Hitzeschmerzen Testen mit dem Thermostimulator TSA II 1. Einführung <ol><li> Bei diesem Verfahren wird die TSA II, ein im Handel erhältliches thermo-sensorische Analysator, die Wärme Reize bietet, um die Haut mit einer Thermode (Medoc Advanced Medical Systems, Durham, NC). Eine zentrale Einheit erzeugt und überträgt das Signal an die Thermode. Dieses Signal wird von proprietärer Software in der Regel auf einem Laptop mit der Zentraleinheit gespeicherten gesteuert. Auch an die Zentraleinheit angeschlossen ist ein Handsender, dass eine Studie unter der Erwärmung der Thermode stoppen können. </li><li> Sieben sequentielle und identisch Wärme Reize ausgeliefert werden, mit Inter-Stimulus Intervall von 30s. Die basale Thermodentemperatur ist in einem komfortablen 35 º C eingestellt Die Rate, mit der Thermode heizt auf 1 gesetzt º C / s, während die Rate, mit der es kühlt auf 10 º C / s eingestellt ist Die maximale Thermodentemperatur liegt bei 52 º C eingestellt </li></ol> 2. Vorbereitung und Schulung der Subjekte <ol><li> Zur Vorbereitung Themen für die Wärme Schmerzen Prüfsitz sie bequem in einem Liegestuhl, dass eine angemessene Unterstützung für den Kopf, Arme und Beine stellt. Der Stuhl sollte auch ermöglichen einen leichten Zugang zu den untersuchten Stellen des Körpers. </li><li> Die Testanlage soll in einer angenehmen Raumtemperatur werden, und bieten eine ruhige und neutrale Umgebung ohne Ablenkung. </li><li> Vor Beginn des Experiments, sollten alle Teilnehmer auch in allen Aspekten des Wärme Schmerzen Tests geschult werden. Training stattfinden kann jederzeit vor dem Experiment. </li><li> Wechselwirkungen zwischen Probanden und Forscher sollten diejenigen, die für die Erhebung von Daten beschränkt werden. Joking und Small Talk sind abgeraten, da sie die Konsistenz der Daten gefährden können. Studienteilnehmer werden darauf hingewiesen, dass die Wechselwirkungen absichtlich etwas monoton und neutral während der Experimente. </li><li> Bewahren Sie die Anleitung klar, einfach und konsistent. Betonen Sie, dass Schmerz ist subjektiv, und es gibt keine richtigen oder falschen Antworten. Es ist sehr wichtig konsequent zu sein. Definieren Sie die Wärme Schmerzgrenze als der Punkt zwischen &quot;zu schmerzhaft zu sein&quot; und &quot;wurde einfach weh.&quot; </li><li> Es ist wichtig, dass ein Thema, genau weiß, was er während der Testfahrten zu erwarten. Jede &quot;Überraschungen&quot; kann in weniger konsistente Daten führen, da Störfaktoren wie Angst erzeugt werden kann. Zum Beispiel, wenn sieben Wärme Schmerzreize verwendet werden, um die Wärme Schmerzgrenze zu ermitteln, sollte das Thema wissen. </li><li> Zu jeder Zeit kann der Gegenstand der Thermode davor noch heißer per Knopfdruck von einem Hand-Steuerung zu stoppen. Die Kontrolle wird ein Thema reduzieren die Angst und macht die Daten zuverlässiger. </li><li> Das Training bietet die Möglichkeit, eine Studie unter der Leistung zu beurteilen. Es kann sein Bestes, um Probanden während zwei Minuten vor vier Testzyklen Bahn so ihre individuellen Schmerzschwelle von nicht mehr als 0,8 ° C, und im Idealfall nicht mehr als 0,6 ° C zwischen den beiden letzten Testzyklen. Unterschiedlich Probanden, die konsequent durchführen scheitern in der Regel aus der Studie ausgeschlossen. </li></ol> 3. Die Bestimmung der Schmerzschwelle <ol><li> Zu Beginn der Schmerzgrenze Testzyklen markieren Sie die Platzierung der Thermode auf die Haut des Subjekts. In diesem Experiment die gleiche entzündete Haut Läsion für Mikrodialyse wird für Schmerzen, über Biochemikalien in Reaktion auf den Schmerz Testen freigegeben lernen getestet werden. </li><li> Dann starten jedem Zyklus, indem Sie die Thermode auf die markierte Hautstelle. Passen Sie die Position der Thermode mit den Markierungen so genau wie möglich. Lassen Sie die Temperatur zwischen der Haut und der Thermode auf 35 ausgleichen ° C - eine Temperatur, die sicher keine Schmerzen verursachen. Dies wird etwa 5 Sekunden dauern und wird durch eine Lesung von 35 ° C auf dem Bildschirm angezeigt werden. </li><li> Bevor Sie beginnen, geben die Hand-Steuerung zu dem Thema. </li><li> Verwenden Sie konstant und sanften Druck auf die gesamte Oberfläche der Thermode in vollem Kontakt mit dem Thema der Haut zu halten während der Prüfung. </li><li> Starten Sie nun den vorprogrammierten Test-Algorithmus. Die Thermode startet Aufheizen mit 1 ° C / s. Sobald das Thema Schmerz empfindet, werden sie die Taste Handgerät. </li><li> Nach Drücken der Taste auf dem Handgerät wird die Thermodentemperatur Schmerzen automatisch registriert und startet abnehmenden mit einer Rate von 10 ° C / s bis auf die Grundlinie Temperatur von 35 ° C. </li><li> Der Temperaturfühler wird automatisch bei 35 ° C für 30 s gehalten werden, bevor es wieder anspringen 1 startet ° C / s, bis ein Thema wieder drückt den Knopf des Handheld-Gerät. Kurz vor dem Thermodentemperatur ist im Begriff, wieder zu erhöhen, daran zu erinnern, das Thema, dass dies zu geschehen ist. Dadurch bleibt das Motiv scharfgestellt. </li><li> Diese Sequenz wird solange wiederholt, bis sieben Temperatur Aufnahmen wurden registriert worden sind. Berechnen Sie den Durchschnitt dieser Tempetemperatur Lesungen, das ist die Wärme Schmerzgrenze. </li></ol> Mechanische Schmerz Testing mit Punctuated Drucksonden 1. Einführung <ol><li> Wir verwenden eigens gefertigte kalibriert unterbrochen Drucksonden, weil sie mehr konsistente Ergebnisse als die traditionell verwendeten und kommerziell erhältlich von Frey Haare geben. Probes sind identisch zylindrischen Edelstahl-Drähte (240 Mikrometer Durchmesser) auf Kupfer Stäbe mit unterschiedlichen Gewichten befestigt (1, 2, 4, 8, 16, 32, 49, 64 und 81 Gramm), die Freizügigkeit innerhalb einer breiteren Made Hand- statt Alu-Rohr. </li><li> Die gleichen allgemeinen experimentellen Bedingungen für die Wärme Schmerzen Tests beschrieben gelten für mechanische Schmerzen Tests. Die Probanden sollten gut vorbereitet und geschult. Es ist besonders wichtig, um Themen zu versichern, dass die Sonden stumpf sind und keine Löcher in die Haut. Dies hilft dem Patienten zu entspannen und liefern konsistente Daten. </li></ol> 2. Bestimmung der mechanischen Schmerzschwelle <ol><li> Zur Bestimmung der mechanischen Schmerzschwelle, zuerst das Stahldraht Spitze der leichtesten Sonde senkrecht zur Haut in der Mitte der experimentell entzündeten Läsionen. </li><li> Die Hand-Aluminium-Rohr wird dann in Richtung Haut, ohne es zu berühren gesenkt. So ruht das gesamte Gewicht der Kupferstab in der Aluminium-Rohr auf dem Stahldraht Spitze. </li><li> Die Studie unterliegt dann an, ob die Sonde Schmerzen verursacht, indem Sie &quot;Ja&quot; oder &quot;nein&quot;. </li><li> Wenn das Thema antwortet mit &quot;Nein&quot;, dann entweder die gleiche Sonde oder nächst schwerere Sonde wird als nächstes verwendet werden. Dieser Algorithmus wird als aufsteigender Reihenfolge Stimulation. Zufällig festzustellen, ob die nächste Sonde schwerer oder von demselben Gewicht. Dadurch bleibt ein Thema, geblendet, um den Algorithmus. </li><li> Übernehmen Sie die Sonden in aufsteigender Reihenfolge, bis ein Thema Antworten &quot;Ja&quot;. Das Durchschnittsgewicht der letzten zwei Sonden in dieser Serie ist die erste Umlenkstelle aufgezeichnet. </li><li> Nach dem Thema Antworten &quot;ja&quot;, erst mit einem absteigenden Stimulation Sequenz, und verwenden Sie entweder eine leichtere Sonde oder der gleichen Sonde wie zuvor. Zufällig festzustellen, ob die nächste Sonde leichter oder mit demselben Gewicht. Dadurch bleibt ein Thema, geblendet, um den Algorithmus. </li><li> Apply-Sonden in einer absteigenden Reihenfolge durch, bis das Thema antwortet mit &quot;Nein.&quot; Das Durchschnittsgewicht der letzten zwei Sonden in dieser Reihenfolge die zweite Umlenkpunkt darstellen. </li><li> Wenn das Objekt antwortet mit &quot;Nein&quot;, wieder auf einem aufsteigenden Stimulation Sequenz. Wechseln Sie zwischen aufsteigenden und absteigenden Sequenzen bis sieben Umlenkstellen aufgezeichnet werden. Der Durchschnitt dieser sieben Punkte ist die mechanische Schmerzschwelle. </li></ol>

<ol>
	<li>Angst, M. S., Clark, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comment+on+Koltzenburg+et+al.:+Differential+sensitivity+of+three+experimental+pain+models+in+detecting+the+analgesic+effects+of+transdermal+fentanyl+and+buprenorphine.">Comment on Koltzenburg et al.: Differential sensitivity of three experimental pain models in detecting the analgesic effects of transdermal fentanyl and buprenorphine.</a> Pain. 126, 165-174 (2006).</li><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation,+noxious+stimulation,+and+administration+of+a+COX-inhibitor:+A+microdialysis+study.">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation, and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. , (2008).</li><li>Angst, M. S., Koppert, W., Pahl, I., Clark, J. D., Schmelz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+infusion+of+the+mu-opioid+agonist+remifentanil+in+humans+causes+hyperalgesia+during+withdrawal.">Short-term infusion of the mu-opioid agonist remifentanil in humans causes hyperalgesia during withdrawal.</a> Pain. 106, 49-57 (2003).</li><li>Lotsch, J., Angst, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mu-opioid+agonist+remifentanil+attenuates+hyperalgesia+evoked+by+blunt+and+punctuated+stimuli+with+different+potency:+a+pharmacological+evaluation+of+the+freeze+lesion+in+humans.">The mu-opioid agonist remifentanil attenuates hyperalgesia evoked by blunt and punctuated stimuli with different potency: a pharmacological evaluation of the freeze lesion in humans.</a> Pain. 102, 151-161 (2003).</li></ol>

Dieses Video zeigt Algorithmen zur Beurteilung der thermischen und mechanischen Schmerzschwelle in entzündeter Haut menschlicher Probanden. Die Wahrnehmung von Schmerz ist subjektiv. Sammlung von adäquaten Schmerz-Daten erfordert eine entsprechende Testanlage (zB still und ruhig), eine gründliche Schulung der Teilnehmer der Studie mit in-built-Daten Maßnahmen zur Qualitätssicherung (Test-Retest-Reliabilität), die strikte Einhaltung einer standardisierten Studienprotokoll und die Vermeidung von Störfaktoren (zB Stress, Angst). Zuverlässige Daten über die subjektive Schmerzempfinden, mit Maßnahmen wie die Verabreichung eines Schmerzmittels Droge und die Sammlung von mechanistische Daten wie die lokale Freisetzung von nozizeptiven Mediatoren gepaart bieten wertvolle Einblicke in die Mechanismen des Schmerzes, und die Mittel zu verhindern oder abzuschwächen es.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>TSA-II Neuro Sensory Analyzer</td>
<td>Tool</td>
<td>Medoc Advanced Medical Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Puntuated Pressure Probes</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alternatively, commercially available von Frey Hairs can be used.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

In einem früheren Artikel im Journal of Visualisierte Experiments wir Haut Mikrodialyse Techniken unter Beweis gestellt haben für die Sammlung von Gewebe-spezifische nozizeptiven und entzündlichen Biochemikalien beim Menschen. In diesem Artikel werden wir zeigen, Schmerz-Test Paradigmen, die oft im Tandem mit Mikrodialyse Verfahren verwendet. Die Kombination Schmerz Tests mit Mikrodialyse bietet die entscheidende Verbindung zwischen Verhaltens-und biochemischen Daten, die Ermittlung der wichtigsten Biochemikalien verantwortlich für die Generierung und Verbreitung Schmerzen ermöglicht. Zwei Modelle hervorzurufen Schmerzen in entzündeter Haut menschlicher Probanden gezeigt werden. Das erste Modell erinnert an Schmerzen, die mit Hilfe von Hitze und Verbrennungen. Hitze hervorgerufenen Schmerzen wie hier beschrieben wird überwiegend durch kleine, nicht-myelinisierte periphere nozizeptive Nervenfasern (C-Fasern) vermittelt. Das zweite Modell ruft Schmerzen via unterbrochen Druck Reize. Punctuated Druck evozierte Schmerzen wird überwiegend durch kleine, myelinisierten peripheren nozizeptiven Nervenfasern (A-delta-Fasern) vermittelt. Die beiden Modelle sind mechanistisch unterschiedliche und unabhängig untersuchen nozizeptive Verarbeitung durch die beiden großen peripheren Nervenfasern Populationen in Schmerzen Signalübertragung beteiligt. Wärme Schmerz ist mit Hilfe des TSA II, ein im Handel erhältliches thermo-sensorische Analysator (Medoc Advanced Medical Systems, Durham, NC) hervorgerufen. Stimulus-Konfiguration und Lieferung ist mit Hilfe von spezieller Software bearbeitet. Thermoden variieren in Größe und Form, aber im Prinzip bestehen aus einer Metallplatte, die beheizt oder gekühlt werden kann mit verschiedenen Geschwindigkeiten und für unterschiedliche Zeiträume. Algorithmen Beurteilung Hitze hervorgerufenen Schmerzen sind vielfältig. In den Experimenten gezeigt, hier sind Teilnehmer der Studie gefragt, an welchem ​​Punkt sie anfangen Schmerzen während der Thermode in Berührung mit der Haut mit einer vorbestimmten Rate ab einer Temperatur, die nicht erinnern tut weh erhitzt anzuzeigen. Die Thermode Temperatur, bei der ein Thema beginnt mit Schmerzen stellt die Wärme Schmerzgrenze. Mechanische Schmerz ist mit unterbrochenen Sonden hervorgerufen. Solche Sonden sind im Handel von verschiedenen Herstellern (von Frey Haaren) zur Verfügung. Allerdings hat die Richtigkeit der von Frey Haare kritisiert worden und viele Forscher verwenden custom made unterbrochen Drucksonden. In den Experimenten gezeigt, hier acht maßgeschneiderte unterbrochen Sonden mit unterschiedlichen Gewichten in fortlaufender Reihenfolge angewendet werden, als ein Verfahren up-down-Algorithmus, um Wahrnehmungs-Umlenkstellen, dh ein Wechsel von Gefühl keine Schmerz zu Schmerz zu empfinden oder umgekehrt zu identifizieren. Das durchschnittliche Gewicht verursacht eine Wahrnehmungs-Ablenkung stellt die mechanische Schmerzschwelle.

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Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

Algorithmen Beurteilung Hitze und mechanische Schmerzschwelle bei experimentell entzündete Haut des menschlichen Probanden gezeigt werden. Die beiden Schmerzen Testparadigmen selbständig zu prüfen nozizeptive Verarbeitung durch die beiden großen peripheren Nervenfasern Populationen Übertragung von Schmerzen, dh nicht-myelinisierten C-Fasern und kleine A-delta-Fasern myelinisiert.

Bestimmen Hitze und mechanische Schmerzschwelle in entzündeten Haut von Probanden

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

determining-heat-mechanical-pain-threshold-inflamed-skin-human

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Aufrufe.  Stanford University School of Medicine. Algorithmen Beurteilung Hitze und mechanische Schmerzschwelle bei experimentell entzündete Haut des menschlichen Probanden gezeigt werden. Die beiden Schmerzen Testparadigmen selbständig zu prüfen nozizeptive Verarbeitung durch die beiden großen peripheren Nervenfasern Populationen Übertragung von Schmerzen, dh nicht-myelinisierten C-Fasern und kleine A-delta-Fasern myelinisiert.

Serie: Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Mit Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) zu Diagnose-Tools entwickeln

Forschung

Biologie

Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. The aim of this video-article is to provide the viewer with a step-by-step visual demonstration of skin transplantation using the mouse model. The protocol is divided into 5 main components: 1) harvesting donor skin; 2) preparing recipient for transplant; 3) skin transplant; 4) bandage removal and monitoring graft rejection; 5) helpful hints. Once proficient, the procedure itself should take &lt;10 min to perform.

Allogeneic skin transplantation is a standard model to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. This video-article provides a visual tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&gt;C57BL/6 skin transplant.

Murine Hauttransplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Die Implantation von Engineered Tissue in der Ratte Herz

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis. In some women the severe episodes of cyclic pain change and the resultant pain becomes continuous and this condition becomes known as Chronic Pelvic Pain. This state can be present even after the appropriate medical or surgical therapy has been instituted. It can be associated with pain and tenderness in the muscles of the abdomen wall and intra-pelvic muscles leading to severe dyspareunia. Additional symptoms of irritable bowel and interstitial cystitis are common. A common sign of the development of this state is the emergence of cutaneous allodynia which emerges from the so-called viscero-somatic reflex. A simple bedside test for the presence of cutaneous allodynia is presented that does not require excessive time or special equipment. This test builds on previous work associated with changes in sensation related to gall bladder function and the viscera-somatic reflex(1;2).
The test is undertaken with the subject s permission after an explanation of how the test will be performed. Allodynia refers to a condition in which a stimulus that is not normally painful is interpreted by the subject as painful. In this instance the light touch associated with a cotton-tipped applicator would not be expected to be painful. A positive test is however noted by the woman as suddenly painful or suddenly sharp. The patterns of this sensation are usually in a discrete pattern of a dermatome of the nerves that innervate the pelvis.
The underlying pathology is now interpreted as evidence of neuroplasticity as a consequence of severe and repeating pain with changes in the functions of the dorsal horns of the spinal cord that results in altered function of visceral tissues and resultant somatic symptoms(3). 
The importance of recognizing the condition lies in an awareness that this process may present coincidentally with the initiating condition or after it has been treated. It also permits the clinician to evaluate the situation from the perspective that alternative explanations for the pain may be present that may not require additional surgery.

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

A demonstration of the bedside test for cutaneous allodynia and its clinical implications.

Demonstration von Kutane Allodynie In Vereinigung mit chronischen Unterbauchschmerzen

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis.  In some women the severe episodes of cyclic pain change and the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) von Schwach-Streuung Themen

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut-und-Live-Darstellung von Migration Melanoblasten

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Here we present a method to measure organismal fat levels in the third instar (L3) larval stage of Drosophila melanogaster. This method exploits the comparatively low density of fat tissue to differentiate between larvae with altered fat stores. Buoyancy-based analysis is a valuable tool for rapid, reproducible, and economical screening.

Ein Auftriebskörper-basierte Methode zur Bestimmung Fettwerte in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...