(1) Extraktion von DNA aus Lebensmittelproben

1. 500 µL der gekauften PCR Mischung Matrix hinzu kommt jeweils die 2 Schraubverschluss-Röhrchen mit eine Transferpipette oder 200-1.000 µL einstellbarer Lautstärke Mikropipette. Pipette rauf und runter mit dem Pipettieren zwischen jeder Aliquote gleichmäßig mischen die PCR-Matrix.
2. Beschriften Sie ein Schraubverschluss Röhrchen "GVO-freien" und "Test".
3. 0,5 g zertifizierten GVO-Lebensmittel Abwiegen und steckte es in den Mörtel.
4. 2,5 mL destilliertem Wasser hinzugeben und Schleifen mit Pistill für 2 min um einen Brei zu bilden.
5. Fügen Sie eine weitere 2,5 mL destilliertem Wasser und weiter Schleifen mit Stößel bis Gülle glatt genug zu pipettieren wird.
6. Pipettieren 50 µL Boden Gülle, der Schraubverschluss-Röhrchen mit 500 µL des PCR-Vormischung mit der Bezeichnung "non-GMO" mit 50 µL Mark auf einem abgestuften pipettieren. Rohr zu rekapitulieren.
7. Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,6, die Probe Essen vorzubereiten.
8. Pipettieren 50 µL Boden Test Lebensmittel Gülle mit dem Schraubverschluss Rohr mit der Bezeichnung "test". Rohr zu rekapitulieren.
9. Wirbel der GVO-Lebensmittel und Test-Röhren PCR für 1 min und Platz Rohre im Wasserbad 95 ° C für 5 min. Wenn keine Wirbel verfügbar ist, wechseln Sie das Rohr mehrmals um zu mischen vor dem Einlegen in Wasserbad.
10. Rohre in einer Zentrifuge für 5 min zu platzieren. Ein solide Pellet sollten an der Unterseite des Rohres bilden. Wenn die Pellets nicht nach 5 min, Zentrifuge wieder für 2 min Intervalle bis Pellet Formen gebildet wird.
11. Rohre können sofort für die PCR verwendet oder für bis zu 1 Woche im Kühlschrank gelagert.

2. Einrichten von PCR-Reaktionen

1. PCR-Röhrchen 1 – 6 Nummer und sie initial. Die Zahlen sollten folgende Rohr-Inhalte, die in Tabelle 1aufgeführten entsprechen.
2. Legen Sie jedes beschriftete PCR-Röhrchen in eine Reaktionscup Halterung mit Kappen offen.
3. Fügen Sie mithilfe einen frischesten Tipp für jede zusätzlich 20 µL des Primers an jedem PCR-Röhrchen auf Tabelle 1 angegeben. GAP-Röhren.
4. Fügen Sie mithilfe einen frischen Tipp für jedes Rohr 20 µL DNA-Probe auf Tabelle 1 angegeben, um jedes PCR-Röhrchen, dass auf jeden Fall nur aus der Überstand pipette und das solide Pellet am unteren Rand der Rohre zu vermeiden.
5. Nachdem jede DNA-Probe in das entsprechende PCR-Röhrchen pipettiert, verwenden Sie Pipette, um DNA und Grundierung mischen, indem Sie sanft auf und ab pipettieren; rekapitulieren Sie Röhren.
6. PCR-Röhrchen in Thermocycler und programmieren Sie der Cycler für:
   Anfängliche denaturieren: 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min.
   Verstärkung: 40 Zyklen bei 94 ° C für 1 min (denaturieren), 59 ° C für 1 min (Tempern) und 72 ° C für 2 min (Erweiterung).
   Letzte Erweiterung: 1 Zyklus bei 72 ° C für 10 Minuten.
   Halten: 4 ° C auf unbestimmte Zeit.

3. 3 % Agarose-Gel-Vorbereitung

1. Verwendung von Lab oder Klebeband, sicher Klebeband von der offenen Enden der Gel-Tiefziehschiene. Stellen Sie sicher, dass Klebeband an den Rändern des Fachs zu verhindern, dass flüssige Agarose Austritt verschlossen ist.
2. 3 g Agarose in einen Erlenmeyerkolben 250 mL oder größeren abwiegen.
3. Hinzugeben Sie 100 mL 1 X TAE-Puffer (aus Konzentrat hergestellt oder gekauft).
4. Mit einer magnetischen Heizplatte mit Stir Bar, erhitzen Sie das Becherglas bis Agarose im Puffer vollständig aufgelöst und die Lösung kocht und Wendungen deutlich. Alternativ kann eine Mikrowelle verwendet werden, indem man Becher in Ofen und Heizung für 30 s Abständen, mit einem rühren Stab mischen alle 10 s, wiederholen, bis die Mischung kocht und Wendungen deutlich.
5. Kehren Sie ein 50-mL-Erlenmeyerkolben in die Öffnung des 250-mL-Flasche als ein Reflux, verhindert das Verdampfen Agarose-Lösung handeln.
6. Agarose-Lösung auf 60 ° C abkühlen lassen, und 30-50 mL in jede versiegelte Gel-Tiefziehschiene gießen.
7. Legen Sie einen Gel-Kamm in das erste paar der Kerben Gel Brunnen zu erstellen.
8. Lassen Sie das Gel vollständig abkühlen, bevor Sie die Band und Kamm entfernen. Gel wird zu festigen und drehen von klar zu trüben, wenn fertig, ca. 10-20 min.

4. die Elektrophorese der PCR-Produkte

1. Legen Sie eine vorgefertigte 3 % Agarosegel auf ein Gel-Tablett oder verwenden ein Gel-Tablett, das verwendet wurde, um eine gegossene 3 % Agarose-Gel gegossen.
2. Schieben Sie Gel-Tiefziehschiene in der Elektrophorese-Kammer mit dem Brunnen am nächsten an der Kathode (schwarz) Ende.
3. Gießen Sie 1 X TAE-Puffer in der Kammer genug Puffer über die Oberkante des Gel-Tiefziehschiene 2 mm haben.
4. Erhalten Sie PCR-Röhrchen aus dem Thermocycler und in Reaktionscup Halter.
5. Mit einem frischen Pipettenspitze jeweils, 10 µL des gekauften Orange G laden Farbstoff (LD), jede Probe hinzufügen und gut verrühren.
6. Last 20 µl des Herrschers Molekulargewicht und 20 µL jeder Probe in das Gel in der Reihenfolge angegeben (Tabelle 2).
7. Laufen Sie Gelelektrophorese für 30 min bei 100 V.
8. Entfernen Sie Gel-Tiefziehschiene aus Kammer und Dia-Gel aus Taskleiste entfernen. Legen Sie Gel in eine Färbung Fach.
9. Tauchen Sie Gel in gekauften DNA-Gel Fleck für 5 min, sorgfältig schütteln Tablett um den Fleck in das Gel verteilen.
10. Übertragen Sie das Gel in einen Behälter waschen und spülen Sie mit Wasser aus dem Wasserhahn (40-55 ° C) für ca. 10 s.
11. Destain durch Waschen 3 X in warmem Leitungswasser für 6 min mit sanft schütteln für optimale Ergebnisse zu erzielen. Falls erforderlich, weiter entfärben in warmem Wasser, bis der gewünschte Kontrast erreicht ist.

Tabelle 1. Liste der entsprechenden Röhre zahlen, Primer und DNA-Proben.

Tabelle 2. Der richtigen Reihenfolge, 20 µL des Herrschers Molekulargewicht und 20 µL jeder Probe in das Gel zu laden.