環境微生物やウイルスを使用しての qPCR の定量化

1. サンプル コレクション

1. オーガーを使用して土壌を収集または決められた深さをシャベルで掘る。根から土を集めて、ルートから余分な土壌を押すとコレクション バレルに希望の土壌を削りによって植物根周り 7 mm 以内の土壌を収集のみ。
2. 棒を浸漬に滅菌 Nalgene 瓶を配置します。棒の端を保持し、ボトルを水没によって水を収集します。氷をクーラーにボトルを置きます。
3. 研究室にサンプルを転送します。

2. 核酸抽出

1. 収集した試料から微生物を分離してそれらから DNA や RNA を抽出するには、コミュニティによる核酸抽出にゼウス科学教育ビデオを参照してください。

3. 逆のトランスクリプション

1. 試金される遺伝物質が RNA の場合逆転写 PCR に進む前にを介して相補的 DNA (cDNA) を生成する使用する必要があります。詳細については、ゼウス科学教育 RT-PCR のビデオを参照してください。

4. qPCR の設定

1. -20 ° C で保存試薬を取得し、氷の上またはクリーン フード内室温で解凍します。この例で使用する試薬は、qPCR 反応混合物 (qPCR マシンに依存使用; DNA ポリメラーゼが含まれています), 前方および逆のプライマーと TaqMan プローブ。プライマーおよびプローブ シーケンスは、シーケンスが列挙されて生物に特有の設計されています。現在の文献の興味のシーケンスを見つけるために参照してください。この例では、ロシュ社光サーマルサイクラー 480 プローブ ミックス試薬システムが使用されます。トウガラシマイルドモットル ウイルスは、水試料に列挙されます。^{1, 2}は、プライマーの表 1を参照してくださいし、のプローブ順序。
2. 解凍は、常温 (c) サンプルおよび肯定的な制御 (細菌のプラスミドにクローニング生物固有のシーケンスで構成) される DNA から DNA を抽出しました。
3. QPCR 96 ウェル プレートのような 96 セルのテーブル テンプレートを準備します。各セルには、プレートの上に読み込まれる反応にラベルを付けます。肯定的な制御のない DNA 反応などの否定的な制御だけでなく、各サンプルと 3 通、標準の反応があります。
4. 製造元の指示および文献に基づいて、反応の間で一定している試薬のすべてが含まれます「マスター ミックス」の反応に必要な試薬のボリュームを計算します。すべてのサンプルに加えて、コントロール、およびピペット誤差を考慮する、さらに 10% の帳票の反応を十分なマスター ミックスを準備します。サンプル マスター ミックス レシピは、表 2を参照してください。
5. すべての試薬は完全に融解後一度クリーン フード内部の作業、マスター ミックスを作成する 1.5 mL 低結合および microfuge の管に各試薬の計算量を追加します。渦と簡単に minicentrifuge 追加する前に各試薬。汚染を防ぎ正しい濃度を維持する各試薬間ピペット チップを変更します。すべての試薬を追加すると、渦と minicentrifuge は均質性を確保するためのマスターの組合せとチューブします。
6. 因数 96 ウェル PCR プレートでよく示されるそれぞれにマスター ミックスの適切なボリューム。
7. 指定されたウェルに (c) DNA のサンプル、肯定的な制御プラスミドと否定的な制御 (分子グレード水) の適切な量を追加します。
8. すべてのサンプルやコントロールを追加すると、プレート シール箔をシールします。箔の下から空気をプッシュすると泡を防ぐシール ツールを使用します。ホイルのエッジを慎重にはがします。
9. 各井戸の底で混合物を収集するプレート ホルダーと遠心分離機でシール 96 ウェル プレートを遠心します。カウンターウェイト プレートを使用して回転しながら遠心分離機を正しく分散されますを確認することを確認します。遠心分離機のパルス 1000 rpm までし、ブレーキなし聞かせて遠心分離機が徐々 に停止します。

5. qPCR 操作

1. QPCR マシンに封印された 96 ウェル プレートを配置します。そのマシンを開始する準備ができたことを示しますを確認します。
2. すべての情報、ソフトウェアによって必要な qPCR マシンを実行を設定を正しく入力する qPCR マシンの指示に従います。
3. コンピューターには、実行が完了すると、ソフトウェアは各反応の cDNA の数量を計算する肯定的な制御の既知濃度を使用することになります。元のサンプル ウイルス量計算できます、希釈、ろ過、集中、増幅、または DNA のサンプルを取得するための抽出プロセスに基づきます。

試薬	シーケンス (5' → 3')	ボリューム (μ L/も)	最終濃度
前方のプライマー	GAGTGGTTTGACCTTAACGTTTGA	2.25	900 nM
逆プライマー	TTGTCGGTTGCAATGCAAGT	2.25	900 nM
プローブ	FAM CCTACCGAAGCAAATG BHQ1	1.0	200 nM

表 1。検出するためのサンプルのプライマーおよびプローブ シーケンスはコショウ トウガラシマイルドモットル ウイルスです。

試薬	ボリューム (μ L/も)	井戸の数	マスター ミックス ボリューム (μ L)
LC 480 ミックス	12.5	26	325
分子 H2O	4.5		117
前方のプライマー	2.25		58.5
逆プライマー	2.25		58.5
プローブ	1.0		26
合計	22.5		585

表 2。個々 の反応のマスター ミックス試薬ボリューム。