1. le prélèvement

1. Recueillir le sol à l’aide d’une tarière ou pelle à une profondeur déterminée. Si collecte du sol de la rhizosphère, ne recueillons sol intérieur 7 mm autour des racines de la plante, en frappant des excès de saleté hors de la racine et grattage sol souhaité dans un tonneau de collection.
2. Placez une bouteille Nalgene stérile en trempant le bâtonnet. Tenez l’extrémité du bâton et de recueillir l’eau en immergeant la bouteille. Placer la bouteille dans une glacière avec de la glace.
3. Transfert des échantillons au laboratoire.

2. Extraction des acides nucléiques

1. D’isoler des micro-organismes dans les échantillons recueillis et pour en extraire l’ADN et/ou de l’ARN, s’il vous plaît voir la vidéo de l’enseignement des sciences JoVE sur l’extraction des acides nucléiques communautaire.

3. Transcription inverse

1. Si le matériel génétique étant dosé est RNA, il doit servir à générer l’ADN complémentaire (ADNc) par transcription inverse avant de procéder à la PCR. Pour plus de détails, veuillez consulter JoVE Science Education vidéo sur RT-PCR.

4. mise en place de qPCR

1. Récupérer les réactifs stockés à-20 ° C et les décongeler sur glace ou à température ambiante à l’intérieur d’une hotte propre. Réactifs utilisés dans cet exemple comprennent le mélange réactionnel de qPCR (dépendant de la machine de qPCR utilisé ; contient l’ADN polymérase), amorces et inverses et la sonde TaqMan. Les séquences d’amorce et de sonde sont conçus avec des séquences spécifiques de l’organisme qui est énuméré. Reportez-vous à la documentation actuelle de trouver des séquences d’intérêt. Dans cet exemple, le système de réactif de Roche Light Cycler 480 sondes Mix servira. Virus doux de marbrure du poivre sont énumérées dans l’échantillon d’eau. ^{1, 2} Voir le tableau 1 pour apprêt et sonder les séquences.
2. Dégel extraite (c) l’ADN des échantillons et le contrôle positif ADN (qui se compose de séquences spécifiques d’un organisme clonés dans les plasmides bactériens) à température ambiante.
3. Préparer un modèle de tableau de 96 cellules qui ressemble à la plaque 96 puits qPCR. Étiquetez chaque cellule avec la réaction qui sera chargée sur la plaque. Comprendre les réactions pour chaque échantillon et de la norme en trois exemplaires, ainsi que pour le contrôle positif et un témoin négatif, comme par exemple une réaction non-ADN.
4. Calculer les volumes de réactifs nécessaires à une réaction « master mix », qui comprend tous les réactifs qui sont constants parmi les réactions, basées sur les instructions du fabricant et de la littérature. Préparer suffisamment mélange principal pour les réactions en triple pour tous les échantillons plus de contrôles et une majoration de 10 % pour tenir compte de l’erreur de pipettage. Pour un maître échantillon mélanger recette, reportez-vous au tableau 2.
5. Travaillant à l’intérieur d’une hotte propre, une fois que tous les réactifs sont complètement décongelés, ajouter le montant de chaque réactif dans un tube de microtubes de 1,5 mL basse-liaison pour créer le mélange principal. Vortex et brièvement minicentrifuge chaque réactif avant d’ajouter. Changer de pipette entre chaque réactif pour prévenir la contamination et assurer des concentrations correctes. Après que tous les réactifs ont été ajoutés, vortex et minicentrifuge tube avec master mix afin d’assurer l’homogénéité.
6. Aliquoter le volume approprié de mélange principal dans chacun désigné bien dans la plaque PCR 96 puits.
7. Ajouter le volume approprié d’échantillon d’ADN (c), plasmide contrôle positif et le contrôle négatif (eau de qualité moléculaire) dans les puits désignés.
8. Une fois que tous les échantillons et les contrôles ont été ajoutés, flasque avec feuille d’étanchéité. Utiliser un outil de scellement pour pousser l’air sortir de sous la feuille métallique et éviter les bulles. Déchirez les bords du papier avec soin.
9. Centrifuger la plaque 96 puits scellée dans une centrifugeuse avec un porte-plaque pour rassembler le mélange au fond de chaque puits. Veillez à utiliser une plaque de contrepoids pour faire en sorte que la centrifugeuse sera correctement équilibrée tout en tournant. Impulsion centrifuger jusqu'à 1000 tr/min, puis laissez la centrifugeuse arrêter lentement sans freins.

5. qPCR opération

1. Introduisez plaque à 96 puits scellé dans machine de qPCR. S’assurer que la machine indique il est prêt à démarrer.
2. Suivez les instructions de machine de qPCR pour entrer correctement toutes les informations nécessaires par le logiciel, puis définissez qPCR machine à courir.
3. Après que la machine complète exécution, le logiciel sera en mesure d’utiliser les concentrations connues du contrôle positif pour calculer la quantité de l’ADNc dans chaque réaction. La quantité de virus dans l’échantillon original peut alors être calculée, basé sur la dilution, filtration, concentration, amplification et/ou les procédés d’extraction effectuées pour obtenir l’échantillon d’ADN.

Le tableau 1. Séquences d’amorce et de sonde échantillon pour détecter les virus doux de marbrure de poivre.

Le tableau 2. Volumes de réactifs pour la réaction individuelle et mélange principal.