SW und TMV werden durch die NCRR und NHLBI an den National Institutes of Health unterstützt. BSK und HS werden von der NINDS und NIGMS der National Institutes of Health unterstützt.

Experimentelle Verfahren Das experimentelle Verfahren (Abb. 2) besteht aus vier Teilen, die in einer stufenweisen Weise beschrieben werden. Teil 1: Subklonierung und Expression der C-Terminus von P2X2-Rezeptoren. Wir haben die volle Länge C-Terminus von P2X2-Rezeptoren in Bakterien auf das Gehirn Proteine, an die es bindet identifizieren ausgedrückt. <ol><li> Der C-Terminus (Aminosäuren 353-472) des P2X2-Rezeptors (Abb. 1) wurde durch PCR amplifiziert, kloniert in pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) und verifiziert mit Sequenzierung. </li><li> Das rekombinante Plasmid wurde in E. verwandelt Coli (BL21) für die Expression von rekombinanten Proteinen. </li><li> Glycerol Aktien von Bakterien (E. coli BL21) mit dem P2X2 CT-GST-Plasmid wurden mit einer sterilen Pipettenspitze abgekratzt und geimpft in 5 ml Luria-Bertani (LB)-Medium mit geeigneten selektiven Marker (50 g / ml Ampicillin) und über Nacht in einem Schüttler bei 37 ° C inkubiert. </li><li> Die Kulturen angebaut wurden über Nacht in 250 ml LB-Medium mit einem geeigneten Antibiotikum (50 ug / ml Ampicillin) inokuliert und in einem Schüttler bei 250 rpm für 2-3 Stunden bei 37 ° C, bis die optische Dichte bei 600 nm erreicht ~ 0,6-0,7. </li><li> Die Kultur wurde mit 1 mM IPTG induziert und weiter bei 37 ° C für 3 Stunden für die Proteinexpression inkubiert. </li><li> Die Kultur wurde dann bei 5000 g für 15 min bei 4C (1 ml Kultur wurde für die Analyse der Expression gespeichert und gekennzeichnet als &quot;induzierte&quot;) ausgegliedert. Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 20 ml Saline Tris-EDTA (STE)-Puffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0) resuspendiert. </li><li> Die Suspension wurde bei 5000 g für 15 min in einem 50 ml Falcon-Röhrchen geschleudert. Der Überstand wurde verworfen und die halbtrockene Pellet wurde in gefrorenem Zustand bei-70C über Nacht. </li><li> Die 70C-Pellet wurde in 40 ml eiskaltem Lysepuffer (2% (w / v) Sarkosyl, 15 mg Lysozym, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 5 mM DTT und vollständige Protease-Inhibitor-Tablette) resuspendiert , und die Suspension auf Eis für 30 min inkubiert. Während dieser Inkubation wurden 3 ml Glutathion-Sepharose 4B-Kügelchen mit 20 ml Phosphatpuffer Saline (PBS) und 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) TritonX-100 in PBS) von PBS gewaschen. Die Perlen wurden in 1 ml PBS resuspendiert. </li><li> Die Bakteriensuspension wurde 3 mal in flüssigem Stickstoff eingefroren und aufgetaut und beschallt (1s on / off, 30 Mikron für 3 min auf Eis) und weitere 30 min mit 4% (v / v) Triton X-100, 10 mM MgSO inkubiert 4 und 2 mM ATP auf Eis. </li><li> Das Lysat wurde bei 20000 g für 15 min bei 4C und Pellet gesponnen wurde verworfen (eine Probe aus Pellets und 1 ml Überstand wurde für die SDS-Seite gespeichert, die Mengen der Proteine ​​im Cytosol und Membranen-Test). Der Überstand wurde mit den Beads für 1 h (oder über Nacht) bei 4C inkubiert. </li><li> Die Perlen wurden bei 500 g für 5 min zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen (Probe wurde für ungebundene Fraktion gespeichert). Die Perlen wurden mit T-PBS fünfmal (Waschungen wurden für Wasch-Steuerelemente gespeichert) gewaschen. </li><li> Die Perlen wurden dann in PBS resuspendiert zu geben 50% (w / v) Suspension und in Kühlschrank bei 4 ° C bis zur Verwendung. Die Proteinkonzentration wurde nach Bradford (pro Herstellerangaben) geschätzt. </li></ol> Teil 2: Herstellung des gesamten Gehirns Lysaten P2X2-Rezeptoren sind dafür bekannt, reichlich im Gehirn 8 ausgedrückt werden. In der vorliegenden Analyse haben wir versucht, die Proteine ​​interagieren mit P2X2-Rezeptoren aus Ratte ganze Gehirn-Lysaten (Abb. 3) zu identifizieren. <ol><li> Adult Rattenhirn wurde geerntet (Tiere wurden nach einem UCLA IAACUC-genehmigten Protokoll und nach den NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren geopfert) und gespült sofort eiskaltem PBS (3X). </li><li> Um die Zellen zu lysieren 10 ml (~ 5-fache der Nassgewicht geerntet Gehirn) eiskaltem Lysepuffer mit 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM PMSF, 5 ug / ml Leupeptin, wurde 1% (v / v) NP-40, und ein Protease-Inhibitor Cocktail Tabletten, die geerntet Gehirn aufgenommen. </li><li> Hirngewebe wurde auf Eis mit einem Glas-Homogenisator homogenisiert Dounce, bis eine Mischung aus homogene Konsistenz erreicht wurde. </li><li> Zelllysat wurde bei 2000 g für 5 Minuten zentrifugiert, um die ungebrochene Zellen zu entfernen. Der Überstand wurde gesammelt und drehte wieder bei 29000 g für 60 Minuten auf intakte Organellen und Membran Aggregate zu entfernen. </li><li> Unmittelbar nach Zentrifugation wurde der Überstand in ein sauberes Röhrchen übertragen. Die Proteinkonzentration des gesamten Gehirns Lysat wurde durch Bradford-Assay gemessen (in der Regel ~ 15 mg / ml). </li><li> Das Lysat wurde aliquotiert und bei-70C. </li></ol> Teil 3: Isolierung von P2X2 C-tail-assoziierten Proteinen Zur Identifizierung der Bindungspartner von P2X2 CT-GST aus ganzen Gehirn-Lysaten, ein Pull-down-Assay wurde unter Verwendung von CT-G durchgeführtST an Glutathion-Sepharose 4B-Kügelchen als Köder immobilisiert. Für Kontrollen wurde GST allein verpflichtet, Perlen verwendet. <ol><li> Brain-Lysat wurde mit GST Perlen für 1 Stunde bei 4C vorgereinigt. Das Pellet wurde verworfen und der Überstand wurde für weitere Analysen verwendet. </li><li> Gleiche Mengen von GST und P2X2 CT-GST (10 ug) gebunden an Glutathion-Sepharose 4 B Kügelchen wurden über Nacht mit 100 g vorgereinigt solubilisierten Proteine ​​aus Ratte ganze Gehirn Lysat inkubiert, mit der Rotation bei 4 ° C im Lysepuffer. </li><li> Beads wurden bei 1000 g für 5 min zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. </li><li> Die Perlen wurden einmal mit Lysepuffer gewaschen und gekocht in modifizierter Laemli buffer [4% (w / v) SDS, 10% (v / v) 2-Mercaptoethanol, 2% (v / v) Glycerin, 0,004% (w / v) Bromphenolblau und 0,125 M TrisCl pH 6,8] für 5 min. </li><li> Die Proben wurden bei 5000 g für 5 min und der Überstand durch 10% SDS-PAGE (Abb. 4) getrennt gesponnen. Die Gele wurden mit SYPRO Ruby Proteingel Fleck (nach den Anweisungen des Herstellers) und visualisiert unter UV-Licht gefärbt. P2X2 CT-assoziierte Proteine ​​wurden mit denen wieder mit GST-null als Köder verglichen. Vier biologischen Replikaten durchgeführt wurden (dh vier Köpfe und vier unabhängigen Pull-Downs). </li></ol> Teil 4: Identifizierung von Proteinen. Proteine, die durch Gelelektrophorese aufgetrennt wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mittels Massenspektrometrie identifiziert 12 Hinweis:. Abwesenheit von Staub während des gesamten Prozesses ist entscheidend für Keratin Verschmutzung zu reduzieren. Der Versuchsleiter sollte ein Mundschutz getragen werden, Haarnetz und Handschuhe zu allen Zeiten und berühren Sie niemals die Gel-region of interest, ohne die Verwendung von Handschuhen. <ol><li> Alle sichtbaren Proteinbanden aus dem P2X2-Pulldown wieder wurden mit einer Rasierklinge herausgeschnitten und in Würfel geschnitten (Abb. 4). Entsprechenden Regionen des Gels in der GST-null bis Fahrspur ziehen waren auch in der gleichen Weise, ohne Rücksicht auf Band-Färbung (Bands spezifisch für die GST-null Köder wurden ausgeschnitten und identifiziert), um die Anwesenheit von Proteinen unter dem Niveau des versichern herausgeschnitten Färbung Empfindlichkeit war nicht zu übersehen. </li><li> Die Gelstücke wurden mit 200 ul 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat in 50% (v / v) Acetonitril (ACN) und die Rohre für 15 min bei RT inkubiert gevortext. Wiederholen Sie diesen Waschschritt. </li><li> Die Gelstücke wurden entwässert durch Zugabe von 200 ul Acetonitril (Gelstücke sollten schrumpfen und undurchsichtig in Farbe). </li><li> Acetonitril wurde entfernt und die Gelstücke getrocknet in einer Speedvac für ~ 10 min. </li><li> Die Gelstücke wurden dann mit 30 ul der frisch zubereiteten 10 mM DTT/10 mM Tris (2-Carboxy-ethyl) phosphan-Hydrochlorid (TCEP) mit ausreichendem Volumen inkubiert, um die Stücke zu vertiefen. Dies wurde für 30 min bei 56C Wasserbad links. </li><li> Als nächstes wird die DTT-Lösung wurde mit 100 ul 500 mM Ammoniumhydrogencarbonat in 50% Acetonitril-Lösung und das Gel Scheiben mit ammounium Bicarbonat gewaschen ersetzt. </li><li> Die Waschlösung wurde abgesaugt und 200 pl Acetonitril hinzugefügt, um die Gele zu entwässern. </li><li> Acetonitril wurde dann entfernt, und 100 ul frisch zubereiteten 100 mM iodoacetamide Lösung wurde hinzugefügt, um freie Sulfhydryle alkylieren. Dieser Schritt ging für 25 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Iodacetamid Lösung wurde entfernt und die Gelstücke wurden mit 200 ul 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat in 50% Acetonitril (pH 8,0) für 2 min gewaschen, während Vortexen. Dieser Waschschritt wurde wiederholt. </li><li> Nach dem Entfernen der Waschlösung wurden die Gelstücke mit 200 ul Acetonitril, die dann von Speedvac für ~ 10min entfernt wurde, inkubiert. </li><li> Bei diesem Schritt die Gelstücke sind bereit für Trypsinverdauung. Gel Stücke wurden in 30 ul Trypsin-Lösung (20 ng / ul Arbeitskonzentration) inkubiert und auf Eis für 10 min für die Gele auch geschwollen sein. Überschüssiges Trypsin wurde entfernt und rehydriert Gelpartikel mit 30 ul mit 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat überlagert, um sie während der Verdauung, die erlaubt, für 12 bis 16 Stunden bei 37 ° C vor eingetaucht wurde. </li><li> Fünf ul von 5% (v / v) Ameisensäure zugesetzt, um das Trypsin und Verhaftung Verdauung zu deaktivieren. </li><li> Die Röhrchen wurden für ~ 15 min gevortext und kurz zentrifugiert, um die Flüssigkeit auf den Boden der Röhre, die dann zu einer sauberen und beschriftet 0,5 ml Röhrchen überführt zu bringen. </li><li> In den nächsten 30 ul 0,1% (v / v) Ameisensäure in 50% Acetonitril wurde Gelstückchen hinzugefügt, so waren sie nur durch Vortexen zweimal für 10-15 min, getrennt durch kurze Zentrifugation bedeckt gefolgt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt, anstelle der Ameisensäure-Acetonitril zwischen den Schritten. </li><li> Die endgültige Flüssigkeit wurde entfernt und alle Extraktionslösung kombiniert in einer einzigen Flasche. Dieses Volumen wurde auf ~ 30 UL in den Speedvac reduziert. Die Probe wurde nun für Reverse-Phase-nano-Flüssig-Chromatographie und Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie. In diesem konkreten Beispiel wird dieser Schritt auf einer Orbi-Trap-Tandem-Massenspektrometer von ThermoF durchgeführtFinisher (gewählt für seine hohe Masse Genauigkeit, schnelle Einschaltdauer für Protein-Erkennung und generell robust Betriebssystem-Funktionen), obwohl auch andere Modelle und Hersteller &quot;Instrumente leicht konnte mit dem beschriebenen Ansatz zu diesem Punkt gekoppelt werden. </li><li> Die Einzelheiten und Kriterien für die massenspektrometrischen Analysen werden nun kurz vorgestellt. Alle Peptide wurden durch Umkehrphasen-nano-LC (Eksigent) und Peptide wurden auf einer C18 Reverse-Phase-Säule mit einer Flussrate von 3 ml / min geladen getrennt. Mobile Phase A bestand aus 0,1% Ameisensäure und 2% ACN in Wasser; mobile Phase B lag bei 0,1% Ameisensäure und 20% Wasser in ACN. Die Peptide wurden aus der Säule mit einer Flussrate von 220 nl / min mit einem linearen Gradienten von 5% B auf 50% B über 90 min, dann auf 95% B über 5 min eluiert und schließlich konstant zu halten 95% B für 5 min . Die Spektren wurden in Daten-abhängigen Modus mit der Orbi-Falle für MS-Scans und LTQ für MS / MS-Scans verwendet erworben. Die Peptide wurden durch die Suche der Spektren gegen die Ratte IPI Datenbank v.3.53 mit dem SEQUEST Algorithmus in die Bioworks Software-Paket integriert identifiziert. Jedes Peptid die folgenden Kriterien erfüllte: XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (+2), ≥ 4 (+3) und DeltaCN&gt; 0,1. Alle Spektren für Protein-Identifizierung verwendet wurden manuell geprüft und keine Proteine ​​angenommen, wenn weniger als zwei Peptide identifiziert wurden. Nur Proteine ​​nach jeder der vier P2X2 Pull-Downs und abwesend während GST-null Pull-Downs, wurden für weitere Analysen berücksichtigt. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung eines P2X2-Rezeptor-Untereinheit. A. Die Karikatur zeigt die Topologie eines P2X2-Rezeptor-Untereinheit. Die cytosolische Domäne besteht aus N-und C-Termini. Der C-Terminus von P2X2-Rezeptors (rot) wurde als Köder für Pull-down-Assay verwendet. B. Aminosäuresequenz des P2X2-Rezeptors C-Terminus in dieser Studie verwendet. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig2.jpg" alt="" /> Abbildung 2. Flussdiagramm und Zeitachse des Protokolls für die Expression verwendet, Reinigung, Pull-down-und die Identifizierung von Proteinen. Wir zeigen den Umriss des Protokolls mit der Zeitleiste. Adult Rattenhirn Lysat wurde unmittelbar vor Gebrauch herzustellen für den Pull-down-Assays frisch. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig3.jpg" alt="" /> Abbildung 3. Schematische Darstellung der binären Proteomanalyse von P2X2-C-Terminus-Netzwerk im Gehirn der Ratte. Der C-Terminus von P2X2-Rezeptoren mit GST-Protein gebunden GST Perlen geschmolzen wurde für Pull-down-Assays verwendet. Brain-Lysat wurde vorbereitet und Proteine ​​wurden mit den immobilisierten rekombinanten Proteinen inkubiert. Unbound Fraktion wurde mit dem Lysepuffer gewaschen. Die Proteine ​​wurden durch Massenspektrometrie identifiziert. <img src="/files/ftp_upload/1178/Fig%204%20Singh%20et%20al.jpg" alt="" /> Abbildung 4. Identifizierung der Bindungspartner der C-Terminus von P2X2-Rezeptoren. Sypro gefärbten Gel zeigt ein Spektrum von vermeintlichen Proteinen, die mit dem C-Terminus von Rezeptoren mit GST (blauer Kasten) fusioniert zu interagieren. Steuert Fahrspuren für GST alleine (gelber Kasten) und Glutathion-Sepharose-Kügelchen allein sind ebenfalls dargestellt. Die Pfeile zeigen Beispiele der einzigartigen Bands, die für die weitere Analyse durch Massenspektrometrie wurden herausgeschnitten.

<ol>
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Ionenkanäle sind eine wichtige Klasse von integralen Membranproteinen. Sie enthalten Wasser gefüllten Poren, die selektiv erlauben die Bewegung der Ionen bis ihre elektrochemischen Gradienten über die Plasmamembran. Ionenkanäle Tor zwischen offenen und geschlossenen Zuständen. Die Gating Schritt wird durch Sender (z. B. ATP) im Falle von P2X-Liganden gesteuerte Ionenkanäle ausgelöst, oder es kann durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen reguliert werden. Das letzte Jahrzehnt hat eine Erhöhung der unser Verst...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>Reagent</td>
<td>JT Baker</td>
<td>9829-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylamide</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>161-0156</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ampicillin</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR</td>
<td>VW1507-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Bicarbonate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluka</td>
<td>09830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Persulphate (APS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3678</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenosine Triphosphate (ATP)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bradford reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>500-0006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>B-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Commassie blue R-250</td>
<td>Reagent</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>Sc-24972</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotritol (DTT)</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>3860</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR</td>
<td>VW1474-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>E8145</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Formic acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>11670-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutathione Sepharose 4B beads</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-5132-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H1758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>15502</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iodoacetamide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>I1149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luria-Bertani (LB) Media</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>1.00547.5007</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>L8511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>62971</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Sulphate (MgSO4)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Flouride (NaF)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Orthovanadate (Na3VO4)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S6508</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonidet P40</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluka</td>
<td>74385</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease inhibitor tablet</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein standard </td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>161-0305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sarkosyl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Acros</td>
<td>61207</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Screw top vial</td>
<td>Tool</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5182-0866</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4509</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYPRO&#174; Ruby protein gel stain</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>170-3125</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9281</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris base</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Promega</td>
<td>V5111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5927</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water</td>
<td>Reagent</td>
<td>Burdick&Jackson</td>
<td>365-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer</td>
<td>Tool</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nano Liquid Chromatography System</td>
<td>Tool</td>
<td>Eksigent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-Mercaptoethanol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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proteomics to identify proteins interacting with p2x2 ligand-gated cation channels

Liganden-gesteuerte Ionenkanäle unterliegen synaptischen Kommunikation im Nervensystem 1. Bei Säugetieren gibt es drei Familien von Liganden-gesteuerte Kanäle: die Cys-Schleife, die Glutamat-gesteuerten und der P2X-Rezeptor-Kanäle 2. In jedem Fall bindend des Senders führt zur Öffnung einer Pore, durch die Ionen fließen ihres elektrochemischen Gradienten. Viele Liganden-gesteuerte Kanäle sind auch durchlässig für Kalzium-Ionen 3, 4, die stromabwärts Signalisierung haben Rollen 5 (zB Gen-Regulation), dass die Dauer der Kanalöffnung überschreiten darf. So Liganden-gesteuerte Kanäle können über weite Zeitskalen von wenigen Millisekunden bis Tagen Signal. Angesichts dieser wichtigen Rolle ist es notwendig zu verstehen, wie Liganden-gesteuerte Ionenkanäle sich durch Proteine ​​reguliert werden, und wie diese Proteine ​​können tune-Signalisierung. Neuere Studien legen nahe, dass viele, wenn nicht alle Kanäle kann ein Teil des Proteins Signalkomplexe 6 sein. In diesem Artikel erklären wir, wie die Proteine, die an der C-terminalen Aspekte des P2X2-Rezeptors cytosolischen Domäne binden zu identifizieren. P2X-Rezeptoren sind ATP-gated Kationen-Kanäle und bestehen aus sieben Untereinheiten (P2X1-P2X7). P2X-Rezeptoren sind weit verbreitet im Gehirn, wo sie vermitteln exzitatorischen synaptischen Transmission und präsynaptischen Erleichterung der Neurotransmitter Release 7 zum Ausdruck gebracht. P2X-Rezeptoren sind in erregbaren und nicht-erregbaren Zellen gefunden und vermitteln wichtige Rollen in neuronalen Signalübertragung, Entzündungen und Herz-Kreislauf-Funktion 8. P2X2-Rezeptoren sind reichlich im Nervensystem 9 und stehen im Mittelpunkt dieser Studie. Jeder P2X-Untereinheit wird angenommen, dass zwei Membran überspannt Segmente (TM1 und TM2) durch einen extrazellulären Bereich 7 und intrazelluläre N-und C-Terminus (Abb. 1a) 7 getrennt zu besitzen. P2X-Untereinheiten 10 (P2X1-P2X7) zeigen 30-50% Sequenzhomologie auf Aminosäure-Ebene 11. P2X-Rezeptoren enthalten nur drei Untereinheiten, die den einfachsten Stöchiometrie unter ionotropen Rezeptoren ist. Der P2X2-C-Terminus besteht aus 120 Aminosäuren (Abb. 1b) und enthält mehrere Protein-Docking-Konsens Standorten unterstützen die Hypothese, dass P2X2-Rezeptors kann Teil Signalkomplexe werden. Doch obwohl mehrere Funktionen, die C-Terminus von P2X2-Rezeptoren 9 zugeschrieben haben keine Studie hat die molekulare Partner beschrieben, dass einige der intrazellulären Seite des Proteins über die volle Länge C-Terminus. In diesem Verfahren Papier beschreiben wir eine Proteom-Ansatz, um die Proteine, die mit der vollen Länge C-Terminus von P2X2-Rezeptoren interagieren zu identifizieren.

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Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zum Gehirn Proteine, die auf die volle Länge C-Terminus von ATP-gated P2X2-Rezeptoren binden zu identifizieren. Der Ausbau und die systematische Anwendung dieses Ansatzes auf alle P2X-Rezeptoren wird voraussichtlich zu einem besseren Verständnis der P2X-Rezeptor Signalgebung führen.

Proteomics, um Proteine ​​interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

proteomics-to-identify-proteins-interacting-with-p2x2-ligand-gated

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Aufrufe.  David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles. Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zum Gehirn Proteine, die auf die volle Länge C-Terminus von ATP-gated P2X2-Rezeptoren binden zu identifizieren. Der Ausbau und die systematische Anwendung dieses Ansatzes auf alle P2X-Rezeptoren wird voraussichtlich zu einem besseren Verständnis der P2X-Rezeptor Signalgebung führen.

Serie: Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Forschung

Biologie

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and motif position preference1. Each component algorithm is optimized to find a different kind of motif. By taking the best of these three approaches, SCOPE performs better than any single algorithm, even in the presence of noisy data1. In this article, we utilize a web version of SCOPE2 to examine genes that are involved in telomere maintenance. SCOPE has been incorporated into at least two other motif finding programs3,4 and has been used in other studies5-8. 
The three algorithms that comprise SCOPE are BEAM9, which finds non-degenerate motifs (ACCGGT), PRISM10, which finds degenerate motifs (ASCGWT), and SPACER11, which finds longer bipartite motifs (ACCnnnnnnnnGGT). These three algorithms have been optimized to find their corresponding type of motif. Together, they allow SCOPE to perform extremely well.
Once a gene set has been analyzed and candidate motifs identified, SCOPE can look for other genes that contain the motif which, when added to the original set, will improve the motif score. This can occur through over-representation or motif position preference. Working with partial gene sets that have biologically verified transcription factor binding sites, SCOPE was able to identify most of the rest of the genes also regulated by the given transcription factor.
Output from SCOPE shows candidate motifs, their significance, and other information both as a table and as a graphical motif map. FAQs and video tutorials are available at the SCOPE web site which also includes a "Sample Search" button that allows the user to perform a trial run. 
Scope has a very friendly user interface that enables novice users to access the algorithm's full power without having to become an expert in the bioinformatics of motif finding. As input, SCOPE can take a list of genes, or FASTA sequences. These can be entered in browser text fields, or read from a file. The output from SCOPE contains a list of all identified motifs with their scores, number of occurrences, fraction of genes containing the motif, and the algorithm used to identify the motif. For each motif, result details include a consensus representation of the motif, a sequence logo, a position weight matrix, and a list of instances for every motif occurrence (with exact positions and "strand" indicated). Results are returned in a browser window and also optionally by email. Previous papers describe the SCOPE algorithms in detail1,2,9-11.

A straight-forward and robust method to identify potential regulatory motifs in co-regulated genes is presented. SCOPE does not require any user parameters and returns motifs that represent excellent candidates for regulatory signals. The identification of such regulatory signals helps to understand the underlying biology.

Mit SCOPE potenzieller regulatorischer Motive in Coregulated Gene zu identifizieren

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role in a variety of physiologic and disease processes, including early embryogenesis, wound healing 1, inflammation 2, 3, and host defense 4. PGRN also functions as a neurotrophic factor 5, and mutations in the PGRN gene resulting in partial loss of the PGRN protein cause frontotemporal dementia 6, 7. Our recent studies have led to the isolation of PGRN as an important regulator of cartilage development and degradation 8-11. Although PGRN, discovered nearly two decades ago, plays crucial roles in multiple physiological and pathological conditions, efforts to exploit the actions of PGRN and understand the mechanisms involved have been significantly hampered by our inability to identify its binding receptor(s). To address this issue, we developed a modified yeast two-hybrid (MY2H) approach based on the most commonly used GAL4 based 2-hybrid system. Compared with the conventional yeast two-hybrid screen, MY2H dramatically shortens the screen process and reduces the number of false positive clones. In addition, this approach is reproducible and reliable, and we have successfully employed this system in isolating the binding proteins of various baits, including ion channel 12, extracellular matrix protein 10, 13, and growth factor14. In this paper, we describe this MY2H experimental procedure in detail using PGRN as an example that led to the identification of TNFR2 as the first known PGRN-associated receptor 14, 15.

We have modified the conventional yeast two-hybrid screening, an effective genetic tool in identifying protein interaction. This modification markedly shortens the process, reduces the workload, and most importantly, reduces the number of false positives. In addition, this approach is reproducible and reliable.

Modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-System, um Proteine ​​interagieren mit dem Growth Factor Progranulin Identifizieren

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Reverse-Hefe-Zwei-Hybrid-System an Säugetier Nuclear Receptor Rückstände Identifizieren Sie, dass Interagieren Sie mit Liganden und / oder Antagonisten

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that transduce the mechanical energy of sound into an electro-chemical energy processed by the peripheral and central nervous systems. Several proteomic techniques have been developed to study the cochlear inner ear, such as two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE), antibody microarray, and mass spectrometry (MS). MS is the most comprehensive and versatile tool in proteomics and in conjunction with separation methods can provide an in-depth proteome of biological samples. Separation methods combined with MS has the ability to enrich protein samples, detect low molecular weight and hydrophobic proteins, and identify low abundant proteins by reducing the proteome dynamic range. Different digestion strategies can be applied to whole lysate or to fractionated protein lysate to enhance peptide and protein sequence coverage. Utilization of different separation techniques, including strong cation exchange (SCX), reversed-phase (RP), and gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (GELFrEE) can be applied to reduce sample complexity prior to MS analysis for protein identification.

Proteome analysis of the cochlear sensory epithelium can be challenging due to its small size and because membrane proteins are difficult to isolate and identify. Both membrane and soluble proteins can be identified by combining multiple preparative methods and separation techniques along with high-resolution mass spectrometry.

Bottom-up-und Shotgun Proteomics, um eine umfassende Cochlear Proteome Identifizieren

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, differentiation, and proliferation. A comprehensive characterization of these proteins provides rich information for biomarker discovery, cell-type identification, and drug-target selection, as well as helping to advance our understanding of cellular biology and physiology. Surface proteins, however, pose significant analytical challenges, because of their inherently low abundance, high hydrophobicity, and heavy post-translational modifications. Taking advantage of the prevalent glycosylation on surface proteins, we introduce here a high-throughput glycopeptide-capture approach that integrates the advantages of several existing N-glycoproteomics means. Our method can enrich the glycopeptides derived from surface proteins and remove their glycans for facile proteomics using LC-MS. The resolved N-glycoproteome comprises the information of protein identity and quantity as well as their sites of glycosylation. This method has been applied to a series of studies in areas including cancer, stem cells, and drug toxicity. The limitation of the method lies in the low abundance of surface membrane proteins, such that a relatively large quantity of samples is required for this analysis compared to studies centered on cytosolic proteins.

Cell surface proteins are biologically important and widely glycosylated. We introduce here a glycopeptide-capture approach to solubilize, enrich, and deglycosylate these proteins for facile LC-MS based proteomic analyses.

Glycopeptid-Capture für Zelloberflächen Proteomics

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Proteomics, um Proteine ​​interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren

Proteomics, um Proteine interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren