Diese Arbeit wurde von der Natural Science and Engineering Research Council of Canada, der kanadischen Institut für Gesundheitsforschung und der CHU de Québec Forschungszentrum finanziert.

1. Herstellung und Montage des Static Bioreactor <ol><li> Herstellung der Reservoir <ol><li> Vorbereitung 50 ml Zentrifugenröhrchen als Nährmedium Reservoir für den Bioreaktor. </li><li> Bilden zwei Öffnungen durch Bohren von zwei 5 mm Durchmesser Bohrungen bei 20 mm von dem unteren und dem oberen Ende des Reservoirs verbunden. Dann legen Sie zwei Luer-Armaturen in 5 mm Länge Silikonschläuche. Press-fit diese Luerverbindungen durch die Löcher, und verschließen Sie alle Verbindungen mit medizinischem Silikon kleben. </li><li> Legen Sie eine 0,22 um Filter in die obere Öffnung des Behälters (Abbildung 1A). </li><li> Legen Sie eine Luer-Septum in der unteren Öffnung des Reservoirs (Abbildung 1A). </li></ol></li><li> Dorn-Cap Assembly <ol><li> Bohren Sie ein 4,5 mm Loch in der Mitte des belüfteten Kappe des Reservoirrohr ohne Beschädigung der Filtermembran, die die Belüftungsöffnungen abdeckt. </li><li> Bereiten Sie einen Rührstab (Durchmesser = 4,5 mm, Länge = 100 mm) Als Dorn für das Konstrukt. </li><li> Bereiten Sie zwei Silikon konischen Stopfen (Länge = 10 mm, Mittellochdurchmesser = 4,5 mm). </li><li> Montieren Sie den Dorn und die Kappe (Dorn-cap-Komplex), wie in 1B beschrieben. <ol><li> Press-fit der Dorn in das Loch. Stecken Sie die 2 Stopfen über den Dorn, so dass die Kappe zwischen ihnen. Einstellen der Position des Dorns, so dass seine nutzbare Länge beträgt 78 mm. </li><li> Tragen Sie eine Grundierung und dann medizinischem Silikon Leim auf die Flächen, die vor dem Verbinden der Kappe und dem Silikon konischen Stopfen miteinander in Kontakt sein wird. Entfernen Sie den überschüssigen Kleber auf der Kappe. </li></ol></li><li> Lassen Sie es für 1-3 Tage bei Raumtemperatur trocknen. </li></ol></li><li> Herstellung der Gaze-Griffe <ol><li> Vorbereitung 3 Silikonrohre (Rohr 1: Innendurchmesser = 6,4 mm, Länge = 5 mm; Röhre 2: Durchmesser = 6,4 mm, Länge = 10 mm, und das Rohr 3: Durchmesser = 3,1 mm, Länge = 12 mm). </li><li> Montieren Sie die Gaze-Griffe wie beschreibend in 1C. <ol><li> Cut Rohr 1 in Längsrichtung, und öffnen Sie sie über Rohr 2. Haften Sie sie zusammen mit dem Silikonkleber. </li><li> Schneiden Sie sterilen chirurgischen Gaze bis 5 cm x 7 cm Blatt, und dann rollen dicht die Gaze über das Rohr 3 entlang der längsten Seite der Gaze. Setzen Sie die Röhre 1-Rohr-2-Komplex über die Gaze. </li><li> In Silikonkleber zusammen auf einer Länge von 8 mm bleiben die Gaze, das Rohr 1-Rohr-2-Komplex und das Rohr 3. Schneiden Sie die Gaze. </li></ol></li></ol></li><li> Montage und Sterilisation <ol><li> Montieren Sie den Dorn-cap-Komplex und die Gaze-Griffe wie in Abbildung 2 beschrieben. <ol><li> Mantel der Dorn mit Mittelfett medizinische (2A). Platzieren der Gaze Griffe über den Dorn (2B). Entfernung der Griffe an festen Wert von 35 mm voneinander. </li><li> Bereiten Sie eine röhrenförmige Form, indem das Unterteil einer 10-ml-Spritze mit einer Tischkreissäge (endgültige Länge = 8 mm) ( <strong&gt; 2B). </li></ol></li><li> Legen Sie die Form über die Gaze Griffen ausgestatteten Dorn-Kappenbaugruppe (Gehäuse-Form-Komplex), Einrasten der Form auf dem Silikonstopper (2C). </li><li> Autoklaven dem Behälter und dem Gehäuse-Form komplex. Hinweis: Achten Sie auf die Silikonstopper fest halten Sie beim Einsetzen der Form, um seine Ablösung zu vermeiden. </li></ol></li></ol> 2. Ingenieur glatte Muskelzelle Collagen Gel-basierte Konstrukte und Static Reifung <ol><li> Engineering Konstrukten <ol><li> Erweitern der Schweineaorta glatte Muskelzellen (pSMCs) in 175 cm 2 Kulturflaschen mit 20 ml vollständigem Kulturmedium, bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium gefüllt, das mit 10% (v / v) Schweineserum (PS), 10% (v / v ) fötalem Rinderserum (FBS), 1% (v / v) Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep). </li><li> Bei ≈90% Konfluenz, trennen pSMCs (Passage 2-4) durch Entfernen des Kulturmediums aus derKolben pSMCs, Zugabe von 5 ml Trypsin-Lösung (1x in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, PBS) und Inkubieren für 10 min (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit). </li><li> Resuspendieren pSMCs bei einer Konzentration von 4 x 10 6 Zellen / ml in vollständigem Kulturmedium. </li><li> Kollagenlösung herzustellen, wie zuvor beschrieben 10. <ol><li> Zu extrahieren und zu sammeln Kollagenbündel aus Rattenschwanzsehnen in einer PBS-Lösung. </li><li> Übertragen die Kollagenfasern anschließend in Aceton (5 min), 70% Isopropanol (v / v) (5 min) und Essigsäure (0,02 N, 48 h, 4 ° C) Lösungen. </li><li> Mischung der viskosen Lösung und bei -20 ° C für 3 Tage. </li><li> Lyophilisieren der gefrorenen Lösung, um Kollagenschwämme zu erhalten. </li><li> Solubilisierung der Kollagenschwämme in Essigsäure-Lösung (0,02 N) bei einer Konzentration von 4 g / l und die Zentrifuge bei 29.581 g für 45 min Kraft. </li><li> Sterilisieren Sie die Kollagenlösung durch Dialyseverfahren gegen spätere solutions Essigsäure (0,02 N, 1 h), Chloroform 1% (v / v, 1 h) und Essigsäure (0,02 N, sterilen Lösung Wechsel alle 2 Tage für 1 Woche). </li><li> Sammeln Sie die sterile Kollagenlösung (4 g / L) in einem sterilen Zellkultur Kapuze. </li></ol></li><li> Vorbereitung cellularized Kollagengele wie in Abbildung 3 dargestellt. <ol><li> Vorbereitung 50 ml sterile Pufferlösung durch Vermischen von 35 ml DMEM (5x), 4 ml HEPES (1 N), 3 ml NaOH (1 N) in 8 ml sterilem deionisiertem Wasser. </li><li> Vorbereitung der Zellen und Kollagen-Gel-Mischung in einem Behälter, in Eis gestellt, indem 50% (v / v) von sterilen Kollagenlösung (4 g / l Essigsäure 0,02 n) mit 25% (v / v) von Pufferlösung und 25% (v / v) der Aufhängung pSMCs in komplettem Kulturmedium. </li></ol></li><li> Messung des pH-Werts des Gemisches und sicherzustellen, dass sie zwischen 7,0 und 7,4 ist. </li><li> Pour sanft 9 ml Zellen-and-Kollagen-Mischung in dem oben genannten Gehäuse / Schimmel Komplex (Schritt 1.4.3, 3A-B </strong&gt;). </li><li> Ließ sie bei Raumtemperatur gelieren, für 1 h unter Zellkulturhaube (3B). </li></ol></li><li> Reifung in Static Bioreactor <ol><li> Entfernen Sie die Form (3C) und übertragen Sie sorgfältig das Konstrukt in das Reservoir, mit 35 ml Kulturmedium (3D). </li><li> Inkubieren des Konstruktes (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit) in vertikaler Lage für 1 oder 2 Wochen nach der statischen Reifung. </li><li> Installieren Sie einen Web-Kamera im Inkubator vor dem Konstrukt (um Isolierung zu gewährleisten versiegelt). </li><li> Ändern des Kulturmediums alle 2 Tage durch Absaugen des alten Mediums von der Dorn Septumöffnung und Wieder Füllen des Reservoirs mit einer äquivalenten Menge von frischem Kulturmedium. </li></ol></li><li> Messung der Dicke und Stoffwechselaktivität von SMCs-Kollagen-Gel-basierte Konstrukte Während Static Kultur <ol><li> Legen Sie das Scanning-Laser-Interferometer in die Zelle culture Kapuze und drehen Sie sie von der vertikalen in die horizontale Position mit einer Wasserwaage. </li><li> Übertragen Sie den Bioreaktor in die Zellkultur Kapuze und entfernen Sie das Konstrukt aus dem Reservoir. </li><li> Zu übertragen, die das Konstrukt (immer noch auf dem Dorn montiert) in den Weg des Laserstrahls, und legen es strikt orthogonal zu der Strahlachse (wie in 4 gezeigt). </li><li> Lesen den Wert auf dem Bildschirm des Scanning-Laser-Interferometer dargestellt, entsprechend dem Außendurchmesser des Konstrukts. </li><li> Berechnen der Wanddicke des Konstrukts basierend auf der Außen- und Innendurchmesser (dh der Dorndurchmesser). Hinweis: Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 bis jede Stunde für die ersten 12 Stunden und dann alle 24 Stunden 2.3.5. </li><li> Verwenden 1 ml des alten Kulturmedium (abgetastet bei einem Wechsel des Kulturmediums, Schritt 2.2.4) zur Messung der Lactat und Glucose-Konzentrationen mit dem Blutgasanalysegerät. </li><li> Verwenden Sie 1 ml derfrisches Kulturmedium als Ausgangsniveau für die Glukose und Laktat-Konzentrationen Messungen 14. Hinweis: Wiederholen Sie die Schritte 2.3.6 und 2.3.7 alle 2 Tage nach dem Kulturmedium Wechsel. </li></ol></li><li> Baue Ernten für weitere mechanische und biologische Ccharacterizations <ol><li> Nach 1 oder 2 Wochen der statischen Reifezeit, übertragen Sie die statische Bioreaktor in die Zellkultur Kapuze. </li><li> Transfer sanft das reife Konstrukt von seinem Dorn (Supplemental Video 1) auf einen Durchmesser von 100 mm Petrischale mit 40 ml frischem Kulturmedium (Abbildungen 5 und 7A). </li></ol></li></ol> 3. Mechanische Charakterisierung der Konstrukte in der Längs- und Umfangsrichtung <ol><li> Installieren Sie den Versuchsaufbau, bestehend aus mikromechanischen Testgerät mit einem 5 oder 10 N Wägezelle und einem Bad mit PBS bei 37 ° C ausgestattet, um die Proben a haltent Pseudo physiologischen Bedingungen (Abbildung 6). </li><li> Gleichgewicht der Wägezelle und der Dehnungsmesser. Hinweis: Balancing ist ein in den mikromechanischen Tester aus in das Zurücksetzen der angezeigten Erweiterung Wert und die angezeigte Ladewert während keine Probe auf der Maschine montiert integrierte Funktion. Diese Funktion ermöglicht es, welche die Referenz für beide Messungen. </li><li> Montage der Rohr Konstrukte auf den mechanischen Apparat: Längsrichtung. Hinweis: Führen Längsermüdungstests direkt auf die gesamte Rohrkonstrukte. Verwenden Inhouse gebauten Greifvorrichtungen, um die Gaze Griffe der Konstrukte auf die Lastzelle und an die Basis des PBS-Bad verbinden. <ol><li> Montieren Sie die Schlauch bauen auf die Greifvorrichtungen (7B), im Anschluss an die Ernteverfahren (Abschnitt 2.4). </li><li> Wickeln Sie die Greifeinrichtungen und die Gaze Griffe zusammen mit Teflon-Band ein Verrutschen der Gaze Griffe während der Prüfung zu verhindern.Montieren Sie die Probe auf die mikromechanischen Tester (7C). </li></ol></li><li> Montage der ringförmigen Konstrukte auf den mechanischen Apparat: Umfangsrichtung. Hinweis: Führen Umfangsermüdungsprüfungen an Ringproben aus der rohrförmigen Konstrukte geschnitten. Verwenden Sie zwei Edelstahlstäben als Griffe, um die Proben zu halten. <ol><li> Montieren Sie die Schlauch bauen auf ein Kunststoffrohr als ein Träger mit 5 mm Lücken (7B), nach der Ernte (Abschnitt 2.4) markiert. </li><li> Schneiden 10 mm Ringe aus dem röhrenförmigen Konstrukts. </li><li> Messen Sie die Länge der Probe mit einem Messschieber für die weiteren Analysen. </li><li> Montieren Sie die ringförmige Probe auf den Stahlstangen des mikromechanischen Tester (7C) Edelstahl. Stellen Sie sicher, um die Probe in der Mitte der Stäbe zu platzieren. Hinweis: Das Kunststoffrohr in dem Schritt 3.4.1 und einem Schneidsystem, wie in 7B gezeigt, </strOng&gt; werden verwendet, um eine Beschädigung des Konstrukts während des Schneidens zu vermeiden. </li></ol></li><li> Ermüdungstest auf Konstrukte in der Längs- oder Umfangsrichtung. <ol><li> Dehnen Sie das Konstrukt in die Ausgangsmesslänge. </li><li> Pflegen Sie das Konstrukt in dieser Position für 10 Minuten in pseudo-physiologischen Umgebung. </li><li> Übernehmen 10% zyklische Belastung der Anfangsmesslänge (30 Zyklen) mit dem Konstrukt bei 5% / sec Verformungsgeschwindigkeit. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.5.3 an inkrementellen Schritten von 10% zyklische Belastung bis zum Versagen der Probe. Anmerkung: Die Verwendung des Pseudo-physiologischen Umgebung erfordert Berücksichtigung der Auftrieb und die Trägheit des Greifsystem, das die Messung der angelegten Last zu beeinflussen. </li><li> Notieren Sie den Hintergrund, wie folgt: <ol><li> Bewegen Sie den Lastrahmen auf die Anfangsmesslänge. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.5.3 und 3.5.4 ohne Proben angebracht und halten die Greifeinrichtungen an der Lastzelle verbunden ist (nur 1 Zyklus requirot). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Luminal Endothelialisierung Konstrukte Hinweis: Nach dem Anschluss an die Ernte-Protokoll (Abschnitt 2.4), die Konstrukte zu widerstehen, um in der Handhabung der rotierenden Wandbioreaktor für die weitere Endothelialisierung montiert werden. <ol><li> Drehende-Wand Bioreactor Entwurf <ol><li> Bohren Sie ein 4,5 mm Loch in der Mitte des belüfteten Kappe des Reservoirrohr ohne Beschädigung der Filtermembran, die die Belüftungsöffnungen abdeckt. </li><li> Press-fit einen Dorn (Durchmesser = 4,5 mm, Länge = 40 mm) in das Loch und befestigen Sie den Dorn, wie in Schritt 1.1.2 beschrieben. </li><li> Bereiten Sie zwei C-förmigen Silikon-Unterstützung für das Konstrukt Außendurchmesser = 14 mm; Innendurchmesser = 8 mm). </li><li> Positionieren einer sich drehenden Motor in einem Ende der rotierenden Wand Bioreaktor und ein Lager am anderen Ende (8B). </li></ol></li><li> Lumen Endothelialisierung <ol><li> Erweitern menschlichen Nabelal Venenendothelzellen (HUVECs) in 25 cm 2 Kulturflaschen mit 5 ml M199-Kulturmedium mit 10% (v / v) PS, 10% ergänzt (v / v) FBS, 1% (v / v) Pen-Strep in Petrischalen im Inneren eines Inkubators (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% Luftfeuchtigkeit), bis 90% Konfluenz. </li><li> Vorbereitung 1,5 ml der Proteinbeschichtungslösung pro Konstrukt für eine optimale Zelladhäsion erforderlich durch Verdünnen des Konzentrats Proteinmischung auf 10,5 ng / ml in serumfreies Kulturmedium von Endothelzellen. </li><li> Messen Sie die Länge des Konstrukts mit einem Messschieber. </li><li> Berechnung der Lumenvolumen V und der luminalen Fläche A des Konstrukts als: V = D in 2 L / 4 und A = D L jeweils (wobei D in der Innendurchmesser entsprechend der Dorndurchmesser ist, und L die Länge des Konstrukts). </li><li> Positionieren Sie das Konstrukt in der Mitte des Behälters nach dem Ernteverfahren (Abschnitt 2.4).Mit C-förmigen Silikonträger um das Konstrukt zu befestigen an beiden Enden mit dem Behälter (8A). </li><li> Füllen Sie den Behälter mit 35 ml Kulturmedium. </li><li> Füllen 75% der berechneten Lumenvolumen des Konstrukts (V) mit dem in Schritt 4.2.2 protein Beschichtungslösung. Schließen beide der Enden des Konstrukts, um jede Leckage des Proteins Beschichtungslösung (8A) zu vermeiden. </li><li> Montieren Sie den rotierenden Wandbioreaktorsystem im Inneren der Zellkultur Kapuze. </li><li> Setzen Sie den Bioreaktor in einem 37 ° C Inkubator und starten Sie die Drehung der Bioreaktor bei 4,02 × 10 -5 g Kraft für 1 Stunde, um die luminale Beschichtung wie in 8B gezeigt, zu ermöglichen. </li><li> Öffnen des oberen Endes des Konstrukts und Aspiration des Proteinbeschichtungslösung aus dem Lumen. </li><li> Lösen HUVECs (Passage 2-3) durch Entfernung des Kulturmediums von den Kolben der HUVECs und Zugabe von 3 ml der Trypsin-Lösung (1x in PBS). ICHncubate für 5 min (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit). </li><li> Resuspendieren der HUVECs mit einer Konzentration von 4 x 10 6 Zellen / ml in ergänztem M199 Kulturmedium. </li><li> Im Inneren des Zellkulturhaube, Samen HUVECs in das Lumen des Konstrukts mit einer Dichte von 1.000 Zellen / cm 2. 15 schließen die oberen Extremitäten des Konstrukts, um jede Leckage des HUVECs Lösung zu vermeiden. </li><li> Die Konstrukte (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit) gehostet in den rotierenden Wandbioreaktor (8B) und die Kultur für 2 Tage Inkubieren bei einer konstanten Drehung des 4,02 x 10 -5 g Kraft. </li><li> Zu ernten, die das Konstrukt nach 2 Tagen Kultur unter sterilen Bedingungen und bereiten sie für die weitere biologische Charakterisierung, wie in Abschnitt 2.4 beschrieben. </li></ol></li></ol>

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Keine Finanzierung wurde von Organisationen oder Einrichtungen mit potenziellen Interessenkonflikt erhalten.

In der Gemeinschaft der Gefäßgewebe Ingenieure, haben große Anstrengungen getan worden, um die für die mechanische Stabilität der Blutgefäße verantwortlich 16 Tunica media Schicht zu reproduzieren. Seit der Pionierarbeit von Weinberg und Bell 17, Kollagen wurde weithin als Gerüst für die Gefäßgewebezüchtung wegen ihrer Biokompatibilität, nicht-immunogene Eigenschaften und die Verfügbarkeit eingesetzt. Die Verwendung von Kollagen stellt aber eine große Herausforderung für die Forscher, da dieses Material nicht einfach zu handhaben, aufgrund der intrinsischen Mangel an mechanischer Steifigkeit. Manipulationen während der Gerüstvorbereitung können die Gerüste beschädigen, beeinträchtigen sie für die weitere Verwendung. Die in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren ermöglicht: i) cellularized Kollagengele in eine röhrenförmige Geometrie zu konstruieren, ii) um biologische Gewebe zu konstruieren stark genug, um nach einer kurzen statischen Reifezeit (1 oder 2 Wochen) behandelt werden, iii) alssess mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften eines solchen rohrförmigen biologischen Geweben in 2 Richtungen. Die Zellen in dem Gel spielen eine Schlüsselrolle in der Kollagenmatrix Umbau. Während der Reifezeit, führte kontraktilen SMCs zur Verdichtung der Gele wodurch ein Konstrukt mit einer höheren mechanischen Stabilität, die in den Längs- und Umfangsrichtung beurteilt werden konnte. Danach ausgesät HUVECs in der luminalen Seite der Konstrukte erzeugt eine homogene und tragfähige Endothel und bewiesen damit die Eignung der Kollagengele für vaskuläre Gewebezüchtung. Die in dieser Arbeit vorgestellten Bioreaktor wurde speziell entwickelt, um eine optimale Umgebung für das Zellwachstum während der statischen Reifung bereitzustellen. Darüber hinaus wurden die für die Charakterisierung der mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften der Konstrukte entwickelt Vorrichtungen mit dem Ziel entwickelt, um jeden möglichen Schaden inhärent die Manipulation zu verringernwie empfindliche Materialien. Daher wurde die statische Bioreaktor ein 0,22 um Filter und einer Filtermembran auf der Kappe (Schritt 1.1.2 1A ausgestattet und B), die Gasaustausch zwischen Kulturmedium innerhalb des Behälters und dem Inkubator erlaubt, während eine sterile Kulturumgebung. Die Luer-Septum am Boden wurde als Hafen für Kulturmedium Probenahme und zum Ändern während statische Kultur. Einige wichtige Schritte müssen während Konstrukt Herstellung und Charakterisierung berücksichtigt werden. All die Manipulationen (im Schritt 2.1.1 und in den nachfolgenden Schritten durchgeführt wird), die die Sterilität des Systems nicht beeinträchtigen könnten, wurden in einer sterilen biologischen Abzug durchgeführt. Zellen und Kollagen-Gel Gemischaufbereitung wurde auf Eis, um das Gelieren verzögern behandelt (Schritte 2.1.4 bis 2.1.7). Bei Schritt 2.1.7, alle Luftblasen in der Mischung vor der Gelierung eingeschlossen sind potentielle Spannungskonzentration, die die Bereiche s gefährden könnenRentabilität der Konstrukte. Daher erfordert die Entfernung eines solchen Luftblasen leicht Schütteln der Montage oder Verwendung von Medizin Vakuum für 3 min zur Entgasung unter sterilen Bedingungen. Schließlich wurden die Griffe, die speziell für die Achse des Dorns zentral in der röhrenförmigen Form während der Gelierung zu erhalten und zu ermöglichen, dass empfindliche Manipulation der Konstrukte bei der Ernte (Entfernen des Dorns, Abschnitt 2.4) zur Endothelialisierung ausgebildet und zur Erleichterung der Montage an das mechanische System (Längs Tests). Das vorliegende Protokoll schlägt eine Original einfach zu Prozess alternativer Ansatz der Verstärkung Kollagengelen Konstrukte auf Basis des natürlichen Eigenkontraktionspotential von SMCs. Übliche Techniken von Kollagenmatrices Verstärkung beinhalten die Verwendung von physikalischen und chemischen Vernetzungsmitteln, die schädliche Wirkungen auf die Zellen-Matrix-Interaktionen 18 aufweisen kann - 20. Die Herstellungstechnik in vorgediese Arbeit ermöglicht Leiten Sie diese Zellen getriebenen Umbauprozess, um ein Tissue-Engineering-Konstrukt mit gezielten mechanischen Eigenschaften ohne physikalische oder chemische Behandlung zu erhalten. Charakterisierung von mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften von hydrierten Kollagengelen ist eine große Herausforderung. In dieser Hinsicht ist die vorliegende Protokoll beschreibt eine ursprüngliche einfache und effiziente Methode zur Beurteilung der mechanischen Eigenschaften von Rohrweichteile. Diese Charakterisierung kann nicht nur in Umfangsrichtung, sondern auch in der Längsrichtung direkt auf die gesamte Rohrstruktur durchgeführt werden. Während mechanische Charakterisierung, Temperatur, wässrigen Umgebung, pH und Ionenstärke sind einige der Umweltfaktoren, die bekanntermaßen stark beeinflussen das mechanische Verhalten von biologischem Gewebe 21. Daher ist die vorliegende Arbeit schlägt eine originelle Einrichtung und Protokoll für die mechanische Charakterisierung von biologischen Geweben in einem hochreproduzierbare Pseudo physiologische Umgebung (Kochsalzlösung bei 37 ° C und pH 7,4). Um das Beste aus unserem Wissen, hat diese Art der Charakterisierung nie anderswo gemeldet. Im Ergebnis ist die in dieser Arbeit vorgeschlagene Technik zeigt das hohe Potential der direkten Mischen der Zellen mit Kollagen für Gefäßgewebe-Engineering-Anwendungen. Diese Methode zusammen mit der mechanischen Charakterisierung und Endothelialisierung Prozess bilden Hoch polyvalenten Protokolle. Daher durch leichte Modifikationen der Set-ups und Protokolle, während die gleichen Gründe, Hauptanforderungen für Engineering Gefäßgewebeäquivalenten angegangen werden, wie eine schnelle und unkomplizierte Abwicklung, einschließlich Endothelialisierung, und die Möglichkeit, auf eine Vielzahl von weichen umgesetzt werden Geweben mit verschiedenen Längen und Durchmessern. Weiterhin verschiedenen adhärenten Zelltypen ECM Proteine ​​und Formgeometrien können für eine Anzahl ausgewählter applicati sucht werdenons, wie Engineering Sehnen, Hauttransplantationen, Herz Patches, Nerven, unter anderem. Obwohl die mechanischen Eigenschaften der Konstrukte ermutigend sind, sind sie immer noch geringer als die von nativem Gewebe. In diesem Zusammenhang haben wir davon überzeugt, dass eine sehr kurze statische Reifezeit ist ein entscheidender Schritt in Richtung der dynamischen Anregung in einen Bioreaktor und damit zu einer höheren strukturellen Integrität und mechanische Stabilität führt. Allerdings ist die Möglichkeit, schnell zu produzieren Gewebezüchtung cellularized Kollagenbasis Konstrukte für die mechanische und histologische Analysen ermöglicht die hier beschriebene eine nützliche und vielversprechende Methode, um einen Einblick in das Zusammenspiel zwischen Zellen und ECM während des Wachstums und Umbau, oder sogar bereitzustellen statischen Bioreaktor als Modell für die Therapien und Wirkstoffabgabesysteme verwendet werden.

Gefäßgewebetechnik sieht verschiedene Strategien bei der Herstellung von technischen Fahrzeuge, einschließlich Transplantaten auf Basis synthetischer Gerüste Zellage basierte Gewebezüchtung Blutgefäße (TEBVs) und extrazelluläre Matrix (ECM) Zielkomponenten basierende TEBVs. Unter diesen Ansätzen, synthetische Polymere gute mechanische Eigenschaften, aber einen gemeinsamen Nachteil, da sie keine Bioaktivität 1. Die Zellschicht basierenden Verfahren ermöglicht die Herstellung von technisch Gefäßersatz mit hohen mechanischen Eigenschaften, aber die erforderliche Zeit, um solche Transplantate herzustellen ist ungefähr 28 2 Wochen. Natürliche Biopolymere des ECM, wie Kollagen, Elastin, Fibrin 3 oder einer Kombination davon, bleiben die Goldstandardmaterialien für das Tissue Engineering Scaffolds. Dies ist vor allem aus dem Grund, dass diese Materialien besitzen im allgemeinen eine gute Biokompatibilität während in der Lage, um funktionelle zelluläre Reaktionen 4-5 induzieren. Unter diesen Biopolymers, Kollagen Typ I ist eine der häufigsten und vorherrschende tragende Protein der ECM in vielen Geweben wie Haut, Blutgefäße und Sehnen. Umfangreiche Arbeiten wurden auf die mechanischen Eigenschaften von Kollagen 6 durchgeführt worden - 8, aber es wurden nur wenige Untersuchungen über zelluläre Umbildung Kollagengele bei statischer Reifung. Cellular Remodeling bezieht sich auf die strukturelle Modifikationen der Kollagenmatrix durch Zellen, die die Stabilität des Kollagen-Fibrillen-Netzwerk 9 beeinflussen könnten induziert. Als natürliches Gerüst können relativ große Mengen an Kollagen Typ I isoliert, sterilisiert und aus verschiedenen Quellen, wie beispielsweise Ratten-Schwanzsehnen 10 gespeichert. Verständnis zellulärer Wechselwirkungen mit Kollagen und die zugehörigen mechanischen Gesamtverhalten der cellularized Kollagenträger (Konstrukte) ist ein wesentlicher Schritt für den Aufbau von Gewebe. Kollagenbasis TEBVs kann durch direktes Mischen Zellen mit Kollagen verarbeitet werdenwährend Gelzubereitung und weiter in spezifische Formen wie rohrförmig und planar 11 geformt. Gefäßzellen in den Gelen vermehren und umgestalten Kollagen Typ I 12. Somit diese Methode umgeht die Notwendigkeit einer besonderen Makroporosität, die eine der wesentlichen Probleme bei der Entwicklung von Scaffolds für das Tissue Engineering-Anwendungen darstellt. Die Hauptnachteile Kollagengelen durch ihre geringe mechanische Eigenschaften jedoch gegenüber synthetischen Materialien 13. In dieser Studie wurde ein lebensfähiges Gewebe mit homogener Verteilung der Zellen, die durch direktes Mischen des Kollagens mit Zellen in einer Ein-Schritt-Verfahren ausgelegt. &quot;Static Bioreaktoren&quot; wurden für die 1 oder 2 Wochen der statischen Reifung der cellularized Kollagengelen verwendet (ohne angelegten externen dynamischen mechanischen Einschränkungen). Während der Kultur, Kollagenmatrixumbau aufgetreten ist, wodurch eine strukturelle Verstärkung an den Konstrukten. Außerdem waren r diese Konstrukteeady auf einer sich drehenden Wand Bioreaktor überführt werden, und ein homogenes Endothel erzielt. Zusätzlich wird in dieser Arbeit eine spezifische mechanische Testprotokoll wird auch vorgeschlagen, einen geeigneten neuen Ansatz bei der Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von Rohrweichgewebe bereitzustellen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, ein Verfahren zur in vitro Herstellung und schnelle Reifung vaskulären Geweben, die stark genug ist, um nicht nur für die biologische und mechanische Charakteristiken, sondern auch für weitere mechanische Konditionierung in einem dynamischen Bioreaktor, der als eine zentrale gehandhabt werden sollen Schritt bei der Regeneration von Gewebe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CellTreat 50 mL Bio-Reaction tubes</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>229-475</td>
			<td>Centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male luer with lock ring x 1/8&#34; hose barb. PP. 25/pk</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-45503-04</td>
			<td>Luer fittings for &#34;gas-exchange port&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer x 1/8&#34; hose barb adapter. PP. 25/pk</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-45500-04</td>
			<td>Luer fittings for the &#34;medium sampling port&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft.</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-96410-17</td>
			<td>Tube 1 and 2 for the gauze grippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft.</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td>Tube 3 for the gauze grippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silastic Medical adhesive silicone, type A</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>-</td>
			<td>Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvent 4 Vessel venting filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6713-0425</td>
			<td>Filter for &#34;gas exchange port&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod. PP. stirring. 8&#8217;&#8217;</td>
			<td>Scienceware</td>
			<td>377660008</td>
			<td>Mandrel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopper silicone rubber 00 PK12</td>
			<td>VWR</td>
			<td>59590-084</td>
			<td>Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krytox PFPE/PTFE Greases</td>
			<td>Dupont</td>
			<td>GPL 202</td>
			<td>Medical grade grease for covering the mandrel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xiameter RTV-4130-J base and curing agent</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>-</td>
			<td>C-shaped silicone support for endothelialization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco (Life Technology)</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure acetone (99%)</td>
			<td>Laboratoire Mat Inc.</td>
			<td>AP0102</td>
			<td>Chemical for collagen extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC610080040</td>
			<td>Chemical for collagen extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%; Fisher Scientific,&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FL070494</td>
			<td>Chemical for collagen extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform solution (99%)&#160;</td>
			<td>Laboratoire Mat Inc.</td>
			<td>CR 0179</td>
			<td>Chemical for collagen extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163716</td>
			<td>Chemical for construct preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Laboratoire Mat Inc.</td>
			<td>SR-0169</td>
			<td>Chemical for construct preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaserMike 136</td>
			<td>LaserMike</td>
			<td>Series 183B</td>
			<td>Scanning laser interferometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroPulse MicroTester</td>
			<td>Instron Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>Micromechanical Tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Media M199/EBSS, 500 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30253.01</td>
			<td>Component of cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum HI - 500mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH 30396.03</td>
			<td>Component of cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine serum (PS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9783</td>
			<td>Component of cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP661-50</td>
			<td>Saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red</td>
			<td>Sarstedt Inc.</td>
			<td>83.1812.002</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColorpHast- pH-indicator strips (pH=6.5-10.0)</td>
			<td>EMD</td>
			<td>9583</td>
			<td>pH measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 mL vial&#160;</td>
			<td>BD Biosciences - Discovery Labware</td>
			<td>356230</td>
			<td>Concentrate protein mixture for endothelialization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifeCam VX-3000</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>Thickness measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical analyzer, DxC600</td>
			<td>Beckman Coulter Unicell Synchron</td>
			<td>-</td>
			<td>Glucose and lactate concentrations measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen fibers</td>
			<td>Rat tails</td>
			<td>-</td>
			<td>Collagen was extracted in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine smooth muscle cells (pSMCs)</td>
			<td>Porcine aortas</td>
			<td>-</td>
			<td>pSMCs were isolated in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Human umbilical veins</td>
			<td>-</td>
			<td>HUVECs were isolated in the laboratory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering 3d cellularized collagen gels for vascular tissue regeneration

Synthetische Materialien sind dafür bekannt, klinischen Komplikationen wie Entzündungen, Stenose und Infektionen auslösen, wenn sie als Gefäßersatz implantiert. Collagen wurde ausgiebig für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen aufgrund seiner inhärenten Biokompatibilität verwendet und wird als eine Alternative zu synthetischen Materialien (dh geringe Antigenität, Entzündung und cytotoxischen Antworten). Allerdings haben die begrenzten mechanischen Eigenschaften und die damit verbundene niedrige Hand-Fähigkeit Kollagengelen ihre Verwendung als Gerüstmaterial für die vaskuläre Gewebezüchtung behindert. Daher ist die Logik hinter dieser Arbeit wurde zum ersten Mal cellularized Kollagengelen in eine rohrförmige Geometrie und zweite Ingenieur glatten Muskelzellen verbessern angetrieben Reorganisation der Kollagenmatrix, um Gewebe steif genug, um gehandhabt werden zu erhalten. Die hier beschriebene Strategie beruht auf der direkten Montage von Kollagen und glatten Muskelzellen (Konstrukt) in einem 3D cyli basierendndrical Geometrie mit der Verwendung einer Formtechnik. Dieses Verfahren erfordert eine Reifezeit, während der die Konstrukte sind in einem Bioreaktor unter statischen Bedingungen kultiviert (ohne angewendete äußere Dynamik mechanischer Druck) für 1 oder 2 Wochen. Die &quot;statische Bioreaktor&quot; bietet eine Überwachung und Steuerung sterile Umgebung (pH, Temperatur, Gasaustausch, Nährstoffversorgung und Entsorgung), um den Konstrukten. Während der Kulturperiode wurden Dickemessungen durchgeführt, um die Zellen getriebenen Remodellierung der Kollagenmatrix zu bewerten, und Glukoseverbrauch und Lactatproduktion Raten wurden gemessen, um die Zellen zu überwachen metabolischen Aktivität. Schließlich wurden die mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften für die resultierenden röhrenförmigen Konstrukte bewertet. Hierzu spezifischen Protokollen und einer fokussierten Know-how (Manipulation, Greifen, die in hydratisierter Umgebung usw.) wurden entwickelt, um die das erzeugte Gewebe zu charakterisieren.

Diese Arbeit beschreibt die Herstellung von technischen Rohr Kollagen-basierten Konstrukten, die Gefäßzellen. Bereits nach 1 Stunde der frühen Gelierung wurde Zellen-and-Kollagen-Mischung direkt in einer 3D-röhrenförmige Geometrie montiert, mit dem Außendurchmesser gleich dem Durchmesser der entsprechenden Form (etwa 14 mm). Entlang statischen Reifung zeigten Messungen der raschen Reduzierung des Außendurchmessers der rohrförmigen cellularized Strukturen, wie in Tabelle 1 gezeigt ist. Der Durchmesser der cellularized Kollagengele von etwa 60% des Ausgangswertes nach dem 1. Tag der statischen Kultur geschrumpft und von fast 85% innerhalb von 7 Tagen (Supplemental Video 2). SMCs innerhalb der Konstrukte für die beobachtete Schrumpfung und die damit verbundene mechanische Verstärkung verantwortlich ist, da dieser Vorgang nicht in nicht-zellularen Kollagenträger auftreten. Man beachte, daß kein Gradient von jeder Art (thermisch, biochemische, mechanischen oder anderen) aufgetragen. Die Zellen-Laufwerkn Verdichtung führte zu einem Material mit höherer Dichte, die Kollagen gehandhabt und gegen mechanische Bitten gedämpft werden könnte (Supplemental Videos 3 und 4). Um die Zellen getriebene Umbau der gesamten mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften beziehen, wurden Ermüdungsprüfungen an den Konstrukten (Supplemental Videos 5 und 6) durchgeführt wird. Diese Versuche bestanden in Radfahren den Konstrukten (30-mal) bei unterschiedlichen konstanten Stämme (10%, 20% und 30% der ursprünglichen Messlänge), und um die Spannung als Antwort der Konstrukte zur mechanischen Aufforderung über die Zeit aufzuzeichnen. Die repräsentativen Ergebnisse Pro Konstrukt werden in 9 gezeigt. Das Konstrukt widerstanden höheren Belastungen in Längsrichtung (75 kPa) als in Umfangsrichtung (16 kPa) bei dem gleichen Dehnungsbereich (30% Dehnung) unterzogen. Inzwischen bei jedem Zyklus der Spannungsspitzenwert für die ta erreichtrgeted maximale Dehnung sank im Laufe der Zeit. Dieses Verhalten ist typisch für die Hoch viskoelastischen Eigenschaften durch diese Kollagen-basierten Konstrukten ausgestellt. Die biologische Aktivität der cellularized Konstrukte wurde bei statischer Reifung beurteilt. Daher wurde die Stoffwechselaktivität der SMCs durch Messung der Glukoseverbrauch und Laktatproduktion während der statischen Kultur ausgewertet. Das Kulturmedium wurde alle 2 Tage und Glukose abgetastet und Laktatkonzentrationen wurden mit Hilfe eines Blutgasanalysegerät gemessen. Die ständige Zunahme der Glukoseverbrauch und Laktatproduktion kombiniert, um die wichtige Schrumpfen der Konstrukte, bezeugen die SMCs Aktivität entlang statische Kultur (Abbildung 10). Die erhöhte mechanische Stabilität aufgrund der Zellgetriebenen Umbau erlaubt die Manipulation der Konstrukte und die anschließende Endothelialisierung Prozess. Trichrom-Färbung nach Masson auf den endothelialisiert Konstrukte durchgeführtzeigte eine sehr homogene Endothel. SMCs zeigte eine spindelartige förmige Morphologie und erschien homogen durch die Wand verteilt sind, während HUVECs erschien in der luminalen Seite (Figur 11) gut verteilt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig1highres.jpg" width="700" /> Abb. 1: Die Komponenten des statischen Bioreaktor Die statische Bioreaktor bestand aus einem modifizierten 50 ml Zentrifugenröhrchen (A) und einem Dorn ausgestatteten Kappe (B). Das Röhrchen diente als Medienspeicher, und mit einem Port für ein 0,22 um-Filter, für den Gasaustausch und einem Septum ausgestattet ist, für die mittlere Abtastung und Wechsel. A in der belüfteten Kappe vorhanden Dorn erlaubt die Herstellung von Konstrukten in Röhrenform. Die Gaze-Griffe (C) wurden entworfen und hergestellt, um die Gelierung der Konstrukte über den Dorn unterstützt. Darüber hinaus sind dieseGriffe erlaubt die Konstrukte nach dem statischen Reifung behandelt werden und auf die mechanische Vorrichtung befestigt werden. Der Außendurchmesser des Dorns war 4,7 mm. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig2highres.jpg" width="700" /> Figur 2: Montage der statischen Bioreaktor Montagephasen des Bioreaktors vor der Sterilisierung.. Die Gaze-Griffe wurden auf dem Dorn (A) in einem festen Abstand angeordnet. Es wurde eine Form eingelegt (B) und dicht an den Silikonstopfen (C) befestigt ist. Der Außendurchmesser des Dorns war 4,7 mm. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig3highres.jpg" width="700" /> Fig. 3: Die Herstellung der Konstrukte unter sterilen Bedingungen die Zellen und Kollagen Mischung wurde in das Gehäuse-Form komplexen gegossen<html> (A) und ließ Gel 1 h lang bei Raumtemperatur (B). Danach wurde die Form entfernt (C) wurde die statische Bioreaktors montiert (D) und in einen Vorratsbehälter für das statische Reifung des Konstrukts im Inkubator (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit) überführt. Der Außendurchmesser des Dorns war 4,7 mm. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig4highres.jpg" width="700" /> Fig. 4: Messung der Schichtdicke / Außendurchmesser der Konstrukte A Laser-Scanning-Interferometer verwendet, um die Messung der Außendurchmesser der Konstrukte auszuführen. Das Konstrukt wurde in den Weg des Laserstrahls angeordnet und erzeugt einen Schatten. Die Breite des Schattens entsprechend dem Außendurchmesser des zu konstruieren, wurde dann gemessen, und auf dem Bildschirm angezeigt. e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig5highres.jpg" width="500" /> Abb. 5: Die morphologische Erscheinungsbild der geernteten Konstrukt (A) Gleich nach dem Gelieren und (B), nachdem die Zellen getriebene Umbau während statische Reifung für 2 Wochen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6: Versuchsaufbau zur mechanischen Charakterisierung Es bestand der mikromechanischen Testgerät mit 5 oder 10 N Lastzelle und einem Bad, das PBS bei 37 ° C, die Proben in Form von Pseudo-physiologischen Bedingungen zu halten ausgestattet.. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig7highres.jpg" width="700" /> Abbildung 7: Probenvorbereitung f<html> oder mechanische Charakterisierungen. Beispielsernte (A) und Präparat (B) Dauertests in Längsgeführt und Umfangsrichtungen (C). Der Außendurchmesser des Dorns war 4,7 mm. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig8highres.jpg" width="600" /> Abbildung 8: Drehwand Bioreaktor (A) Die rohrförmigen Konstrukte wurden in die Mitte des Behälters mit Hilfe der c-förmigen Silikon Träger aufgebaut.. Beide Enden des Konstrukts wurden geschlossen, um ein Austreten der Lösung zu vermeiden HUVECs. (B) Die Konstrukte wurden im Inkubator kultiviert (T = 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit) in Drehung bei 4,02 x 10 -5 g Kraft für 2 Tage. 2 / 52812fig9highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Abbildung 9:.. Mechanische Charakterisierung Ergebnisse von Ermüdungsprüfungen an Konstrukten in Längsrichtung (A) durchgeführt und Umfangs (B) Richtungen nach Zellgetriebene Umbau <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/52812fig9highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="10" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig10highres.jpg" width="600" /> Abb. 10: Stoffwechselaktivität von SMCs in den Kollagengelen Messungen der Glukoseverbrauch Frequenz und Laktatproduktionsrate wurden mit der Blutgasanalysegerät alle 2 Tage durchgeführt, nachdem das Kulturmedium Wechsel. Frisches Kulturmedium wurde als Basisniveau für die Glukose und Laktat-Konzentrationen Messungen verwendet. Abbildung 11: Lumen Endothelialisierung histologische Bilder der radialen Querschnitte der rohrförmigen Konstrukte.. Masson Trichome Färbung von Rohr Konstrukte kultiviert statisch für 1 Woche (A) und 2 Wochen (B). H &amp; E-Färbung aus einem röhrenförmigen Konstrukt (C). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Zeit </td><td> Dicke (mm) </td><td> Verdichtung (%) </td></tr><tr><td> 0 hr </td><td> 4.83 ± 0.02 </td><td> 0 ± 0 </td></tr><tr><td> 2 Stunden </td><td> 4.26 ± 0.02 </td><td> 12 ± 0 </td></tr><tr><td> 4 Stunden </td><td> 4.21 ± 0.03 </td><td> 13 ± 1 </td></tr><tr><td> 6 Stunden </td><td> 4,06 ± 0,10 </td><td> 16 ± 2 </td></tr><tr><td> 12 hr </td><td> 3,16 ± 0,07 </td><td> 35 ± 1 </td></tr><tr><td> 1 Tag </td><td> 2,08 ± 0,11 </td><td> 57 ± 2 </td></tr><tr><td> 1 Woche </td><td> 0,68 ± 0,07 </td><td> 86 ± 1 </td></tr><tr><td> 2 Wochen </td><td> 0,36 ± 0,00 </td><td> 93 ± 0 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: schnelle Verdichtung Konstrukt Messers während des statischen Reifung Wandstärke der Konstrukte und die Verdichtungsrate als eine Funktion der Zeit der statischen Kultur.. Verdichtung wurde durch Bestimmung der Außendurchmesser der rohrförmigen Konstrukte mit einem Abtast-Laser-Interferometer (Serie 183B, Lasermike 136) gemessen. Nach 24 Stunden verdichtet die Konstrukte auf 57% ± 2% ihrer Form Dimensionen. Daten sind ausgedrückt als Mittelwert ± SD (n = 3). Das Vorliegen und die Aktivität lebender Zellen der glatten Muskulatur war für solche wesentlichen Änderungen die nur verantwortlich. Supplemental Video. 1: Ernten der nicht umgebaut Rohr Kollagengelen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video1.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a> Supplemental Video 2:. Cells getriebenen Verdichtung des Rohr Kollagengelen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video2.m4v" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a> Supplemental Video. 3: Manipulation der nicht umgebaut Rohr Kollagengelen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video3.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a> Supplemental Video. 4: Manipulation der Zellen-Rohr umgebaut Kollagengelen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video4.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um zu sehen th</a>Video ist. Supplemental Video. 5: Längsermüdungstest (bei ​​30%) auf Zellen-Rohr umgebaut Kollagengelen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video5.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a> Supplemental Video. 6: Umlaufende Ermüdungstest (bei ​​30%) auf Zellen-Rohr umgebaut Kollagengelen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video6.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration at JoVE.com

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

engineering-3d-cellularized-collagen-gels-for-vascular-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.6K Aufrufe.  Laval University. In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Serie: Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Forschung

Biotechnik

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Engineered 3D Silk-Kollagen-basierten Modell von polarisiertem Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also respond to neural injuries and act to protect the tissue from degenerative events. In vitro studies of astrocytes&#39; functionality are important to elucidate the mechanisms involved in such events and contribute to developing therapies to treat neurological disorders. This protocol describes a method to biofabricate a neural-like tissue structure rich in astrocytes by 3D bioprinting astrocytes-laden bioink. An extrusion-based 3D bioprinter was used in this work, and astrocytes were extracted from C57Bl/6 mice pups&#39; brain cortices. The bioink was prepared by mixing cortical astrocytes from up to passage 3 to a biomaterial solution composed of gelatin, gelatin-methacryloyl (GelMA), and fibrinogen, supplemented with laminin, which presented optimal bioprinting conditions. The 3D bioprinting conditions minimized cell stress, contributing to the high viability of the astrocytes during the process, in which 74.08% &#177; 1.33% of cells were viable right after bioprinting. After 1 week of incubation, the viability of astrocytes significantly increased to 83.54% &#177; 3.00%, indicating that the 3D construct represents a suitable microenvironment for cell growth. The biomaterial composition allowed cell attachment and stimulated astrocytic behavior, with cells expressing the specific astrocytes marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and possessing typical astrocytic morphology. This&#160;reproducible protocol provides a valuable method to biofabricate 3D neural-like tissue rich in astrocytes that resembles cells&#39; native microenvironment, useful to researchers that aim to understand astrocytes&#39; functionality and their relation to the mechanisms involved in neurological diseases.

Here we report a method of 3D bioprinting murine cortical astrocytes for biofabricating neural-like tissues to study the functionality of astrocytes in the central nervous system and the mechanisms involving glial cells in neurological diseases and treatments.

3D-Bioprinting von murinen kortikalen Astrozyten für die Entwicklung von neuralähnlichem Gewebe

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Isolierung und Kultur primärer humaner Zahnfleischepithelzellen mit Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...