Die Forschung hat durch die Wallace H. Coulter Foundation Early Career Award in Translational Research unterstützt. Dank Tim Andrews, Pädiatrische Hämatologie / Onkologie, für die Hilfe bei Blutentnahme. Auch dank Dr. Sam Wellhausen, Durchflusszytometrie Core, James Graham Brown Cancer Center, um Hilfe bei der laufenden Durchflusszytometrie Proben.

Teil 1. Microfluidic Bauelementherstellung Ein Silizium-Master-Form der mikrofluidischen Lyse Gerät wurde mit Standard-Photolithographie-Techniken mit dem Gerät in der University of Louisville Reinraum [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, CA) wurde verwendet, um eine Transparenz-Maske erzeugen (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) zu negativen Repliken der Kanäle zu erstellen. Die mikrofluidischen Lyse Gerät wurde von der Silizium-Master-Form mit weichen lithographischen Techniken mit dem Elastomer Poly (dimethylsiloxan) (; Dow Corning, Midland, MI PDMS) hergestellt. Das Elastomer mit den replizierten Kanäle veröffentlicht wurde, und Channel Access Löcher wurden mit einer 20-Gauge-Nadel (Small Parts, Miramar, FL.) Gestanzt. Die PDMS-Wafer wurde irreversibel auf ein Glasplättchen über Sauerstoff-Plasma gebunden und getestet für Experimente. Part 2. Protokoll für den Betrieb Lyse Gerät Nach dem Mikrofluidiksystem hergestellt worden und getestet wurde, sind Experimente mit Erythrozytenlyse bereit zu beginnen. Im folgenden Abschnitt das Protokoll für die Mikrofluidik-Gerät. 2,1 Probengewinnung <ol><li> Sammeln Sie 4 ml der Blutprobe von V. mediana cubiti, auf der vorderen Unterarm Vene des Patienten mit Heparin als Antikoagulans in zwei 2 ml grüne Spitze vaccutainers. </li><li> Discard ersten 2 ml-Tube, wie es verdrängt reifen Endothelzellen (false positives) enthält. </li><li> Resuspendieren der zweiten Röhre an Heparin mit Blut mischen, indem Sie nach oben und unten; sparen sofort auf Eis. </li><li> Transfer 1 ml Blut in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Prozess der Blutprobe sofort (innerhalb einer Stunde nach der Entnahme). </li></ol> 2,2 Prime Mikrofluidikvorrichtung mit PBS <ol><li> Besorgen Sie sich einen Mikrofluidikvorrichtung verklebt auf Glas. Press-fit Zugang Schlauch (Small Parts, Miramar, FL) von etwas größerem Durchmesser in den Ein-und Ausgang (Abbildung 1). </li><li> Bringen Sie einen 30-Gauge-Injektionsnadel (Small Parts, Miramar, FL), um den Schlauch an jedem der Eingänge, die Bereitstellung der Makro bis Mikro-Schnittstelle. </li><li> Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit 1X PBS und vergewissern Sie sich, um loszuwerden, Blasen, die durch flicking die Nadel der Spritze. Schließen Sie das PBS-geladen 1 ml Spritze mit dem Einlass 1 auf der Mikrofluidikvorrichtung. Drücken Sie die Spritze mit dem 1X PBS vorsichtig von Hand, bis die Lösung fließt aus Einlass 2 und dann sofort Klemme Einlass 2 mit einem Standard-Office-Sammelmappe Clip </li><li> Drücken Sie weiter die 1X PBS, bis die Flüssigkeit erreicht die Auslassöffnung des Mikrofluidik-Gerät. Sobald die Lösung fließt aus der Steckdose, klemmen die Ablaufschlauch mit einem anderen Bindemittel Clip. </li><li> Drücken Sie weiter die 1 ml-Spritze, bis die 1X PBS fließt aus Einlaß 3, und klemmen Sie die Einlass-3-Port mit einem anderen Office-Sammelmappe Clip. Die Mikrofluidik-Gerät ist nun komplett grundiert. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Gerätes zeigt Einlässe für die jeweiligen Lösungen und Auslass. 2.3 Herstellung von Spritzenpumpen und Lösung <ol><li> Zur Kalibrierung der Pumpen folgendermaßen vor: <ol class="lalpha"><li> Für die große Harvard Spritzenpumpe (Harvard, PHD 22/2000 Part # 702000): Der Durchmesser Konfiguration bis 22,5 mm, Durchfluss 600 ul / min eingestellt. </li><li> Für den kleinen Harvard Spritzenpumpe (Harvard, Pico Plus Part # 702213): Der Durchmesser Konfiguration auf 4,61 mm, Durchfluss Set 20 ml / min. </li></ol></li><li> Füllen Sie eine 30 ml Spritze mit sterilem, deionisiertem Wasser. Dies kann durch die Rücknahme der Lösung direkt aus der 50 ml konischen Rohr durchgeführt werden. (Label der Spritze) </li><li> Füllen Sie ein zweites 30 ml Spritze mit 2X Phosphat-gepufferter-Saline (PBS), 2% Paraformaldehyd (PFA) unter Verwendung des Verfahrens in Schritt 9 beschrieben. (Label der Spritze) </li><li> Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit 1X PBS aus der Aliquots in der 15 ml konische Röhrchen gelagert, wobei das Verfahren in Schritt 9 beschrieben. </li><li> Verbinden Sie die 30 ml VE-Wasser Spritze mit dem Einlass 2 und die 30 ml 2X PBS Spritze mit dem Einlass 3 (stellen Sie sicher, don t Trap Luftblasen im Schlauch oder Mikrofluidik-Gerät). Entfernen Sie die Klammer aus Buchten 2 und 3 und den Ablaufschlauch. Verbinden Sie den 1X PBS 1 ml-Spritze in den Einlaß 1. Vermeiden Sie die Einführung Blasen, indem die Nadel der Spritze mit Flüssigkeit, verbinden Sie die Spritze, und schnippte die Nadel der Spritze, um Blasen zu befreien. </li></ol> 2,4 Erythrozytenlyse <ol><li> Stellen Sie alle der Spritzen auf dem richtigen Harvard Pumpen, wie unten beschrieben: <ol class="lalpha"><li> Setzen Sie die zwei 30-ml-Spritzen (eine mit steriler, de-ionisiertes Wasser und das andere mit 2X PBS, 2% PFA) zusammen auf der großen Harvard Spritzenpumpe. </li><li> Stellen Sie die 1 ml-Spritze (mit 1X PBS) auf der kleinen Harvard Spritzenpumpe. </li><li> Setzen Sie den Ablaufschlauch in einem Abfallbehälter (50 ml konische Röhre, w beschriftet istaste). </li></ol></li><li> Schalten Sie den großen Harvard Spritzenpumpe (mit 30 ml Spritzen) und lassen Sie ihn eine Minute lang laufen. (Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen und keine Leckage im Gerät oder in den Schlauch). </li><li> Schalten Sie den kleinen Harvard Spritzenpumpe und lassen Sie es für eine weitere Minute laufen. (Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen und keine Leckage im Gerät oder in den Schlauch). Stoppen Sie die Pumpen. Die Mikrofluidik-Gerät ist jetzt einsatzbereit. </li><li> Entfernen Sie den 1 ml-Spritze mit 1X PBS aus dem kleinen Harvard Spritzenpumpe. </li><li> Nach Abnahme der Blutprobe, füllen Sie die 1 ml Spritze mit 0,05 ml sterile 1X PBS ohne Einschluss von Luftblasen. Anschließend füllen Sie die Spritze mit 0,5 ml Blut aus dem Eppendorf-Röhrchen erhalten. (Die 1 ml-Spritze enthält nun ein Volumen von 0,55 ml Blut und 1X PBS-Puffer.) Hinweis: Halten Sie die Spritze senkrecht beim Ausfüllen zu vermeiden Vermischung der 0,05 ml PBS mit dem Blut. </li><li> Verbinden Sie die Spritze mit dem Blut zu Eingang 1 und montieren Sie die Spritze vorsichtig (zu vermeiden drängen das Blut durch den Schlauch in das Gerät) auf dem kleinen Harvard Spritzenpumpe (die Spritze montiert ist vertikal in die Pumpe). </li><li> Entfernen Sie den Ablaufschlauch aus dem Abfall Rohr und legte einen sauberen 50 ml Zentrifugenröhrchen an seinem Platz und stellte es auf einen Eimer mit Eis. </li><li> Schalten Sie das große Harvard Spritzenpumpe erste und lassen Sie es für 1 Minute laufen. Starten Sie das Sammeln der Probe aus der Steckdose in der 50 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Wechseln Sie auf die kleinen Harvard Spritzenpumpe. </li><li> Nachdem die Blutprobe in der 1 ml Spritze vollständig durch das Gerät gereist, stoppen beide Pumpen. Dies dauert etwa 20 Minuten. </li><li> Centrifuge die gesammelten Proben für 5 Minuten bei 350 xg bei Raumtemperatur mit der Bremse ausgeschaltet. </li><li> Entfernen Sie, indem Sie Pipettenspitze auf der gegenüberliegenden Seite des weißen Pellet Überstand. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, vor allem rote Zelltrümmer, ohne die weiße Pellet. </li><li> Resuspendieren der Probe in 1 ml Flow-Puffer (1X PBS, 1% BSA [Rinderserumalbumin], 2% PFA) durch Auf-und Abpipettieren. Transfer-Probe auf ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Microcentrifuge die gesammelten Proben für 5 Minuten bei 4 xg bei Raumtemperatur. Verwenden derselben Präzision wie vor dem Überstand zu entfernen. </li><li> Resuspendieren der Probe in 1 ml Flow-Puffer durch Vortexen. </li></ol> 2.5 Herstellung für die durchflusszytometrische Analyse <ol><li> Für die Probenanalyse mittels Durchflusszytometrie, 100 ul Probe zu einer Durchflusszytometrie Röhre. </li><li> Um die 100 ul Probe hinzuzufügen angegebenen Antikörper (die korrekte Konzentration). </li><li> Lassen Sie Probe für 30 Minuten bei 40 inkubieren C. </li><li> Zweimal waschen mit Durchfluss-Puffer vor der Durchflusszytometrie. Wash Schritt beinhaltet Zugabe von 250 ul der Strömung Puffer, vortexen, Zentrifugieren für 5 Minuten bei 350 xg und Entfernen mit einer Flüssigkeit wiederum der Durchflusszytometrie Rohr Überstand. </li><li> Das Pellet in 250 ul Puffer fließen. Die Probe wird zur Analyse bereit mittels Durchflusszytometrie. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Vollblut wurde durch die mikrofluidischen Lyse Gerät und Post-Processing-Protokoll ausgeführt wurde, befreien von Erythrozyten und bereichernd zirkulierenden Zellen mit Zellkern (CNCs). Ideal Ergebnisse liefern eine saubere Durchflusszytometrie Streudiagramm mit getrennten CNC Populationen. Unten in Abbildung 2 und 3 angezeigt werden Streudiagramm Vergleiche von einer Vollblut-Probe ohne Erythrozytenlyse und mit Erythrozyten-Lyse durch den mikrofluidischen Protokoll mit den Achsen als forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC) Licht. Man erkennt, dass der mikrofluidischen Bereicherung Protokoll notwendig, um eine saubere Durchflusszytometrie Streudiagramm erhalten wird. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Durchflusszytometrie Streudiagramm Vollblutprobe ohne Erythrozytenlyse mit FSC-und SSC-Achsen. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Durchflusszytometrie Streudiagramm der zirkulierenden Zellen mit Zellkern mit mikrofluidischen Erythrozytenlyse von Populationen mit FSC-und SSC-Achsen beschriftet. Region 1 (rot) stellt Lymphozyten, Region 2 (grün) stellt Monozyten, Region 3 (blau) stellt Granulozyten und Region 4 (lila) ist noch nicht charakterisiert werden. Entfernen von roten Zelltrümmern mit einer Pipette in das Protokoll ist auch wichtig, wenn nötig. Unten in Abbildung 4 ist ein Streudiagramm mit einem Überschuss von roten Zelltrümmern. Obwohl nicht trübt die Streudiagramm wie in Abbildung 2, muss man für den zusätzlichen Veranstaltungen durch Erythrozyten-Bruchstücken bei der Datenanalyse Konto. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Durchflusszytometrie Streudiagramm darstellen roten Zelltrümmern, als Cluster zu sehender Ereignisse in Region 5 (cyan). Färben von Zellen für bestimmte Antikörper Phänotyp Marker erzeugen auch charakteristische Ergebnisse. In den folgenden Figuren sind Antikörper Phänotyp Flecken für 3 verschiedene Leukozyten-Populationen: Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten. Abbildung 5 zeigt Lymphozytenpopulationen geplottet mit Äxten CD3 und CD4. Monozyten und Granulozyten sind in den Abbildungen 6-7 mit den Achsen als FSC gegen CD14 und CD66b gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Durchflusszytometrie Streudiagramm darstellen Lymphozyten mit CD3-und CD4-Achsen. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Durchflusszytometrie Streudiagramm darstellen Monozyten mit FSC-und CD14-Achsen. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Durchflusszytometrie Streudiagramm darstellen Granulozyten mit FSC-und CD66b-Achsen.

<ol>
	<li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+(SCD.">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li><li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis.">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li></ol>

Ein automatisiertes mikrofluidischen Blut Lyse-Protokoll wurde berichtet. Im Rahmen des Protokolls sind wichtige Schritte erwähnenswert. In Abschnitt P.2.1, ist es wichtig, das erste Blut Fläschchen, da die Probe enthält verdrängt reife Endothelzellen als Fehlalarme gesammelt zu verwerfen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Blutprobe innerhalb einer Stunde nach Probenentnahme durchgeführt. Priming der mikrofluidischen Gerät in Abschnitt P.2.2, ist es wichtig, zunächst der Blasen zu befreien. Darüber hinaus s...

automated microfluidic blood lysis protocol for enrichment of circulating nucleated cells

In diesem Bericht das Protokoll für ein automatisiertes mikrofluidischen Blut Lyse Gerät ist detailliert. Zirkulierende kernhaltigen Zellen (CNCs), einschließlich Leukozyten und Endothelzellen, bieten eine ideale Plattform, um einen aktualisierten Status auf das Immunsystem Zustand eines Individuums. Die Mikrofluidik-Protokoll ermöglicht die Anreicherung von CNCs ohne selektive Zellverlust und Probenvorbereitung Variabilität durch Benutzer-vermittelten Schritte. Kurz gesagt, enthält das Protokoll Bauelementherstellung, Probenentnahme-, Geräte-Setup, und läuft das Blut durch den mikrofluidischen Kammer. Innerhalb des Gerätes Vollblut wird schnell mit VE-Wasser für ca. 10 Sekunden in eine 50 micron x 150 micron mikrofluidischen Kanal gemischt. In dieser Zeitspanne werden die Erythrozyten durch hypotone Bedingungen lysiert. Herringbone Strukturen auf dem Boden des Kanals eine gute Durchmischung und Exposition von Zellen, um eine konstante Umgebung. Verbleibende Zellen sind auf isotone Bedingungen an der Ausfahrt des Gerätes zurück, fixiert mit 2% Paraformaldehyd, zentrifugiert, um Erythrozyten Trümmer CNCs trennen und suspendiert in Flow-Puffer für die Färbung und Analyse mittels Durchflusszytometrie. Die Ergebnisse zeigen, sauber Durchflusszytometrie Streudiagramme mit CNC Populationen gerettet. Bedeutung dieses Gerät und Protokoll kommt in der Studie und das Verständnis der Pathogenese der Erkrankung durch eine Analyse der CNC Populationen. Daher sind Automatisierung, Effizienz und Einfachheit der mikrofluidischen Protokoll demonstriert.

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Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät wurde für den Umlauf kernhaltigen Zelle Bereicherung aus dem peripheren Blut über Erythrozytenlyse dass die Isolierung von hoher Qualität Probe stellt sicher, ohne Zellverlust entwickelt.

Automatisierte Microfluidic Blut Lysis-Protokoll zur Anreicherung von zirkulierenden Zellen mit Zellkern

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

automated-microfluidic-blood-lysis-protocol-for-enrichment

Research

JoVE Journal

Biology

12.3K Aufrufe.  University of Louisville. Ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät wurde für den Umlauf kernhaltigen Zelle Bereicherung aus dem peripheren Blut über Erythrozytenlyse dass die Isolierung von hoher Qualität Probe stellt sicher, ohne Zellverlust entwickelt.

Serie: Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Anreicherung von NK-Zellen aus menschlichem Blut mit der RosetteSep Kit von StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Forschung

Biologie

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Mikrofluidik-Co-Kultur von Epithelzellen und Bakterien für die Untersuchung Löslich Signal-vermittelte Wechselwirkungen

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine ​​kinetochore

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Ein Protokoll für die Verwendung von Gen Set Anreicherung Analyse zur Ermittlung von geeigneten Tiermodell für die translationale Forschung

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

Isolierung von CD4+ T-Zellen und Analyse von zirkulierenden T-follikulären Helfer (cTfh) Zelle Teilmengen von peripheren Blut mittels 6-Farb Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolierung und Anreicherung menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen für Organoidkulturen

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a problem for physicians and researchers. This manuscript describes a simple and effective method to monitor immune rejection in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. Circulating DNA is a potentially non-invasive biomarker for organ damage. In this study, circulating pig-specific DNA (cpsDNA) was monitored during xenograft rejection by quantitative real-time PCR (qPCR). In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Species-specific primers were then used to quantify cpsDNA by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. The value of this method suggests that it can be used as a simple, convenient, low cost, and less invasive method to monitor the immune rejection of xenotransplantation.

In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Using species-specific primers, cpsDNA was quantified by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models.

Quantifizierung der zirkulierenden schweinespezifischen DNA im Blut eines Xenotransplantationsmodells

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...