SW e TMV sono supportati dal NCRR e NHLBI presso il National Institutes of Health. BSK e HS sono supportati dal NINDS e NIGMS del National Institutes of Health.

Procedure sperimentali La procedura sperimentale (Fig. 2) si compone di quattro parti che sono descritti in un modo graduale di seguito. Parte 1: subcloning ed espressione del C-terminale del recettore P2X2. Abbiamo espresso tutta la lunghezza C-terminale del recettore P2X2 nei batteri per identificare le proteine ​​del cervello a cui si lega. <ol><li> Il C-terminale (residui 353-472) del recettore P2X2 (Fig. 1) è stato amplificato mediante PCR, clonati in pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) e verificato con il sequenziamento. </li><li> Il plasmide ricombinante è stato trasformato in E. Coli (BL21) per l&#39;espressione di proteine ​​ricombinanti. </li><li> Glicerolo scorte di batteri (E. coli BL21) contenente i P2X2 CT-GST plasmide sono stati raschiati con un puntale sterile e inoculata in 5 ml di Luria-Bertani (LB) con idonei mezzi di comunicazione marcatore selettivo (50 g / ml di ampicillina) e incubato per una notte in un agitatore orbitale a 37 ° C. </li><li> Le culture cresciute overnight sono stati inoculati in 250 ml di media LB con un antibiotico adatto (50 mg / ml di ampicillina) e incubato in un agitatore orbitale a 250 rpm per 2-3 ore a 37 ° C fino a quando la densità ottica a 600 nm raggiunto ~ 0,6-0,7. </li><li> La cultura è stata indotta con 1 mM di IPTG e ulteriormente incubate a 37 ° C per 3 ore per l&#39;espressione della proteina. </li><li> La cultura è stato poi girato a 5000 g per 15 min a 4 ° C (1 ml di coltura è stato salvato per analizzare il livello di espressione ed etichettato come &#39;indotto&#39;). Supernatante è stato scartato e il pellet è stato risospeso in 20 ml di Saline Tris-EDTA (STE) buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0). </li><li> La sospensione è stata filata a 5000 g per 15 minuti in un tubo da 50 ml falco. Il supernatante è stato scartato e la semi-secco pellet è stato congelato a-70C durante la notte. </li><li> I-70C pellet è stato risospeso in 40 ml di tampone di lisi freddo ghiaccio (2% (w / v) sarkosyl, 15 mg di lisozima, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH7.5, 5 mM DTT e completa compressa inibitore della proteasi) , e la sospensione è stata incubata in ghiaccio per 30 min. Durante questa incubazione, 3 ml Glutatione-Sepharose perline 4B sono stati lavati con 20 ml di tampone salino fosfato (PBS) e 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) tritonX-100 in PBS), seguita da PBS. Le perle sono stati risospesi in 1 ml di PBS. </li><li> La sospensione batterica è stata freeze-scongelati 3 volte in azoto liquido e sonicato (1s on / off, 30 micron per 3 minuti in ghiaccio) e ulteriormente incubate per 30 minuti con il 4% (v / v) Triton X-100, 10 mM MgSO 4 e 2 mM ATP sul ghiaccio. </li><li> Il lisato è stato girato a 20000 g per 15 minuti a 4C e pellet è stato scartato (un campione di pellet e 1 ml di surnatante è stato salvato per la pagina di SDS per testare la quantità di proteine ​​nel citoplasma e membrane). Il supernatante è stato incubato con le perline per 1 ora (o tutta la notte) a 4C. </li><li> Le perle erano filata a 500 g per 5 minuti e il supernatante è stato scartato (campione è stato salvato per la frazione non legata). Le perle sono stati lavati con T-PBS cinque volte (lavaggi sono stati salvati per i controlli di lavaggio). </li><li> Le perle sono stati poi risospesi in PBS per dare il 50% (w / v) liquami e conservati in frigorifero a 4C fino al momento dell&#39;uso. La concentrazione delle proteine ​​è stato stimato da Bradford test (per le istruzioni del produttore). </li></ol> Parte 2: Preparazione dei lisati intero cervello P2X2 recettori sono noti per essere abbondantemente espresso nel cervello 8. Nella presente analisi, abbiamo cercato di identificare le proteine ​​che interagiscono con i recettori P2X2 da lisati cervello di ratto suo complesso (Fig. 3). <ol><li> Cervello di ratto adulto è stato raccolto (animali sono stati sacrificati in base ad un protocollo approvato IAACUC-UCLA e secondo la guida NIH per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio) e risciacquati immediatamente ghiaccio PBS freddo (3X). </li><li> Per lisare le cellule da 10 ml (~ 5 volte il peso fresco del cervello raccolte) di tampone di lisi freddo ghiaccio contenente 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM PMSF, 5 mg / ml di leupeptina, 1% (v / v) NP-40, e un inibitore della proteasi tavoletta cocktail è stato aggiunto al cervello raccolto. </li><li> Tessuto cerebrale è stato omogeneizzato su ghiaccio con un omogeneizzatore Dounce vetro fino a una miscela di consistenza omogenea è stato raggiunto. </li><li> Lisato cellulare è stato girato a 2000 g per 5 minuti per rimuovere le cellule ininterrotta. Il surnatante è stato raccolto e girato nuovamente a 29000 g per 60 minuti per rimuovere organuli intatti e aggregati membrana. </li><li> Immediatamente dopo la centrifugazione il surnatante è stato trasferito in una provetta pulita. La concentrazione proteica del lisato intero cervello è stata misurata mediante saggio Bradford (di solito ~ 15 mg / ml). </li><li> Il lisato è stato aliquotati e conservato a-70C. </li></ol> Parte 3: Isolamento di P2X2 C-coda proteine ​​associate Per identificare i partner legame di P2X2 CT-GST da lisati intero cervello, un pull down test è stato eseguito utilizzando CT-GST immobilizzato su glutatione sefarosio perline 4B come esca. Per i controlli, GST solo legati a microsfere è stato utilizzato. <ol><li> Cervello lisato è stato precleared con perline GST per 1 ora a 4C. Il pellet è stato scartato ed il surnatante è stato utilizzato per ulteriori analisi. </li><li> La stessa quantità di GST e P2X2 CT-GST (10 mcg) legato a glutatione sefarosio 4 perle B sono state incubate overnight con 100 g di proteine ​​precleared solubilizzato da lisato cervello di ratto intero, con rotazione a 4C nel buffer di lisi. </li><li> Perline erano filata a 1000 g per 5 minuti e il supernatante è stato scartato. </li><li> Le perle sono stati lavati una volta con il tampone di lisi e bollito in modificata Laemli tampone [4% (w / v) di SDS, 10% (v / v) 2-mercaptoetanolo, 2% (v / v) glicerolo, 0,004% (w / v) bromofenolo blu e 0,125 M TrisCl pH 6,8] per 5 min. </li><li> I campioni sono stati filata a 5000 g per 5 minuti e il surnatante separato del 10% SDS-PAGE (Fig. 4). Gel sono stati colorati con gel SYPRO proteine ​​Rubino macchia (secondo le istruzioni del produttore) e visualizzati sotto luce ultravioletta. P2X2 CT-proteine ​​associate sono stati confrontati con quelli recuperati utilizzando GST-nullo come esca. Quattro repliche biologiche sono state eseguite (cioè quattro cervelli e quattro bassi tirare indipendenti). </li></ol> Parte 4: Identificazione delle proteine. Le proteine ​​separate mediante elettroforesi su gel sono state escisse dal gel e identificati mediante spettrometria di massa 12. Nota: l&#39;assenza di polvere durante il processo è fondamentale per ridurre la contaminazione cheratina. Lo sperimentatore deve indossare una maschera, retina per capelli e guanti in ogni momento e non toccare mai la regione di interesse gel senza l&#39;uso di guanti. <ol><li> Tutte le bande di proteine ​​visibile recuperato dal menu a discesa P2X2 sono stati asportati con una lametta pulita e tagliata a dadini (Fig. 4). Regioni corrispondenti del gel nel GST-pull down nullo corsia sono stati asportati nello stesso modo senza riguardo alle macchie banda (bande specifiche per la GST-esca nulli sono stati asportati e individuati) per assicurare che la presenza di proteine ​​di sotto del livello di sensibilità colorazione non è stato mancato. </li><li> I pezzi di gel sono stati incubati con 200 ml di 50 mM di bicarbonato di ammonio nel 50% (v / v) acetonitrile (ACN) e dei tubi in agitazione per 15 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questa fase di lavaggio. </li><li> I pezzi di gel sono stati disidratati con l&#39;aggiunta di 200 microlitri acetonitrile (pezzi gel dovrebbe restringersi e diventare opaco a colori). </li><li> Acetontrile è stato rimosso ei pezzi gel essiccato in un speedvac per ~ 10 min. </li><li> I pezzi di gel sono state poi incubate con 30 microlitri della preparati al momento 10 mM DTT/10 mM Tris (2-carbossi-etil) cloridrato fosfina (TCEP) del volume sufficiente per immergere i pezzi. Questo è stato lasciato per 30 minuti a bagnomaria 56C. </li><li> Avanti la soluzione digitale terrestre è stato sostituito con 100 l 500 mM di bicarbonato di ammonio in soluzione acetonitrile 50% e le fette di gel lavata con il bicarbonato ammounium. </li><li> La soluzione di lavaggio è stata aspirata e 200 ml di acetonitrile aggiunto a disidratare il gel. </li><li> Acetonitrile è stato poi rimosso e 100 ul preparati al momento 100 soluzione Iodoacetamide mM è stato aggiunto al alchilato sulfhydryls libero. Questo passo ha proceduto per 25 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Soluzione Iodoacetamide è stato rimosso ed i pezzi di gel sono stati lavati con 200 ml di bicarbonato di ammonio 50 mM nel 50% acetontrile (pH 8,0) per 2 minuti, mentre vortex. Questa fase di lavaggio è stata ripetuta. </li><li> Dopo aver rimosso la soluzione di lavaggio, i pezzi di gel sono stati incubati con 200 microlitri acetonitrile che è stato poi rimosso da speedvac per ~ 10 minuti. </li><li> A questo punto i pezzi di gel sono pronti per la digestione tripsina. Pezzi di gel sono stati incubati in 30 microlitri soluzione di tripsina (20 ng / mL concentrazione di lavoro) e messo in ghiaccio per 10 min per i gel di essere ben gonfio. Tripsina in eccesso è stato rimosso e reidratato particelle di gel sovrapposto con 30 microlitri con 50 mM di bicarbonato di ammonio per tenerli immersi per tutta la digestione, che è stato permesso di proseguire per 12 a 16 ore a 37 ° C. </li><li> Cinque microlitri del 5% (v / v) di acido formico viene aggiunto per disattivare la digestione tripsina e l&#39;arresto. </li><li> Tubi erano in agitazione per circa 15 minuti e centrifugati brevemente per portare il liquido sul fondo della provetta che è stato poi trasferito in un pulito ed etichettato 0,5 ml Fiala. </li><li> Prossimi 30 ml di 0,1% (v / v) in acido formico 50% acetonitrile è stato aggiunto a pezzi gel quindi erano appena coperto seguito da vortex due volte per 10-15 minuti, separati per centrifugazione breve. Questo passo è stato ripetuto una volta, in sostituzione del acido formico-acetonitrile tra i passaggi. </li><li> Il liquido finale è stato rimosso e tutte le soluzione di estrazione combinati in un singolo flaconcino. Questo volume è stato ridotto a circa il 30 uL nel speedvac. Il campione è ora pronto per l&#39;inversione di fase nano-cromatografia liquida e l&#39;identificazione delle proteine ​​mediante spettrometria di massa. In questo esempio specifico, questo passo è effettuata su Orbi-trappola spettrometro di massa tandem da ThermoFisher (scelta per la sua accuratezza di massa elevata, ciclo rapido per il rilevamento delle proteine ​​e le caratteristiche di funzionamento in generale robusta), anche se altri modelli e strumenti produttori &#39;potrebbe essere facilmente accoppiato con l&#39;approccio descritto a questo punto. </li><li> I dettagli e criteri per l&#39;analisi di spettrometria di massa sono ora brevemente presentati. Tutti i peptidi sono stati separati da fase inversa nano-LC (Eksigent) e peptidi sono stati caricati su una C18 fase inversa colonna ad un flusso di 3 ml / min. Una fase mobile è stata dello 0,1% di acido formico e 2% ACN in acqua; B fase mobile è stata dello 0,1% di acido formico e il 20% d&#39;acqua in ACN. Peptidi sono stati eluiti dalla colonna ad una portata di 220 nl / min con un gradiente lineare B dal 5% al ​​50% B più di 90 minuti, poi al 95% di B in 5 minuti e, infine, mantenendo costante B del 95% per 5 min . Spettri sono stati acquisiti in data-dependent modalità con le Orbi-trappola usati per le scansioni MS e LTQ per MS / MS scansioni. Peptidi sono stati identificati dalla ricerca gli spettri sul database ratto IPI v.3.53 con l&#39;algoritmo SEQUEST integrato nel pacchetto software Bioworks. Ogni peptide soddisfatto i seguenti criteri: XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (+2), ≥ 4 (+3), e DeltaCN&gt; 0,1. Tutti gli spettri utilizzati per l&#39;identificazione delle proteine ​​sono stati ispezionati manualmente e non proteine ​​accettato quando a meno di due peptidi sono stati identificati. Proteine ​​presenti solo dopo ciascuna delle quattro P2X2 bassi tirare e assente durante GST-nullo tirare bassi sono stati considerati per ulteriori analisi. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Rappresentazione schematica di una subunità del recettore P2X2. R. Il cartone animato illustra la topologia di una subunità del recettore P2X2. Il dominio citosolico è composto da N e C termini. Il C-terminale del recettore P2X2 (rosso) è stato utilizzato come esca per tirare giù saggio. Sequenza di acido B. aminoacidi del recettore P2X2 C-terminale utilizzato in questo studio. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig2.jpg" alt="" /> Figura 2. Diagramma di flusso e la linea del tempo del protocollo usato per l&#39;espressione, la purificazione, tirare verso il basso e l&#39;identificazione delle proteine. Mostriamo il contorno del protocollo con la linea del tempo. Lisato cervello di ratto adulto è stato preparato fresco immediatamente prima dell&#39;uso per il pull down test. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig3.jpg" alt="" /> Figura 3. Rappresentazione schematica delle analisi proteomica binario di P2X2 C-terminale della rete nel cervello di ratto. Il C-terminale del recettore P2X2 fuse con le proteine ​​GST legati a microsfere GST è stato utilizzato per abbattere i test. Cervello lisato è stato preparato e proteine ​​sono state incubate con le proteine ​​ricombinanti immobilizzato. Frazione libera è stato lavato con il tampone di lisi. Le proteine ​​sono stati identificati mediante spettrometria di massa. <img src="/files/ftp_upload/1178/Fig%204%20Singh%20et%20al.jpg" alt="" /> Figura 4. Identificazione di partners vincolante del C-terminale del recettore P2X2. Sypro gel colorato che mostra uno spettro di proteine ​​putative che interagiscono con il C-terminale dei recettori fuse con GST (blue box). Corsie controlli per GST solo (scatola gialla) e glutatione perline sefarosio solo sono mostrati. Le frecce indicano esempi di gruppi unici che sono stati asportati per ulteriori analisi mediante spettrometria di massa.

<ol>
	<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion channels of excitable membranes. , (2001).</li><li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+P2X+receptors+and+ATP+signalling+at+synapses.">Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).</li><li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses.">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).</li><li>Burnashev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+permeability+of+ligand-gated+channels.">Calcium permeability of ligand-gated channels.</a> Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels.">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li><li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+receptors+as+cell-surface+ATP+sensors+in+health+and+disease.">P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease.</a> Nature. 442, 527-532 (2006).</li><li>Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+P2X7+receptor+currents+and+membrane+blebbing+via+constitutive+and+dynamic+calmodulin+binding.">Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding.</a> J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).</li><li>North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+P2X+receptors.">Molecular physiology of P2X receptors.</a> Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).</li><li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+union+of+pharmacology.+XXIV.+Current+status+of+the+nomenclature+and+properties+of+P2X+receptors+and+their+subunits..">International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits..</a> Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).</li><li>Young, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+shape,+architecture+and+size+of+P2X4+receptors+determined+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+electron+microscopy.">Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy.</a> J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).</li><li>Edmondson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+epsilon+signaling+complexes+include+metabolism-+and+transcription/translation-related+proteins:+complimentary+separation+techniques+with+LC/MS/MS.">Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).</li><li>Evans, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthosteric+and+allosteric+binding+sites+of+P2X+receptors.">Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors.</a> Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).</li></ol>

Canali ionici sono una classe importante di proteine ​​integrali di membrana. Essi contengono pori riempiti d&#39;acqua che selettivamente permettono il movimento degli ioni i loro gradienti elettrochimici attraverso la membrana plasmatica. Ion cancello canali tra gli stati aperti e chiusi. Il passo gating è innescato da trasmettitori (es. ATP) in caso di P2X canali ionici ligando gated, o può essere regolata da interazioni con altre proteine. L&#39;ultimo decennio ha visto un aumento della nostra comprensione di ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>Reagent</td>
<td>JT Baker</td>
<td>9829-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylamide</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>161-0156</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ampicillin</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR</td>
<td>VW1507-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Bicarbonate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluka</td>
<td>09830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Persulphate (APS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3678</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenosine Triphosphate (ATP)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bradford reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>500-0006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>B-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Commassie blue R-250</td>
<td>Reagent</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>Sc-24972</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotritol (DTT)</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>3860</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR</td>
<td>VW1474-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>E8145</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Formic acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>11670-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutathione Sepharose 4B beads</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-5132-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H1758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>15502</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iodoacetamide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>I1149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luria-Bertani (LB) Media</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>1.00547.5007</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>L8511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>62971</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Sulphate (MgSO4)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Flouride (NaF)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Orthovanadate (Na3VO4)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S6508</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonidet P40</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluka</td>
<td>74385</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease inhibitor tablet</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein standard </td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>161-0305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sarkosyl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Acros</td>
<td>61207</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Screw top vial</td>
<td>Tool</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5182-0866</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4509</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYPRO&#174; Ruby protein gel stain</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>170-3125</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9281</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris base</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Promega</td>
<td>V5111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5927</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water</td>
<td>Reagent</td>
<td>Burdick&Jackson</td>
<td>365-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer</td>
<td>Tool</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nano Liquid Chromatography System</td>
<td>Tool</td>
<td>Eksigent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-Mercaptoethanol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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proteomics to identify proteins interacting with p2x2 ligand-gated cation channels

Ligando-canali ionici alla base della comunicazione sinaptica nel sistema nervoso 1. Nei mammiferi ci sono tre famiglie di canali ligando-dipendenti: il ciclo Cys, il glutammato-dipendenti ed i canali recettori P2X 2. In ogni caso vincolante del trasmettitore porta alla apertura di un poro attraverso il quale gli ioni scendono i loro gradienti elettrochimici. Molti canali ligando-dipendenti sono permeabili agli ioni calcio 3, 4, che hanno ruoli di segnalazione a valle 5 (regolazione dei geni ad esempio) che possono superare la durata di apertura del canale. Così ligando-dipendenti canali in grado di segnalare su scale temporali di ampia portata da pochi millisecondi a giorni. Alla luce di questi importanti ruoli, è necessario capire come ligando-canali ionici si sono regolati da proteine, e come queste proteine ​​possono regolare segnalazione. Studi recenti suggeriscono che molti, se non tutti, i canali possono far parte di complessi proteina di segnalazione 6. In questo articolo spiegheremo come identificare le proteine ​​che si legano al C-terminale aspetti del settore P2X2 recettore citosolico. Recettori P2X sono ATP-dipendenti canali di comunicazione e composto da sette subunità (P2X1-P2X7). Recettori P2X sono ampiamente espresse nel cervello, dove mediano la trasmissione sinaptica eccitatoria e facilitazione presinaptica di neurotrasmettitori versione 7. Recettori P2X si trovano nelle cellule eccitabili e non eccitabili e mediare ruoli chiave nella segnalazione neuronale, l&#39;infiammazione e la funzione cardiovascolare 8. P2X2 recettori sono abbondanti nel sistema nervoso 9 e sono al centro di questo studio. Ogni subunità P2X è pensato di possedere due segmenti di membrana spanning (TM1 e TM2) separate da una regione extracellulare 7 e intracellulare N e C Termini (Fig. 1a) 7. Subunità P2X 10 (P2X1-P2X7) mostrano omologia di sequenza del 30-50% a livello di aminoacidi 11. Recettori P2X contengono solo tre subunità, che è il più semplice stechiometria tra recettori ionotropici. Il P2X2 C-terminale è composta da 120 aminoacidi (Fig. 1b) e contiene numerose proteine ​​siti consenso docking, supportando l&#39;ipotesi che P2X2 recettore può essere parte di complessi di segnalazione. Tuttavia, anche se diverse funzioni sono state attribuite al C-terminale del recettore P2X2 9 nessuno studio ha descritto i partner molecolari che paio al lato di questa proteina intracellulare attraverso tutta la lunghezza C-terminale. In questo documento si descrivono i metodi di un approccio di proteomica per identificare le proteine ​​che interagiscono con l&#39;intera lunghezza C-terminale del recettore P2X2.

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Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Descriviamo un semplice protocollo per identificare le proteine ​​del cervello che si legano al capolinea pieno C lunghezza di ATP-dipendenti P2X2 recettori. L&#39;estensione e l&#39;applicazione sistematica di questo approccio a tutti i recettori P2X dovrebbe portare ad una migliore comprensione di segnalazione dei recettori P2X.

Proteomica per identificare proteine ​​che interagiscono con P2X2 Ligand-Gated canali di comunicazione

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Views.  David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles. Descriviamo un semplice protocollo per identificare le proteine ​​del cervello che si legano al capolinea pieno C lunghezza di ATP-dipendenti P2X2 recettori. L'estensione e l'applicazione sistematica di questo approccio a tutti i recettori P2X dovrebbe portare ad una migliore comprensione di segnalazione dei recettori P2X.

Proteomica per identificare proteine ​​che interagiscono con P2X2 Ligand-Gated canali di comunicazione

Proteomica per identificare proteine che interagiscono con P2X2 Ligand-Gated canali di comunicazione