Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Graduate Research Fellowship an SK und National Institutes of Heath gewähren R01EB008722 unterstützt.

A. Material Vorbereitung und Sterilisation <ol><li> Vor der Vorbereitung Verkapselungsmaterialien, bereiten eine 0,5% ige Lösung des Photoinitiators Irgacure 2959 (I2959) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), die durch Mischen und Inkubation für mehrere Tage bei 37 ° C. Die Lösung kann dann Spritze gefiltert zur Sterilisation und Lagerung bei Raumtemperatur für langfristigen Einsatz sein. </li><li> Basierend auf der gewünschten Zusammensetzung der Gele synthetisiert werden, berechnen (mit einem Tabellenkalkulationsprogramm wie Microsoft Excel) das Gewicht von Polymer und Vernetzer benötigt. Weil ein gegebenes Gewicht des Polymers in einem definierten Volumen auf eine gewünschte Konzentration in den Hydrogelen, der Vernetzer und Polymerlösung Teile des gesamten Gel-Volumen zu erreichen aufgelöst sind, ist auch anhand der Tabelle sein. Ähnliche Berechnungen sollte erfolgen, wenn alle Anhänger-Einheiten (z. B. ein Klebstoff RGD oder YGSR mit Oligopeptid) vor der Vernetzung mit einbezogen werden sollen. </li><li> Wiegen Sie die benötigte Menge an Polymer und Vernetzer und Platz in Eppendorf-Röhrchen. Stellen Sie die Berechnung Tabellenkalkulation entsprechend für das tatsächliche Gewicht des Polymers. (Hinweis: Die Bände können geändert werden, um für die eigentliche Masse des Polymers und Vernetzer erhalten zu kompensieren). </li><li> Bereiten Gelformen mit einer Rasierklinge zu den Spitzen abgeschnitten von einzeln verpackt sterile 1 ml Einwegspritzen. Stellen Sie sicher, einen flachen Schnitt ist für Formen für photostrukturierten Gele einsetzbar zu machen. </li><li> Legen Sie die Spritze Formen, Eppendorf-Röhrchen (mit Deckeln offen) und alle anderen benötigten Materialien unter einer keimtötende Lichtquelle (in der Regel in biologische Sicherheitswerkbänke gebaut) und sterilisieren für 30 Minuten. </li></ol> B. Cell Preparation <ol><li> Nach der Sterilisation, fügen Sie die entsprechende sterile Puffervolumen (pro Tabellenkalkulation, während die Wahl der Puffer kann variieren, PBS und einer schwachen Base-Puffer wie Triethanolamin sind in der Regel für freie Radikale und Michael-Vernetzung, bzw. verwendet), um das Polymer Eppendorf und (optional) Anhänger Einheit einbezogen werden (zB Kleber-Peptid) und Vortex zu lösen (wenn Vortexen außerhalb des sterilen Haube wickeln die Eppendorf mit Parafilm). </li><li> Fügen Sie die entsprechenden Volumen des Anhängers Einheit Lösung für die Polymer-Lösung und wickeln Sie die Dichtung mit Parafilm. Kurz vortexen und bei 37 ° C zu reagieren (wenn möglich, auf einem rotierenden Rührplatte) während der Zellteilung Vorbereitung. Dies beinhaltet die Reaktion eines Thiols auf ein Peptid (via Cystein-Gruppe), um ein Acrylat oder Methacrylat, so dass das Peptid als Anhänger Gruppe in den letzten Hydrogel enthalten ist. </li><li> Trypsinize und zählen Zellen und trennen sich in Portionen mit der entsprechenden Anzahl für jede Gruppe von Gelen. Zum Beispiel für einen Satz von drei 50 ul Gele bei einer Dichte von 10 Mio. Zellen / ml, separate 1,5 Millionen Zellen in ein individuelles konischen Rohr. Es wird empfohlen, nicht mehr als 4 Gele in ein individuelles Set aufgrund des Zeitpunkts der Gelierung (Hinweis: Wenn die Synthese mehrerer Gruppen von Gelen, einem Eppendorf, das eine ausreichende Menge von Polymer-Lösung für alle Sets hergestellt werden) hergestellt werden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen. </li><li> Während Zellen zum Stillstand <ol class="lalpha"><li> Licht initiierte radikalische Vernetzung: add 0,5 Gew.% I2959 Lösung für die Polymer-Lösung in Höhe von 10% der gesamten Gel eingestellte Lautstärke (für eine endgültige Initiator-Konzentration von 0,05 wt%). </li><li> Michael-Typ (zusätzlich) Vernetzung: add Puffer, um die Vernetzer auf die geeignete Konzentration Lösung zu erreichen. </li><li> Für sequentielle Vernetzung: diese Gele enthalten beide Arten von Vernetzung und erfordern die beiden vorherigen Schritte. </li></ol></li></ol> C. Hydrogelbildung <ol><li> Saugen Sie den Überstand der zentrifugierten Zelle Teil. Warten Sie, bis Flüssigkeit nach der ersten Aspiration und wieder absaugen niederlassen, um so viel Medien wie möglich ohne Unterbrechung das Zellpellet zu entfernen. </li><li> Zellpellet mit der Polymerlösung, bis die Zellen gleichmäßig verteilt sind. Minimieren Blasenbildung durch langsames Pipettieren der Lösung nach oben und unten (ca. 10 Zyklen sollte ausreichen, um Zellen zu verteilen). </li><li> Die Vernetzung Hydrogele <ol><li> Licht initiierte radikalische Vernetzung: Aliquot das entsprechende Volumen in Spritzenspitze Formen. Expose die Spritzen mit UV-Licht für radikalische Vernetzung (z. B. 10 Minuten Exposition gegenüber 365 nm, 4 mW/cm2 UV-Licht für Acrylat-funktionalisierten Polymeren üblich). Dieser Schritt sollte zügig durchgeführt werden, um zu minimieren Zelle Abrechnung vor UV-Licht ausgesetzt. </li><li> Michael-Typ (zusätzlich) Vernetzung: Mit einer breiten Öffnung Pipettenspitze, fügen Sie die entsprechende Volumen der Vernetzer-Lösung, um das Polymer / Zell-Lösung, setzen Sie die Pipette auf die gewünschte individuelle Gelvolumen, Pipette die Lösung auf und ab, umhomogenisieren und Aliquot in die Spitze der Spritze Formen. Dieser Schritt sollte zügig durchgeführt werden, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Lassen Sie 10-30 Minuten (abhängig von der individuellen System) Inkubation in der Kultur Haube für die Vernetzung. </li><li> Sequential Vernetzung: Dies beinhaltet die Michael-Addition und dann Kontakt mit der zweiten Vernetzung Licht. Nur ein Bruchteil der theoretischen Vernetzungen sollten während der ersten Vernetzung zur Reaktion gebracht werden und dann eine sterile Maske sollte direkt auf das Gel aufgetragen vor der Belichtung mit sterilisierten Pinzetten werden. Ein funktionalisierten Farbstoff (zB methacrylierte Rhodamin (MeRho) in einer Endkonzentration im Gel von 20 nM) kann auch für die ursprüngliche Lösung für die Strukturierung visualisieren hinzugefügt werden, da es bevorzugt wird einzuarbeiten radikal vernetzten Regionen des Gels (Abbildung 2 ). </li></ol></li></ol> D. Cell Culture and Analysis <ol><li> Nach Vernetzung stürzen Gele in die Vertiefungen einer Gewebekultur Platte mit Medien für die Inkubation und Analyse (siehe folgende Schritte). </li><li> Die Zellen können visualisiert werden für Morphologie mit Hilfe von Licht-Mikroskopie (Abbildung 3; typischerweise synthetisiert werden Hydrogele transparent) und die Lebensfähigkeit mit einem fluoreszierenden Live / Dead Färbekit (Abb. 3 und 4). Die Färbung der zellulären Aktin (zB Rhodamin oder Fluorescein Phalloidin) und Kerne (z. B., 4&#39;-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) kann mit Standard-Fixierung und Permeabilisierung Verfahren (Abbildung 4) mit dem folgenden Verfahren werden. <ol class="laplha"><li> Spülen Konstrukte 3x für 5 min mit PBS. </li><li> Fix Gele durch Inkubation in 1 ml 4% Formaldehyd für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Konstrukte 3X mit Blocking-Lösung mit 3% (w / v) BSA und 0,5% (w / v) Tween in PBS. </li><li> Permeabilisieren Membran mit 0,25% (w / v) Triton X in Blocking-Lösung für 20 min. </li><li> Spülen Konstrukte 3X mit Blocking-Lösung. </li><li> Stain für F-Aktin mit 0,66 ug / ml FITC oder Rhodamin-Phalloidin in Blocking-Lösung für zwei Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie 3x mit Blocking-Lösung. </li><li> Stain Zellkernen mit 0,4 ul / ml DAPI in PBS für 20 min. </li><li> Spülen Sie 3X mit PBS. </li><li> Visualisieren Sie Zellen mit epifluoreszenten oder konfokalen Mikroskopie. </li></ol></li><li> Proliferation von Zellen in Gelen wird allgemein beurteilt Verwendung von kommerziell erhältlichen Assays (zB Gesamt-DNA oder biochemische Inhalt). PicoGreen ist eine häufig verwendete und empfindliche fluoreszierende Nukleinsäure Fleck für die Quantifizierung von doppelsträngigen DNA (Singer et al.). Zellen können auch gezählt werden und normalisiert, um eine erste Kontrolle Nummer über die Visualisierungs-Methoden in Schritt 2 beschrieben. </li><li> Histologische Schnitte und Färbung kann auch dazu verwendet, um Zellen zu visualisieren und zu gebildet Matrix. Das folgende Protokoll für die Dehydratisierung und Schneiden von 3D-Hydrogele verwendet werden, um Querschnitts-Scheiben auf Glasplättchen zu erhalten: <ol class="lalpha"><li> Fixation und Entwässerung <ol class="lroman"><li> Rinse Probe 3X in PBS. </li><li> Fix für 5 bis 30 Minuten in 4% Paraformaldehyd. </li><li> Rinse Probe 3X in PBS. </li><li> Inkubieren Sie die Probe in EtOH bei 25 ° C für 1 Stunde bei jeder der folgenden EtOH (v / v)-Konzentrationen in Wasser (in Reihenfolge): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (An dieser Stelle Proben kann über Nacht bei 25 ° C gelagert werden). </li></ol></li><li> Clearing und Infiltration <ol class="lroman"><li> Transfer zum 100% Citrisolv für 1 Stunde bei 25 ° C, um eine Stunde bei 65 ° C. </li><li> Cut-Proben in zwei Hälften mit einer Rasierklinge in einer Petrischale, so dass der Querschnitt der Probe ausgesetzt ist. </li><li> Transfer zum 1:1-Gemisch aus Citrisolv / Micro-cut Paraffin für 1 Stunde bei 65 ° C. </li><li> Transfer zum 100% Micro-cut Paraffin für 1 Stunde bei 65 ° C. </li><li> Transfer zum 100% Micro-cut Paraffin über Nacht bei 65 ° C. </li><li> Transfer zum 100% Micro-cut Paraffin für 1-2 Stunden bei 65 ° C. </li></ol></li><li> Embedding <ol class="lroman"><li> Position Probe in peel-away Form mit 100% Paraffin. </li><li> Legen Sie eine kleine Menge Wachs in Form Bett, und legen Sie die beiden Hälften der Probe mit dem Querschnitt nach unten. </li><li> Bewerben Aufsatzfilter Stück <ol><li> Fügen Sie zusätzliche Wachs zu tauchen das Oberteil und erhärten lassen für ~ 10 Minuten. </li></ol></li><li> Transfer-Einsätze bis 4 ° C Kühlschrank, damit Probe zu verhärten über Nacht. </li><li> Probe kann Abschnitt werdened am nächsten Tag, in der Regel bei 5-10 mu m Dicke pro Scheibe mit handelsüblichen Mikrotome. Typischerweise ist die Peel-away Form wird vertikal gegen die Mikrotom Bühne montiert und manuelle Kontrollen dienen dazu, die Schnittdicke, Schneidemaschine und Ausrichtung der Probe mit der Klinge gesetzt. </li></ol></li><li> RNA-Extraktion Die Genexpression kann auch quantitativ bewertet werden (zB über real-time Polymerase-Kettenreaktion (PCR)). Das Protokoll für die RNA-Extraktion aus 3D-Hydrogele, von denen ein Beispiel nachstehend wiedergegeben ist, ist ganz anders als die viel einfacher 2D-Fall. <ol class="lroman"><li> Beschriften Sie eine zertifizierte RNAse freien Eppendorf-Röhrchen für jeden 3D-Hydrogel und fügen 500 mL Trizol ®-Reagenz in jedes Röhrchen. </li><li> Verwenden Sie einen Stößel (tissue Schleifer) manuell zu mahlen die Hydrogele, bis eine klare Lösung erhalten wird. Stellen Sie sicher, verschiedene Mühlen sind für jede Bedingung verwendet. </li><li> Vortex jedes Eppendorf für 20 Sekunden zu homogenisieren die Proben. </li><li> Inkubieren Proben bei Raumtemperatur für fünf Minuten in Anspruch Dissoziation Nukleoproteinkomplexe ermöglichen. </li><li> Coole Proben auf Eis für 20 min </li><li> Geben Sie 200 ul (pro ml Trizol) Chloroform zu jeder Probe und vortexen. </li><li> Inkubieren Proben bei Raumtemperatur für fünf Minuten. </li><li> Centrifuge Proben bei 12.000 xg bei 4 ° C für 15 min. </li><li> Übertragen Sie die wässrige Phase (klare obere Schicht), um neue Eppendorf-Röhrchen (Vermeidung von Grenz-Region und eine untere rote Phenol-Chloroform-Phase). RNA bleibt in der klaren wäßrigen Phase. </li><li> Gemeinsame Verfahren zur RNA-Isolierung und-speicherung kann nun verwendet werden. </li><li> Nach RNA-Extraktion, kommerziell erhältlichen Kits für Reverse-Transkriptase-und real-time PCR werden oft mit einigen Modifikationen (Elisseff et al. Strehin et al.) Verwendet. </li></ol></li></ol></li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Siehe Abbildungen 2-4 (wie in der oben genannten Protokolle verwiesen) für repräsentative Ergebnisse der Visualisierung von photostrukturierten Hydrogele und Verkapselung von Zellen in Gelen. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig1_2.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Übersicht über die 3D-Kapselung Verfahren. Diagramm Schritte zum Abschnittstitel in der schrittweisen Protokolle entsprechen. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Photostrukturierbare Hydrogel mit sequentieller Michael-Addition dann radikalische Polymerisation. (A) Schematische Darstellung der Photostrukturierungsverfahren eines partiell vernetzten Hydrogel mit Einbau eines Foto Reaktivfarbstoff. (B) Circle oder (C) Streifen Transparenz Filmmaske Hyaluronsäure Hydrogele gemustert. Methacrylierte Rhodamin (MeRho) ist nur in Regionen des Gels, die dem Licht ausgesetzt wurden eingearbeitet. Maßstabsbalken = 100 um. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Visualisierung von Zellen in 3D-Hydrogele. Stammzellen visualisiert via (a) Lichtmikroskopie oder (b) leben (grün, Calcein AM) und tote (rot, Ethidium Homodimer-1)-Färbung von 24 Stunden nach Verkapselung bei 1 Mio. Zellen / ml in einem Hyaluronsäure-Hydrogel durch ein Licht vernetzt initiiert radikalischen Mechanismus. Maßstabsbalken = 100 um. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Visualisierung von Zellen in 3D-Hydrogele. hMSCs für (a) lebende Zellen (Calcein AM) oder (b) zelluläre Aktin (Rhodamin-Phalloidin) und Kerne (DAPI) fünf Tagen nach Verkapselung bei 1 Mio. Zellen / ml in einem Hyaluronsäure-Hydrogel durch eine Michael-Mechanismus vernetzt gefärbt ( mit Anhänger Klebstoff Peptiden und bifunktionellen proteolytisch abbaubar Peptid Vernetzer). Maßstabsbalken = 100 um.

<ol>
	<li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation.">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).</li><li>Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Responsive+Synthetic+Hydrogels.">Cell-Responsive Synthetic Hydrogels.</a> Adv Mater. 15, 888-892 (2003).</li><li>Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Photoencapsulation+in+Hydrogels.">Cellular Photoencapsulation in Hydrogels.</a> Culture of Cells for Tissue Engineering. , (2006).</li><li>Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+auricular+chondrocyte+expansion+on+neocartilage+formation+in+photocrosslinked+hyaluronic+acid+networks.">Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks.</a> Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).</li><li>Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+microenvironments+for+controlled+stem+cell+differentiation.">Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).</li><li>Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Mode+Thiol-Acrylate+Photopolymerization+for+the+Synthesis+of+PEG-Peptide+Hydrogels.">Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels.</a> Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-responsive+hydrogel+for+encapsulation+of+vascular+cells.">Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells.</a> Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).</li><li>Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+ECM+Production+by+Cells+Encapsulated+in+Hydrogels.">Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels.</a> Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).</li><li>Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+crosslinking+to+control+cellular+spreading+in+3-dimensional+hydrogels.">Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels.</a> Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).</li></ol>

Die beschriebenen Protokolle stellen eine einfache und kraftvolle Methode, um Zellen in Hydrogel Gerüste in einem cytocompatible Weise kapseln. Solche Techniken sind besonders wichtig, da ausdifferenzierten und Stammzellen können deutlich unterschiedliche Verhalten in 2D versus 3D Mikroumgebungen aufweisen. Selbst für therapeutische Ansätze, die die Implantation von Materialien (z. B. in situ Radikalpolymerisation), der Verkapselung von Zellen und Analysen für die Lebensfähigkeit und die Differenzierung in der materiellen Entwicklung Prozess zu helfen. Die beschriebenen sequentiellen Verfahren lassen sich räumlich zu manipulieren das Hydrogel Umwelt, und damit zelluläre Verhalten (siehe Khetan et al.). Insgesamt ist das wichtigste Element der beschriebenen Protokolle der Homogenität aller Lösungen verwendet. Insbesondere ist besondere Vorsicht geboten, um sicherzustellen, Zellen gleichmäßig in der Präpolymerlösung verteilt, und dass die Lösung gut gemischt mit einer Pipette Resuspension nach Zugabe der Vernetzer-Lösung sein. Wird auf diese sicherstellen können, um von Zellen oder lokale Variationen in Gelstruktur und Schwellungen Verklumpung führen. Während die Protokolle hier vorgestellten konzentrieren sich vor allem über das Verfahren zur Verkapselung von Zellen, ist es wichtig, auch beachten, dass die Verkapselung eine gewisse Anpassung der Analyse-Protokolle, die typischerweise für 2D-Seeding geschrieben erfordern. Mehrere Beispiele wurden für die Visualisierung und Beurteilung Zellen in Hydrogelen illustriert.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>I2959</td>
<td>Reagent</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.2 M Triethanolamine Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0449</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-117</td>
<td>1x, sterile liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Live/Dead staining kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L3224</td>
<td>Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-FITC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine Phalloidin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>R415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D9542</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23591</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Citrisolv</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-143975</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-cut paraffin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>24202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizol reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.22 &mu;m pore size nylon syringe filters</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>09-719C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 mL disposable syringes</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>Cut syringes at consistent height for UV exposure</td>
</tr>
<tr>
<td>Wide orifice pipette tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Exfo Life Sciences Division</td>
<td>S1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>254 nm germicidal UV light source</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Built into most biological safety cabinets</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cellular encapsulation in 3d hydrogels for tissue engineering 

Die 3D-Verkapselung von Zellen innerhalb Hydrogele stellt eine zunehmend wichtige und populäre Technik zur Kultivierung von Zellen und zur Entwicklung der Konstrukte für das Tissue Engineering. Dieses Umfeld besser nachahmt, welche Zellen in vivo zu beobachten, im Vergleich zu Standard-Gewebekultur, aufgrund der Gewebe-ähnliche Eigenschaften und 3D-Umgebung. Synthetische polymere Hydrogele sind in Wasser gequollenen Netzwerke entwickelt, um stabil sein oder durch Hydrolyse oder Proteolyse abgebaut als neue Gewebe eingekapselten Zellen abgelagert wird, kann sein. Eine Vielzahl von Polymeren haben für diese Anwendungen, wie Poly (Ethylenglycol) und Hyaluronsäure untersucht. Am häufigsten wird das Polymer mit reaktiven Gruppen wie Methacrylate oder Acrylate Lage sind, eine Vernetzung über verschiedene Mechanismen funktionalisiert. In den letzten zehn Jahren wurden große Fortschritte in der Technik dieser Mikroumgebungen gemacht worden - z. B. über die körperliche oder Anhänger kovalenten Einbau von biochemischen Signale - die Rentabilität und direkte zelluläre Phänotyp, einschließlich der Differenzierung von verkapselten Stammzellen (. Burdick et al) zu verbessern. Die folgenden Methoden für die 3D-Verkapselung von Zellen in unserem und anderen Laboratorien optimiert worden, um cytocompatibility zu maximieren und minimieren die Anzahl der Hydrogel Verarbeitungsschritte. In den folgenden Protokollen (siehe Abbildung 1 finden Sie eine Abbildung des Verfahrens), wird davon ausgegangen, dass funktionalisierte Polymere Lage sind, eine Vernetzung bereits in der Hand, hervorragende Bewertungen der Polymerchemie wie auf dem Gebiet des Tissue Engineering angewendet werden können an anderer Stelle gefunden werden (Burdick et al.) und diese Methoden sind kompatibel mit einer Reihe von Polymer-Typen. Darüber hinaus bilden die Michael-Addition (siehe Lütolf et al.) Und Licht-initiierte radikalische (siehe Elisseeff et al.) Mechanismen hier konzentrierte sich nur ein kleiner Teil der gemeldeten Vernetzung Techniken. Mixed-Modus Vernetzung, in dem ein Teil der reaktiven Gruppen zunächst durch Zusatz Vernetzung verbraucht wird, gefolgt von einem radikalischen Mechanismus ist eine weitere häufig eingesetzte und mächtiges Paradigma für die Leitung der Phänotyp der verkapselten Zellen (Khetan et al., Salinas et al.).

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Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

Wir präsentieren Protokolle für die 3-dimensionale (3D) Verkapselung von Zellen innerhalb synthetischen Hydrogelen. Die Kapselung Verfahren ist für zwei häufig verwendete Methoden der Vernetzung (Michael-Addition und Licht-initiierte radikalische Mechanismen), sowie eine Reihe von Techniken für die Beurteilung der eingekapselten Zellen Verhalten skizziert.

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogele für Tissue Engineering

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

36.7K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Wir präsentieren Protokolle für die 3-dimensionale (3D) Verkapselung von Zellen innerhalb synthetischen Hydrogelen. Die Kapselung Verfahren ist für zwei häufig verwendete Methoden der Vernetzung (Michael-Addition und Licht-initiierte radikalische Mechanismen), sowie eine Reihe von Techniken für die Beurteilung der eingekapselten Zellen Verhalten skizziert.

Serie: Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Experimentelle Ansätze zur Tissue Engineering

Forschung

Biologie

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titel der Verkapselung von Zellen durch Tröpfchen

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Elektrospinnen Faserige Polymer Gerüste für Tissue Engineering und Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these models utilize reconstituted basement membrane derived from animals which contain a variable amount of growth factors and cytokines that can influence the growth of these cell culture models. Here, we describe in detail the preparation and use of PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel that is devoid of animal-derived material and pathogens to encapsulate and propagate the ovarian cancer cell line, OVCAR-5. We begin by describing how to prepare the PuraMatrix prior to use. Next, we demonstrate how to properly mix the PuraMatrix and cell suspension to encapsulate the cells in the hydrogel. Upon the addition of cell culture media or injection into a physiological environment, the peptide component of PuraMatrix rapidly self assembles into a 3D hydrogel that exhibits a nanometer scale fibrous structure with an average pore size of 5-200 nm1. In addition, we demonstrate how to propagate cultures grown in encapsulated PuraMatrix. When encapsulated in PuraMatrix, OVCAR-5 cells assemble into three dimensional acinar structures that more closely resemble the morphology of micrometastatic nodules observed in the clinic than monolayer in vitro models. Using confocal microscopy we illustrate the appearance of representative OVCAR-5 cells encapsulated in PuraMatrix on day 1, 3, 5, and 7 post plating. The use of PuraMatrix to culture cancer cells should improve our understanding of the disease and allow us to assess treatment response in more clinically predictive model systems.

This video demonstrates how to encapsulate and culture cancer cells in PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel.

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Ein System zur Kultivierung Iris Pigmentepithelzellen nach Lens Regeneration in Newt Study

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Ein 3D-System für Züchtung menschlichen Chondrozyten in der Synovialflüssigkeit

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, the effect of tissue elasticity on cell function is a major area of mechanobiology research because tissue stiffness modulates with disease, development, and injury. Static tissue-mimicking materials, or materials that cannot alter stiffness once cells are plated, are predominately used to investigate the effects of tissue stiffness on cell functions. While information gathered from static studies is valuable, these studies are not indicative of the dynamic nature of the cellular microenvironment in vivo. To better address the effects of dynamic stiffness on cell function, we developed a DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel system (DNA gels). Unlike other dynamic substrates, DNA gels have the ability to decrease or increase in stiffness after fabrication without stimuli. DNA gels consist of DNA crosslinks that are polymerized into a polyacrylamide backbone. Adding and removing crosslinks via delivery of single-stranded DNA allows temporal, spatial, and reversible control of gel elasticity. We have shown in previous reports that dynamic modulation of DNA gel elasticity influences fibroblast and neuron behavior. In this report and video, we provide a schematic that describes the DNA gel crosslinking mechanisms and step-by-step instructions on the preparation DNA gels.

Our laboratory has developed DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels, a dynamic hydrogel system, to better understand the effects of modulating tissue stiffness on cell function. Here, we provide schematics, descriptions, and protocols to prepare these hydrogels.

Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid, Hydrogele

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...