'intera procedura deve essere eseguita in un armadio di sicurezza per prevenire l'inalazione di fibrille α-Syn da parte del personale che esegue la procedura. Un precedente rapporto ha dimostrato che il volume di 25 μL è il più efficiente per la somministrazione di farmaci dal naso al cervello¹⁸. Nel presente studio utilizziamo un volume simile di 20 μl. Abbiamo anche utilizzato la stessa concentrazione di PFF per l'iniezione nell'OB nel precedente rapporto¹⁰, che è vicina ai 400 μM (5,6 mg/mL) di PFF¹⁹.
9. Somministrare atipamezolo (3 mg/kg; Tabella dei materiali) mediante iniezione i.p. per invertire la medetomidina e facilitare il recupero. Utilizzare 0,005 mL/g per iniezione endovenosa quando si mescola atipamezolo (5 mg/mL) 0,6 mL e soluzione fisiologica 4,4 mL.
   NOTA: Fornire analgesia perché non è completamente chiaro quanto sarebbe stressante la somministrazione intranasale di α-Syn.
10. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Dopo il completo recupero, rimetti il mouse nella gabbia.

2. Preparazione del campione

1. Sacrificare i topi trattati a 1, 3, 6 e 12 mesi dopo la somministrazione intranasale di fibrille preformate α-Syn.
   1. Mettere i topi nella scatola di induzione, somministrare sevoflurano (>6,5%) e continuare fino a quando non si verifica l'arresto respiratorio per > 60 s. Rimuovere i topi ed eseguire un rapido dissanguamento mediante incisione atriale destra per garantire l'eutanasia.
2. Inserire un ago da 25G (Tabella dei materiali) nell'apice del cuore. Perfondere il topo a 4 mL/min con 15 mL di PBS e poi 15 mL di PFA al 4% in PBS.
3. Taglia la testa con le forbici e fai un'incisione di 2 cm nel cuoio capelluto con un bisturi. Incidere l'osso cranico con le forbici sul lato laterale dal basso verso il naso (Figura 2A, B). Per ottenere gli OB, rimuovere completamente l'osso cranico sugli OB (Figura 2B, cerchio giallo).
4. Capovolgere la testa, recidere i nervi del cervello e quindi rimuovere il cervello con cautela con una pinza (Figura 2C, D). Ottenere il cervello con OB intatti (Figura 2E). Per ottenere le ostetriche intatte, tagliare con cura i nervi olfattivi con una pinza mentre le ostetriche si attaccano all'osso del cranio (Figura 2D, cerchio giallo).
5. Mettere i campioni di cervello nel PFA al 4% in PBS per una notte a 4 °C. Non lasciare i campioni di cervello per più di 24 ore.
   NOTA: Una fissazione eccessiva ridurrà la colorazione immunoistochimica. Se è necessaria una conservazione a lungo termine, conservare i campioni di cervello in etanolo al 70% o PBS contenente lo 0,1% di azoturo di sodio per mantenere la sterilità.

3. Colorazione immunoistochimica dell'ostetrica

1. Paraffinizzare i campioni utilizzando un processatore automatico di tessuti (Tabella dei materiali) come descritto di seguito.
   1. Immergere in etanolo al 70% per 120 minuti, quindi immergere in etanolo al 100% per 8 volte per 60 minuti. Quindi, immergere in xilene al 100% per 3 volte per 120 min.
   2. Immergere in paraffina a 60 °C per 120 min e immergere in paraffina a 60 °C per 240 min.
2. Incorporare i campioni nella paraffina come descritto di seguito.
   1. Incorporare i campioni in paraffina a 60 °C con un centro di inclusione tissutale modulare (Tabella dei materiali). Raffreddateli con ghiaccio.
3. Tagliare i campioni in sezioni di 8 μm di spessore con un microtomo (Tabella dei materiali)¹⁸.
4. Eseguire la deparaffinazione come descritto di seguito.
   1. Immergere in xilene al 100% per 2 volte per 5 minuti, quindi immergere in etanolo al 100% per 2 volte per 3 minuti.
   2. Immergere in etanolo al 70% per 3 min. Lavare in PBS per 3 min.
5. Condurre il recupero dell'antigene come descritto di seguito.
   1. Immergere in acido formico al 100% per 15 min. Risciacquare con soluzione salina tamponata con fosfati (PBS) per 2 minuti.
   2. Autoclavare a 120 °C per 10 min. Lasciarlo raffreddare naturalmente.
6. Immergere in perossido di idrogeno all'1% in metanolo per 10 minuti. Lavare in PBS per 5 min.
7. Aggiungere 500 μL di latte scremato al 5% in PBS sui vetrini e incubarli per 30 minuti a temperatura ambiente.
8. Mettere i 500 μl di anticorpo anti-α-Syn anti-fosforilato (p-α-Syn, 1/10000) in PBS sui vetrini e incubarli per una notte a 4 °C. Lavare 2 volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
9. Incubare con polimero universale di immuno-perossidasi, anti-Rabbit (Tabella dei materiali) per 1 ora a 25 °C. Lavare 2 volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
10. Sviluppare utilizzando il kit di colorazione 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (Tabella dei materiali) per 5 minuti secondo le istruzioni del produttore.
11. Immergere in soluzione di ematossilina per 1 minuto (Tabella dei materiali). Decolorare in acqua corrente per 10 min.
12. Eseguire il montaggio come descritto di seguito.
    1. Immergere in etanolo al 70% per 5 min. Immergere in etanolo al 100% per 2 volte per 5 minuti.
    2. Immergere in xilene al 100% per 2 volte per 5 min. Montare utilizzando un mezzo di inclusione (Tabella dei materiali). Applicare i 100 μl di un mezzo di inclusione sui vetrini e coprire con un vetrino coprioggetti.
13. Acquisizione di immagini utilizzando un microscopio All-in-One con ingrandimento di 20x e 40x (Tabella dei materiali).

Risultati

La Figura 3 mostra diversi esempi di aggregati α-Syn nell'OB. Nel presente studio, abbiamo somministrato aggregati α-Syn nella narice unilaterale. Le due cavità nasali sono separate dal setto nasale e ogni OB proietta separatamente i neuroni sensoriali olfattivi su ciascuna cavità nasale. Pertanto, l'OB sul lato controlaterale può essere utilizzato come controllo.

La patologia P-α-Syn non è stata osservata nell'ostetrica su...

Discussione

In uno studio precedente, la somministrazione di aggregati α-Syn nella cavità nasale dei macachi ha indotto la morte delle cellule dopaminergiche e la deposizione di ferro nella substantia nigra, sebbene non siano stati osservati aggregati α-Syn²¹. È stato riportato che la somministrazione giornaliera di aggregati A53T di α-Syn umano nella cavità nasale di topi transgenici α-Syn promotori di prioni (topi M83) per 28 giorni induce la patologia α-Syn nel cer...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710	KEYENCE	N/A	All-in-One microscope
Ampicillin Sodium Salt	Nacalai tesque	02739-32
Bioruptor II	Sonicbio	BR2006A	Water bath type sonicator.
Butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	WAK-52850
Cellulose tube	MISUMI	UC20-32-100
DeepWellMaximizer	TAITEC	MBR-022UP	Shaker
DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)	BioDynamics Laboratory Inc.	DS255	Competent cell
Entellan	Sigma-Aldrich	107961	Rapid mounting medium for microscopy
Graefe Extra Fine Forceps Curved Serrated	FST	11152-10	forceps
Hardened Fine Scissors	FST	14090-09	scissors
Histofine Simple stain mouse MAX-PO (R)	Nichirei Bioscience	414341	Universal Immuno-peroxidase Polymer, anti-Rabbit
ImageJ ver 1.52p	NA	NA	https://imagej.net/
innova4200	New Brunswick scientific	9105085	Incubator shaker
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside	Nacalai tesque	19742-94
LB broth, Lennox	Nacalai tesque	20066-24
Leica EG 1150 H	Leica	14 0388 86 108	Modular Tissue Embedding Center
Leica TP 1020	Leica	14 0422 85108	Automatic Tissue Processor
Medetomidine	Fuji Film	135-17473
Microm HM325 Rotary Microtome	Thermo Scientific	902100
Midazolam	Maruishi Seiyaku	4987-211-76210-0
New hematoxylin Type G	Muto	65-9197-38	Hematoxylin solution
Normal winged needle for vein D type, 25G	TERUMO	NN2332R	25G needle
Optima TLX Ultracentrifuge	Beckman Couler	8043-30-1197	Ultracentrifuge
P10 pipette	Gilson	FA10002P
Paraffin	Leica	39601095
paraformaldehyde	Nacalai tesque	30525-89-4
Peroxidase Stain DAB Kit	Nacalai tesque	25985-50
Pirece BCA Protein Assay Kits	Thermo Scientific	23225	BCA assay
pRK172	Addgene	#134504	Plasmid
Q-Sepharose Fast Flow.	cytiva	17051001	Ion exchange resin