Die Autoren danken Herrn Dr. Yangyang Yan im Labor von Dr. Fred Sigworth an der Yale University für die großzügige Spende von HEK293-Zellen, die stabil Ratte Slack-B-Protein exprimieren. Zusätzlich werden die Autoren danken Dr. Sigworth für Kryo-Elektronenmikroskopie Homologiemodell von Slack in dem Video Einführung angezeigt. Diese Forschung wurde von NIH Grants DH067517 und NS073943 zu LKK unterstützt

1. Zellkultur (von Fleming und Kaczmarek 18 Angepasst) <ol><li> Kulturzellen in geeigneten Medien für mehr als 2 und weniger als 10 Durchgänge vor der Verwendung in diesem Test. Nicht transfizierten HEK-293-Zellen und HEK-293-Zellen, die stabil Ratte Slack-B-Protein exprimieren, werden in einer Halb Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium und eine Hälfte Leibovitz L-15-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und Antibiotika, gezüchtet. 500 ug / ml Geneticin (G418) in HEK-293-Zellen stabil exprimiert Slack-B, um die Expression des Gestänges Kanal auszuwählen aufgenommen. Passage-Zellen bei 70-90% Konfluenz durch die Dissoziation von Gerichten mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung. </li></ol> 2. Extrazellulären Matrix (ECM) Beschichtung der TiO 2-384-Well-Platte mit optischen Biosensor Fibronektin und Ovalbumin <ol><li> Vorbereitung der Fibronektin ECM Mischung und Ovalbumin Blockierungslösung <ol><li> Bereiten Sie eine Arbeitslösung fibronectin in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit einer Endkonzentration von 5 ug / ml Fibronektin in 20,0 ml PBS. Von einer 1,0 mg / ml Stammkonzentration, werden 100 ul auf 20,0 ml PBS für einen 200-fachen Verdünnung. Die Arbeitslösung von Fibronektin können aliquotiert und bei -20 ° C gelagert werden, nach der Herstellung. </li><li> Eine 5% ige Stammlösung von hitzeinaktiviertem Ovalbumin in sterilem Wasser. Verdünnen Ovalbumin in sterilen Gewebekultur-Wasser für eine 5% ige Lösung und Wärme-Inaktivierung für 30 min bei 60 ° C Die Lösung wird auf Raumtemperatur und Sterilfilter die Lösung. Aliquot von 5% Ovalbumin-Lösung und bei 4 ° C </li><li> Bereiten Sie eine 2% Arbeitslösung von Ovalbumin durch Verdünnen der 5% Stammlösung in PBS. Fügen Sie beispielsweise 12,0 ml 5% Ovalbumin-Stammlösung auf 18,0 ml PBS für ein Gesamtvolumen von 30,0 ml. </li></ol></li><li> 384er-optischen Biosensor Plattenbeschichtung <ol><li> Hydrat der TiO 2-Platte mit 20,0 ul /steriler Gewebekultur-Wasser für 15 min. Die folgenden Schritte sollten mit einem 16-Kanal-Pipette durchgeführt werden. </li><li> Waschen Sie Platte 1x mit 50,0 ul PBS pro Vertiefung. </li><li> In 20,0 ul der Fibronektin-Arbeitslösung in jede Vertiefung und Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur, um die ECM erstellen. </li><li> Waschen Sie Platte 1x mit 50,0 ul PBS pro Vertiefung. </li><li> In 40,0 ul der Ovalbumin Arbeitslösung in jede Vertiefung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C, um die Platte zu blockieren. </li><li> Waschen Platte 3x mit 50,0 ul PBS pro Vertiefung. ECM-beschichtete Platten können bei 4 ° C für bis zu 48 Stunden gelagert werden. </li></ol></li></ol> 3. Seeding der Zellen auf die 384-Well-Platte Optical Biosensor <ol><li> Entfernen Wachstumsmedium von den Zellen und fügen Trypsin, um die Zellen von der Platte zu entfernen. Sammeln Sie die Zellen und Zentrifugieren bei 1000 g für 1 min. Nehmen Sie die Medien Trypsin und resuspendieren Zellen in Wachstumsmedium. </li><li> Mit einer Zählkammer oder eine automatisierteZellzählers, bestimmen die Konzentration der Zellen. </li><li> Um die Wirkungen der Verdampfung während der Inkubation zu minimieren, werden 50,0 &amp;mgr; l Wachstumsmedium pro Vertiefung eingesetzt werden. Zellen zu verdünnen, um die gewünschte Anzahl von Zellen pro Vertiefung in einem Volumen von 50,0 &amp;mgr; l Wachstumsmedium zu erreichen. Für diese Experimente wurden 1000 Zellen / Vertiefung auf die Biosensor plattiert. </li><li> Ermöglichen, dass die angesiedelten Zellen über Nacht in Wachstumsmedium bei 37 ° C unter Luft / 5% CO 2 inkubiert. </li></ol> 4. Vorbereitung der Biosensor-und Compound-Platten für die RWG optische Biosensor-Assay <ol><li> Die Platte aus dem Inkubator und entfernen Wachstumsmedium von den Zellen. Waschen Sie die Zellen 1x mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). In 25,0 ul HBSS in jede Vertiefung. </li><li> Legen Sie die Platte auf dem Biosensor BIND Scanner und damit die Zellen auf Raumtemperatur für 1-2 Stunden ins Gleichgewicht. </li><li> Bereiten Sie eine separate Verbindung Platte, von der Liganden von Interesse sein wird adauf den Biosensor Platte während des Assays ded. Für diese Tests wurden 25,0 ul einer Lösung, die Verbindung wurde in jede Vertiefung auf dem Biosensor Platte mit einem Gesamtvolumen von 50,0 ul zugesetzt. Als solche wurden die Verbindungen in Lösung in 2x die gewünschte endgültige Konzentration. </li></ol> 5. Führen Sie die RWG optische Biosensor-Assay <ol><li> Nehmen Sie eine Baseline-Messung mit dem Scannersystem für Brunnen A1-P12 (die Hälfte des SBS 384-Well-Platte) mit einer maximalen Auflösung von 3,75 um / Pixel für die zentralen 1,5 mm von jedem gut mit der Scan-Software BIND. Das Baseline-Untersuchung dauert etwa 30 Minuten dauern. </li><li> In 25,0 ul der Verbindung Lösungen in jede Vertiefung für Brunnen A1-P12. </li><li> Nehmen Sie eine Baseline-Messung von Brunnen A13-P24. </li><li> In 25,0 ul der Verbindung Lösungen in jede Vertiefung für Brunnen A13-P24. </li><li> Nehmen Sie einen Beitrag Verbindung zusätzlich Mess für Brunnen A1-P12, und wiederholen Sie für Brunnen A13-P24. </li></ol> 6. Analyse von Assay-Daten mit BIND anzeigen <ol><li> Öffnen Sie die BIND-Assay-Daten für die Baseline-Messung in Windows, und klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Raster-Editor&quot;, um Zellenauswahl zu ermöglichen. Die Software-Metriken von Interesse durch den Benutzer definiert zu berechnen. </li><li> Öffnen Sie die &quot;Plug-Ins&quot;, die den &quot;Cell Finder&quot;-Funktion und &quot;Baseliner&quot; enthalten. Satz Parameter in &quot;Cell Finder&quot;, so dass die Zellen vom Hintergrund des Biosensors sind. </li><li> Exportieren Sie die Zelle Map-Datei, die die Daten &quot;Cell Finder&quot; für die Baseline-Messung enthält. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6,1-6,2 für Post-Verbindung zusätzlich Daten. </li><li> Öffnen Sie die &quot;Baseliner&quot;-Plug-in und importieren Sie die Zelle Karte aus der Bestandsmessung. Die Software wird die Verschiebung in PWV zwischen den Hintergrund-und Post-Verbindung Daten zu berechnen. </li><li> Option &quot;Δ Zell Mittlere&quot; für den Ausgang der Mittelwertverschiebung in PWV für Zellen. Die Daten können dann auf Microsoft Exc exportiert werdenel für die weitere Analyse. </li></ol>

<ol>
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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+diacylglycerol+degradation+to+M1+muscarinic+receptors+by+beta-arrestins.">Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins.</a> Science. 315, 663-666 (2007).</li><li>Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Gribbon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+real-life+high-throughput+screening+data.">Evaluating real-life high-throughput screening data.</a> J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).</li></ol>

Steven M. Shamah ist Mitarbeiter von X-BODY Biosciences.

Die Z prime (Z &#39;)-Faktor ist ein gemeinsame statistische Methode, um die Qualität eines Hochdurchsatz-Screening-Assay 20 quantifizieren und da die Abschirmung der GPCR-Agonisten in diesem Assay erfolgte in einem SBS-kompatiblen 384-Well-Assay bietet eine hervorragende Maß für die Robustheit und Gültigkeit dieser Assay 21. AZ &quot;-Wert von 1 bedeutet eine theoretisch ideale Test mit einer unendlichen Anzahl von Datenpunkten mit nicht vorhandenen Standardabweichungen. AZ &quot;-Wert zwische...

Untersuchung lebender Zellen in ihre physiologisch relevanten Kontext ist entscheidend für das Verständnis der biologischen Funktionen des zellulären Targets. Jedoch Assays die Wechselwirkungen zwischen den Kanälen und regulatorischen cytoplasmatischen Proteine, wie Coimmunpräzipitation Assays Allgemeinen bieten wenig Informationen über den Zeitverlauf von Interaktionen in lebenden Zellen. Die Mehrheit der derzeitigen Assays auf Zellbasis bei einem spezifischen zellulären Ereignis, wie die Translokation eines fluoreszenzmarkierten Proteins von Interesse. Diese Assays erfordern Modifikationen der Proteine ​​von Interesse, die möglicherweise das Verhalten des Proteins zu verändern, und eine Verringerung der physiologischen Relevanz der Ziel kann. Nichtinvasiven zellbasierte Tests, die nicht erfordern Manipulation des Systems, eine kontinuierliche Messung der Zellaktivität und damit Untersuchungen von Zellen in ihrer physiologisch relevanten Zustand 4. Optische Biosensoren sind entworfen, um zu produziereneine meßbare Veränderung einer Eigenschaft des Lichts, das auf die Sensoroberfläche gekoppelt ist. Optische Biosensoren, die evaneszente Wellen verwenden, die Oberflächenplasmonresonanz (SPR) und die Resonanzwellenlänge Gitter (RWG) Techniken umfassen, sind in erster Linie verwendet, um die Affinität und Kinetik der Bindung an Moleküle, deren biologische Rezeptoren auf der Sensorfläche immobilisiert zu erfassen. In jüngerer Zeit, im Handel erhältlich RWG Biosensoren entwickelt worden, um die Erfassung der relativen Masseänderung in dem unteren Abschnitt der Zellen anhaftend an der Sensoroberfläche mit hoher räumlicher Auflösung (bis zu 3,75 &amp;mgr; m / Pixel) 5 ermöglichen. Diese Biosensoren können Änderungen in der Masse in der Nähe der Plasmamembran lebender Zellen, die aus der Stimulation führen, wie z. B. die Zelladhäsion und Ausbreitung, Toxizität, Proliferation und Signalwegen von einer Vielzahl von Zelloberflächenrezeptoren, einschließlich G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) ausgelöst detektieren 6 . RWG Biosensoren erkennen die relative chanGE im Brechungsindex als Funktion der relativen Masseänderung innerhalb von 150 nm des Biosensors 7. Wenn Zellen auf die Biosensor zogen, diese Änderung in dem Brechungsindex spiegelt die Änderung der Masse in der Nähe der Plasmamembran der Zelle, die aus einer Änderung in der zellulären Anhaftung an den Biosensor ergibt. Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis von Kanal-Protein-Wechselwirkungen mit RWG Biosensoren diskutieren. RWG Datenerfassungssysteme bestehen aus mehreren Komponenten. Da der X-BODY BIND Biosciences Scanner wurde für diese Experimente verwendet, sind wir auf die Komponenten für dieses besondere System, das aus einem Plattenlesegerät, verbunden Biosensoren, BIND Scan-Erfassungssoftware und Analyse-Software BIND anzeigen 8 besteht beziehen. Der photonische Kristall Biosensoren, die als optische Biosensoren bezeichnet, sind aus einer periodischen Anordnung aus einem dielektrischen Material und in 2 oder 3 Dimensionen, die die Ausbreitung von Licht in bestimmten verhindertWellenlängen und Richtungen. Photonische Kristallstrukturen sind auf einem Phänomen, das als Holz-Anomalie basiert. Zuerst von Holz 1902 entdeckt, diese Anomalien im Spektrum des Lichtes von optischen Beugungsgittern, wo schnelle Veränderungen in der Intensität eines bestimmten Beugungsordnungen unter bestimmten schmalen Frequenzbändern reflektiert beobachteten Effekte auftreten. Im Jahr 1962 Hessel und Oliner präsentiert eine neue Theorie der Wood-Anomalien in dem begrenzten Zeitraum Gitter erzeugt eine stehende Resonanzwellenlänge 9. In den hier beschriebenen optischen Biosensoren sind Wood-Anomalien verwendet, um einen Biosensor RWG erzeugen, wenn sie mit weißem Licht angeregt reflektiert nur sehr schmalen Band von Wellenlängen (in der Regel zwischen 850 bis 855 nm). Individuelle Biosensoren bestehen aus einem niedrigen Brechungsindex Kunststoff mit einer periodischen Oberflächenstruktur, die mit einer dünnen Schicht des hochbrechenden dielektrischen Material, Titandioxid (TiO 2) beschichtet ist. Wenn die Biosensoder mit einem breiten Wellenlängenlichtquelle, das optische Gitter von photonischen Kristallen reflektiert einen engen Bereich von Wellenlängen von Licht, das mit einem Spektrophotometer in der BIND-Scanner gemessen wird, beleuchtet. Die Peak-Intensität der reflektierten Wellenlängen (Maximum-Wellenlänge Wert oder PWV) wird dann aus dem Signal berechnet. Die PWV Licht Verschiebungen bei einer Änderung des Brechungsindex infolge einer Erhöhung oder Verringerung der Masse in der Nähe (~ 150 nm) der Biosensoroberfläche. Optische Biosensoren werden in einem Standard-Gesellschaft für biomolekulare Wissenschaften (SBS) 384-Well-Mikroplatte für die in diesen Versuchen verwendeten Tests einbezogen. RWV Biosensoren verwendet werden, um Änderungen bei der Zugabe von exogener Signale in lebenden Zellen 10 zu erfassen. Die Zellen werden direkt auf die Oberfläche eines RWG Biosensor kultiviert und die Änderung in der lokalen Brechungsindex ist bei der Behandlung mit spezifischen Stimuli überwacht. Die Richtung der Änderung der Masse an dem Biosensor kannbestimmt, da eine Erhöhung in der örtlichen Brechungsindex ergibt sich aus einer Zunahme der Masse in der Nähe des Biosensors und wird als Zunahme der PWV gemessen. Umgekehrt eine Abnahme der Masse zu einer Senkung des PWV. Die Änderung erfasst PWV können aus zahlreichen zellulären Ereignissen, einschließlich Änderungen bei der Zelladhäsion, Protein-Rekrutierung / release, Endozytose und Recycling, Exozytose, Apoptose und Zytoskelett-Umlagerung führen. Beispielsweise kann der Assay Änderungen Kanal-Protein-Wechselwirkungen zwischen Kaliumkanälen und anderen zytoplasmatischen oder Zytoskelett-Komponenten zu erfassen. Das Ereignis muß jedoch innerhalb des ~ 150 nm Detektionszone in der Nähe des Biosensors auf, und in dem Fall einer Zelle befestigt, in der Nähe der Plasmamembran. Akquisition von zellulären Antworten mit BIND Scan-Software durchgeführt, und eine Bilddarstellung von jeder der Vertiefungen 384 in dem SBS-Platte erzeugt wird. Dieses System hat eine Auflösung von bis zu 3,75 um / Pixel, was die Detektion von Ereignissen in einzelnen Zellen undentweder mit Zelllinien (wie HEK293 oder CHO-Zellen) oder mit physiologisch relevanten Primärzellen verwendet werden. Bildanalyse-Software BIND Ansicht erlaubt den Nachweis von zellulären Reaktionen in Einzel-und Zellpopulationen. Wie die Biosensoren sind in Standard-SBS 384-Well-Mikroplatten eingearbeitet, ist das System leicht an Hochdurchsatz-Screening (HTS). Resonanz-Wellenlängengitter optische Biosensoren sind zuvor verwendet worden, um Änderungen in der Masse in der Nähe der Plasmamembran von Zellen nachzuweisen nach Aktivierung von GPCRs 11. Unser Labor hat zwei Natrium-aktiviert (K Na) Kaliumkanäle, Slack-B und Slick 12 geklont. Die Aktivität beider Slack-B-Kanäle und Slick hat sich gezeigt, sehr stark durch direkte Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) 13 beeinflusst werden. Aktivierung von G &amp;agr; q-Protein-gekoppelten Rezeptoren, wie die Muscarin M1 Rezeptors und der mGluR1 metabotropen Glutamat receptor, potent regelt Kanalaktivität durch PKC-Aktivierung. Diese K-Na-Kanäle, um neuronale Anpassung beitragen bei anhaltender Stimulation und regulieren die Genauigkeit der Zeitpunkt der Aktionspotentiale 14. Slack Kanäle sind dafür bekannt, mit einer Vielzahl von Zytoplasma-Signalmoleküle, einschließlich FMRP, der Fragile X Mental Retardation Protein 15,16 interagieren. Mutationen in Slack Ergebnis in Multiple Migration Partielle Anfälle von Kindheit (MMPSI), ein frühes Einsetzen Form der Epilepsie, die zu schweren Entwicklungsverzögerung 17 führt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Geneticin G-418 Sulfate</td>
			<td style="width:172px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB05057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">HBSS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DPBS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Carbamoylcholine chloride</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Finnpipette (5-50 &#181;l)</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4662090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIND Scanner System</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384-well TiO2 coated plates</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">TiO-96-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of label-free optical biosensors to detect modulation of potassium channels by g-protein coupled receptors

Ionenkanäle steuern die elektrischen Eigenschaften von Neuronen und anderen Zelltypen erregbar durch selektives lonen durch die Plasmamembran 1 zu fließen. Neuronale Erregbarkeit Regelung sind die biophysikalischen Eigenschaften von Ionenkanälen von Signalproteinen und Moleküle, die häufig zu den Kanälen selbst binden, um einen heteromeren Komplex 2,3 Kanal bilden modifiziert. Traditionellen Tests die Wechselwirkungen zwischen den Kanälen und regulatorische Proteine ​​erfordern exogene Markierungen, die möglicherweise das Verhalten des Proteins zu verändern und eine Verringerung der physiologischen Relevanz der Ziel können, während sie nur wenig Informationen über den Zeitverlauf von Interaktionen in lebenden Zellen. Optische Biosensoren, wie der X-BODY BIND Biosciences Scanner-System, verwenden Sie eine neue Label-freie Technologie, Resonanzwellenlänge Gitter (RWG) optische Biosensoren, um Änderungen in der Resonanz erkennen reflektierte Licht in der Nähe des Biosensors. Dieser Assay ermöglicht die Detektion der relativenMassenänderung in dem Bodenabschnitt des lebenden Zellen anhaftend an der Biosensoroberfläche aus Ligand induzierte Veränderungen in der Zelladhäsion und Ausbreitung, Toxizität, Proliferation und Änderungen bei Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Nähe der Plasmamembran resultiert. RWG optische Biosensoren verwendet worden, um Änderungen in der Masse in der Nähe der Plasmamembran von Zellen nachzuweisen folgenden Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), Rezeptor-Tyrosinkinasen und andere Zelloberflächenrezeptoren. Ligand-induzierten Änderungen der Ionenkanal-Protein-Wechselwirkungen können auch in diesem Test untersucht werden. In diesem Aufsatz werden wir die experimentelle Verfahren verwendet, um die Modulation der Slack-B Natrium-aktivierten Kalium (K Na) Kanäle durch GPCRs erkennen beschreiben.

Slack-B stabil transfizierten HEK-293-Zellen und steuern nicht transfizierten HEK-293-Zellen wurden bei 1.000 Zellen / Well auf 384-Well-, ECM-beschichteten RWG Biosensor-Platten ausgesät. Bilder von der zentralen 1,5 mm 2 des Biosensors bei einer Auflösung von 3,75 &amp;mgr; m / Pixel (Fig. 1) aufgezeichnet. Dichte Gradienten Karten von Massen erzeugt wurden vor und 30 min nach Zugabe der Verbindung mit der Scan-Software BIND. Die BIND-View-Software wurde verwendet, um die Verschiebung der...

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Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Optische Biosensor-Techniken können Massenänderungen in der Nähe der Plasmamembran in lebenden Zellen erkennen und erlauben es, zelluläre Reaktionen in beiden Einzelzellen und Zellpopulationen zu folgen. Dieses Protokoll wird die Detektion der Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in intakten Zellen unter Verwendung dieses Ansatzes zu beschreiben.

Verwenden von Label-freien optischen Biosensoren zur Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren erkennen

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Aufrufe.  Yale School of Medicine.  Optische Biosensor-Techniken können Massenänderungen in der Nähe der Plasmamembran in lebenden Zellen erkennen und erlauben es, zelluläre Reaktionen in beiden Einzelzellen und Zellpopulationen zu folgen. Dieses Protokoll wird die Detektion der Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in intakten Zellen unter Verwendung dieses Ansatzes zu beschreiben. 

Serie: Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

Anbringen biologischen Sonden zur Silica Optische Biosensoren Mit Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Forschung

Biotechnik

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Ein Markierungsfreie Technik für die Raum-zeitliche Imaging von Single Cell Sekrete

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations and development of microstructurally motivated mathematical models for understanding the mechanical properties of human resistance arteries in health and disease have the potential to aid understanding how disease and medical treatments affect the human microcirculation. To develop these mathematical models, it is essential to decipher the relationship between the mechanical and microarchitectural properties of the microvascular wall. In this work, we describe an ex vivo method for passive mechanical testing and simultaneous label-free three-dimensional imaging of the microarchitecture of elastin and collagen in the arterial wall of isolated human resistance arteries. The imaging protocol can be applied to resistance arteries of any species of interest. Image analyses are described for quantifying i) pressure-induced changes in internal elastic lamina branching angles and adventitial collagen straightness using Fiji and ii) collagen and elastin volume densities determined using Ilastik software. Preferably all mechanical and imaging measurements are performed on live, perfused arteries, however, an alternative approach using standard video-microscopy pressure myography in combination with post-fixation imaging of re-pressurized vessels is discussed. This alternative method provides users with different options for analysis approaches. The inclusion of the mechanical and imaging data in mathematical models of the arterial wall mechanics is discussed, and future development and additions to the protocol are proposed.

We describe simultaneous mechanical testing and 3D-imaging of the arterial wall of isolated, live human resistance arteries, and Fiji and Ilastik image analyses for the quantification of elastin and collagen spatial organization and volume densities. We discuss the use of these data in mathematical models of arterial wall mechanics.

Bewertung von Kollagen und Elastin druckabhängige Mikroarchitekturen in Leben, menschlichen Widerstand Arterien durch markierungsfreie Fluoreszenz-Mikroskopie

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...