Quantifizierung der ökologischen Mikroorganismen und Viren mit qPCR

1. die Probenahme

1. Boden mit einer Schnecke zu sammeln oder zu einer bestimmten Tiefe Schaufel. Wenn Boden von der Rhizosphäre sammeln, sammeln Sie nur Boden innerhalb von 7 mm rund um Pflanzenwurzel, durch überschüssige Erde von der Wurzel schlagen und kratzen gewünschte Boden in ein Fass Sammlung.
2. Legen Sie eine sterile Nalgene Flasche in DIP Stick. Halten Sie das Ende des Stockes und sammeln Sie Wasser durch Eintauchen der Flasche zu. Stellen Sie die Flasche in eine Kühlbox mit Eis.
3. Übertragen Sie Proben an das Labor.

(2) Nukleinsäuren Extraktion

1. Mikroorganismen aus den gesammelten Proben zu isolieren und zu DNA oder RNA extrahieren, bitte sehen Sie das Video Jupiter Science Education Community Nukleinsäure-Extraktion.

3. reverse Transkription

1. Wenn das Erbgut untersucht wird RNA ist, muss es verwendet werden komplementäre DNA (cDNA) generieren über reverse Transkription vor der PCR. Für Details siehe Jupiter Science Education video auf RT-PCR.

4. Einstellen der qPCR

1. Abrufen von Reagenzien, die bei-20 ° C gelagert und tauen sie auf Eis oder bei Raumtemperatur innerhalb eine cleane Motorhaube. In diesem Beispiel verwendete Reagenzien enthalten die qPCR Reaktion Mischung (abhängig von der qPCR-Maschine verwendet, enthält DNA-Polymerase), forward und reverse Primer und die TaqMan Sonde. Primer und Sonde Sequenzen sollen mit Sequenzen, die spezifisch für den Organismus, die aufgelistet werden. Beziehen sich auf aktuelle Literatur, Sequenzen von Interesse zu finden. In diesem Beispiel wird das Roche Light Cycler 480 Sonden Reagenz-System verwendet werden. Paprika mild Mottle Virus wird in der Wasserprobe aufgelistet werden. ^{1, 2} siehe Tabelle 1 für Primer und Sonde Sequenzen.
2. Tauwetter extrahiert (c) DNA-Proben und die Positivkontrolle DNA (bestehend aus Organismus-spezifische Sequenzen in bakterielle Plasmide kloniert) bei Raumtemperatur.
3. Vorbereiten einer 96-Zelle Tabellenvorlage, die die qPCR 96-Well-Platte ähnelt. Beschriften Sie jede Zelle mit der Reaktion, die auf der Platte geladen wird. Schließen Sie Reaktionen für jede Probe und Standard in dreifacher Ausfertigung sowie für die positive Kontrolle und Negativkontrolle, wie eine keine-DNA Reaktion.
4. Berechnen Sie die Reagenz Bände für eine Reaktion "master-Mix", die alle Reagenzien, die konstant unter den Reaktionen umfasst, basierend auf Angaben des Herstellers und der Literatur sind erforderlich. Bereiten Sie genügend master-Mix für dreifacher Reaktionen für alle Proben sowie Kontrollen und zusätzlich 10 % zu pipettieren Fehler ausmachen. Für ein Probe-Master mix Rezept, siehe Tabelle 2.
5. Arbeiten in einem sauberen Kapuze, sobald alle Reagenzien vollständig aufgetaut sind, fügen Sie berechneten Betrag jedes Reagenz zu einem Schlauch 1,5 mL niedrig-Bindung Microfuge master-Mix zu erstellen hinzu. Wirbel und kurz Minicentrifuge jedes Reagenz vor dem hinzufügen. Ändern Sie die Pipettenspitze zwischen jedes Reagens zu verhindern Kontamination und korrekte Konzentrationen zu gewährleisten. Nachdem alle Reagenzien hinzugefügt wurden, tube Wirbel und Minicentrifuge mit den master-Mix auf Homogenität zu gewährleisten.
6. Aliquoten das entsprechende Volumen der master-Mix in jedes gut in 96-Well-PCR-Platte bezeichnet.
7. Fügen Sie das entsprechende Volumen der (c) DNA-Probe, Positivkontrolle Plasmid und Negativkontrolle (molekulare Grad Wasser) in dafür vorgesehenen Vertiefungen.
8. Nachdem alle Proben und Kontrollen hinzugefügt wurden, Dichtplatte mit Folie abdichten. Verwenden Sie ein Siegelwerkzeug Luft heraus von unterhalb der Folie und Luftblasen zu verhindern. Kanten der Folie vorsichtig abreißen.
9. Zentrifugieren der versiegelten 96-Well-Platte in einer Zentrifuge mit Kennzeichenhalter Mischung am unteren Rand jedes gut zu sammeln. Achten Sie darauf, eine Gegengewicht-Platte zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Zentrifuge richtig beim Drehen ausgeglichen wird. Impuls bis zu 1000 u/min Zentrifugieren, dann lassen Sie die Zentrifuge langsam ohne Bremsen stoppen.

5. qPCR Betrieb

1. Platz 96-Well-Platte in qPCR Maschine versiegelt. Stellen Sie sicher, dass diese Maschine zeigt, dass es bereit ist.
2. Nach den Anweisungen Sie qPCR Maschine richtig geben Sie alle Informationen von Software benötigt, dann setzen Sie qPCR Maschine laufen.
3. Nach Abschluss der Maschine ausführen wird die Software die bekannten Konzentrationen der Positivkontrolle verwenden, um die Menge der cDNA in jeder Reaktion berechnen können. Die Menge des Virus in der ursprünglichen Probe kann dann berechnet werden, basierend auf der Verdünnung, Filtration, Konzentration, Verstärkung und/oder Abbauverfahren durchgeführt, um die DNA-Probe zu erhalten.

Reagenz	Sequenz (5' → 3')	Volumen (μL / gut)	Endgültige Konz.
Forward Primer	GAGTGGTTTGACCTTAACGTTTGA	2.25	900 nM
Rückwärts-Primer	TTGTCGGTTGCAATGCAAGT	2.25	900 nM
Sonde	FAM-CCTACCGAAGCAAATG-BHQ1	1.0	200 nM

Tabelle 1. Probe-Primer und Sonde-Sequenzen zur Erkennung von Pfeffer mild Mottle Virus.

Reagenz	Volumen (μL / gut)	Anzahl der Bohrungen	Master Mix Volume (μL)
LC 480 mischen	12.5	26	325
Molekulare H2O	4.5		117
Forward Primer	2.25		58,5
Rückwärts-Primer	2.25		58,5
Sonde	1.0		26
Insgesamt	22.5		585

Tabelle 2. Reagenz Bände für individuelle Reaktion und master-Mix.