Die beschriebenen Arbeiten wurde von der Cornell Center auf der Mikroumgebung und Metastasierung durch Verleihungsnummer U54CA143876 vom National Cancer Institute unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder dem National Institutes of Health. Diese Arbeit wurde zusätzlich teilweise durch ein National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH) finanziert.

Das folgende Protokoll ist für die Herstellung eines einzelnen Mikroröhre Vorrichtung. 1. Vorbereitung von Halloysit Nanotube-Lösung <ol><li> Sonifikat (10-13 W (rms)) 250 ul Halloysit-Nanoröhrchen-Lösung (6,6 Gew.% in Wasser) 30 sek. Coole Lösung mit kaltem Wasser und wiederholen Sie die Beschallung einmal. Wieder cool. </li><li> Zeichnen Sie beschallten Lösung in eine Spritze, legen Sie eine Spritze 0,45 um-Filter und Filter-Lösung in saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex die Lösung gelegentlich bis zur Homogenität aufrechtzuerhalten. </li></ol> 2. Beschichtung von Reaktionscup innere Oberfläche mit Halloysit-Nanoröhren <ol><li> Erhalten 50 cm langen Abschnitt der Micro-Renathane microtubing (300 mu m Innendurchmesser, 35,3 ul Innenvolumen). Schneiden Sie ein Ende des Mikroröhrchen bei einer Diagonale und stecken in einem kleinen IDEX Adapterstück. Führen Sie die Nadel von einem 3/10 cc 29G Spritze in das andere Ende des Mikroröhrchens. </li><li> Um die Mikroröhrchen reinigen, legen Sie das offene Ende des Mikroröhrchen (das Endemit dem Adapter) in 70% Ethanol und Auslosung ~ 50 ul Ethanol in die Spritze zu füllen Mikroröhrchen. </li><li> Spülen Sie das Ethanol aus dem Mikroröhrchen, indem ein großzügiges Volumen von destilliertem Wasser in die Spritze. </li><li> Lösen Sie die Spritze aus dem Mikroröhrchen, entleeren Sie die Spritze, und dann wieder an die Mikroröhrchen. </li><li> Eine Lösung aus 0,02% w / v Poly-L-Lysin in Wasser. Zeichnen Sie 50 ul in die Mikroröhrchen und lassen Sie sie für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zu sitzen. </li><li> Zeichnen Sie 100 ul gefiltert Nanotube-Lösung in die Mikroröhrchen und lassen Sie sie für 3 min bei RT inkubieren. </li><li> Zeichnen Sie 100 ul Wasser durch die Mikroröhrchen zum Ausspülen des Nanotube-Lösung. Erlauben beschichteten Mikroröhrchen zu sitzen, mit Wasser gefüllt, über Nacht bei RT. </li></ol> 3. Vorbereitung der Mikroröhrchen zur Zellisolierung <ol><li> Eine Lösung aus 10 ug / ml Protein G in 1X Dulbeccos Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,0 - 7,2). Zeichnen Sie 50 ul PBS durch Mikroröhrchen und zeichnen Sie dann 50 uldas Protein-G-Lösung und zu ermöglichen, für 1,5 h bei RT inkubiert. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung mit 5 ug / ml E-Selektin-IgG und 50 pg / ml Antikörper (anti-EpCAM für die meisten Krebs-Proben, anti-PSMA für Prostatakrebs-Proben) in PBS. Zeichnen Sie 50 ul der E-Selektin und Antikörper-Lösung in die Mikroröhrchen und lassen Sie sie für 2 h bei RT inkubieren. </li><li> Unspezifische zelluläre Adhäsion wird mit 5% Milch-Protein blockiert. Eine Lösung aus 5% (w / v) Milchprotein in PBS. 50 ul Malen Milchprotein Lösung in die Mikroröhre und lassen für 1 Stunde bei RT inkubiert. </li><li> Zeichnen Sie 50 ul PBS in das Rohr und lassen bei RT, bis Blut oder Buffy-Coat-Proben für die Verarbeitung bereit sind. </li><li> 10 min vor der Verwendung des Mikroröhrchen für Isolation, ziehen 50 ul PBS, die mit Ca 2 + (&quot;PBS +&quot;) gesättigt wurde, um die Selektin-Moleküle aktivieren. </li></ol> 4. Vorbereitung der Proben für Zell-Isolierung <ol><li> Zeichnen oder erhalten 10 ml Blut von Patienten in heparinisierteRohr. </li><li> 10 ml Ficoll-Paque Lymphozytenisolation Lösung in 50 ml Zentrifugenröhrchen. Vorsichtig Schicht 10 ml Vollblut auf Ficoll, um nicht zu mischen, das Blut und Ficoll. </li><li> Zentrifugieren bei 2000 x g für 15 min bei 4 ° C mit minimaler Verzögerung. </li><li> Entfernen Sie die Buffy-Coat-Schicht und in neues Röhrchen. </li><li> Wash Buffy-Coat mit PBS (Zentrifuge bei 230x g für 10 min, den Überstand verwerfen). </li><li> Vorsichtig resuspendieren Zellen mit 1 ml RBC Lysispuffer und Inkubation für 10 min bei RT, um Erythrozyten zu lysieren. </li><li> Fügen Sie 10 ml PBS, vorsichtig mischen und zentrifugieren bei 230x g für 10 min. Überstand verwerfen und das Pellet vorsichtig in 3 bis 4 ml PBS +. </li></ol> 5. Zellisolierung <ol><li> Befestigen Sie ein Ende des funktionalisierten Mikroröhrchen auf eine 5 ml Spritze mit IDEX-Adapter. </li><li> Legen Sie die Spritze auf einer Spritzenpumpe. </li><li> Tauchen des offenen Endes des funktionalisierten Mikroröhre in die Zelle suspension. </li><li> Verarbeiten Sie die Zellsuspension durch die Mikroröhrchen bei 1 bis 4 ml / h. </li><li> Übertragen des offenen Endes der Mikroröhrchen in ein Röhrchen mit PBS + und stellt 300 ul PBS + in die Spritze mit 0,016 ml / min, um ungebundene und lose gebundenen Zellen aus dem Mikroröhrchen entfernen. </li><li> Platzieren Sie das offene Ende des Mikroröhrchens in ein sauberes Röhrchen. Trennen Sie die Spritze aus dem Mikroröhrchen und fügen Sie eine Spritze mit Accutase vorgefüllt. Vorsichtig genug perfundieren Accutase in die Mikroröhrchen zu füllen (~ 50 ul) und lassen Sie sie bei RT für 10 min inkubieren. </li><li> Befestigen Sie eine Spritze mit 1 ml Wachstumsmedium (79% RPMI, 20% FBS, 1% Penicillin Streptomycin) und perfuse in Mikroröhrchen vorgefüllt, Sammeln Abwässer in Gewebekultur behandelt Well-Platte. </li><li> Kultur Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 unter Bedingungen befeuchtet. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Das Ziel dieser Technik ist, um lebensfähige Krebszellen aus dem Blut von Krebspatienten zu isolieren. Es gibt verschiedene Methoden, um Krebszellen in Kultur zu identifizieren; eine notwendige Überprüfung des Gerätes Erfolg. Wir haben uns entschieden, Zellen in Kultur mit Antikörper gegen epitheliale Einheiten, wie EpCAM (epithelialen zelluläre Adhäsionsmolekül) oder PSMA (Prostata-spezifisches Membran-Antigen) zu färben, zusätzlich zu DAPI, um intakte Zelle Kerne (Abb. 2 und 3) zu identifizieren. Die Anzahl der Krebszellen aufgenommen unter Verwendung dieser Technik ist notwendigerweise eine Funktion der Anzahl von CTC in der Ausgangsprobe und Patienten-Schwankung kann hoch sein. Bei der Verarbeitung von Patienten mit Krebs diagnostiziert Stadium IV getroffen, wir routinemäßig zu erfassen zwischen 100 und 500 Zellen pro Röhrchen Krebs von Blut, mit einer Reinheit&gt; 50%. Unmittelbar nach der Isolierung, kann eine größere Anzahl von kontaminierenden Leukozyten vorhanden sein. Allerdings sind diese Zahlen werden nach Inkubation in Kulturmedium für bis zu 5 Tage abgereichert werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung des funktionalisierten Mikroröhrchen für CTC Isolation, zeigt Selektin-vermittelte Rollen durch Antikörper-vermittelte statische Haftung gefolgt. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Daten von CTC Isolierung aus Blutproben aus einer Brustkrebs-Patienten und einem Patienten mit Lungenkrebs gezeichnet. Die Zahl der lebensfähigen Zellen als positiv identifiziert CTC auf EpCAM-Färbung bezogen wird durch die festen Stäbe und beziehen sich auf die linke Ordinate und der Prozentsatz der Zellen, die identifiziert wurden dargestellt, wie CTC der Gesamtzahl der gefangenen Zellen im Vergleich wird durch die offene Balken dargestellt und gemessen auf der rechten Ordinate. Die Ergebnisse werden nach fünf Tagen in Kultur. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vertreter Aufnahmen von verschiedenen Spendern (A und B) von CTC in Kultur 5 Tage im Anschluss an isolatiauf von einem Krebspatienten Blutprobe. Die Zellen wurden bei EpCAM Fluoreszenz mit AlexaFluor 488 (grün) und 4 &#39;,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gefärbt, um den Kern (blau) zu visualisieren.

<ol>
	<li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+for+the+capture+and+manipulation+of+circulating+tumor+cells.">Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).</li><li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtube+Device+for+Selectin-Mediated+Capture+of+Viable+Circulating+Tumor+Cells+from+Blood.">Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood.</a> Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+naturally+occurring+halloysite+nanotubes+for+enhanced+capture+of+flowing+cells.">Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells.</a> Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).</li><li>Al-Mehdi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells:+a+new+model+for+metastasis.">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat. Med. 6, 100-102 (2000).</li><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+Building+a+framework.">Cancer metastasis: Building a framework.</a> Cell. 127, 679-695 (2006).</li><li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow.">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).</li><li>Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+selectin+ligands+in+extravasation+of+cancer+cells+and+organ+selectivity+of+metastasis.">Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).</li><li>Geng, Y., Marshall, J., King, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+Metastatic+Cascade:+Tumor+Cell-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Circulation.">Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 .</li><li>Stott, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip.">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).</li></ol>

MRK ist ein wissenschaftlicher Berater CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).

Es ist oft der Fall, dass die frühen Schritte in der Entdeckung neuer Krebstherapien nutzen Krebszelllinien, die fragwürdig Ähnlichkeit mit primären Krebszellen tragen, bleiben doch in Handhabung durch ihre einfache Handhabung im Labor. Forschung in die Entwicklung neuer Krebstherapien, würde beschleunigt, wenn primären humanen Krebszellen früh im Roman Forschung genutzt würden. CTC sind die am leichtesten zugängliche Art der Krebszelle, die aufgrund ihrer Präsenz im Blut und der Leichtigkeit einer Standard-Blutprobe. Darüber hinaus repräsentieren zirkulierende Tumorzellen ein notwendiger Schritt im Prozess der Metastasierung 5,6, so dass ihre Relevanz für die Krankheit und Dienstprogramm für die Ausrichtung neuer Medikamente ist klar. Isolierung von CTC von Blut in vitro ist aufgrund ihrer geringen Konzentrationen kompliziert: in der Größenordnung von einem pro Million Leukozyten oder eines Erythrozyten pro Milliarde 7. Die Mehrheit der aktuellen Methoden zum Nachweis von CTC im Blut, darunter die einzige FDA-zugelassene Technik Zelle<html> Suchen (Veridex), beschädigen oder zerstören Zellen bei der Erkennung Prozess, unter Ausschluss der Verwertung außerhalb Enumeration. Das oben beschriebene Verfahren nicht beeinträchtigt die Lebensfähigkeit der Zellen und damit öffnet die Tür für zukünftige klinische Forschung über Krebs. Da die Wiederherstellung von intakten Zellen ist das Ziel dieser Technik ist es unerlässlich, dass Zellen mit Vorsicht behandelt werden, vor allem während Blut Trennschritte. Es gibt eine Reihe von einstellbaren Parametern in diesem System, verändert werden, um verbesserte Ausbeute in Abhängigkeit von kritischen Merkmalen wie Krebs-Typ erreicht werden könnte. In den oben beschriebenen Schritten, haben wir entschieden, EpCAM als CTC-spezifischen Antikörper für alle Krebsarten außer bei der Verarbeitung von Prostatakrebs-Proben verwendet werden, wobei anti-PSMA verwendet wurde. Weitere Substitutionen von Krebs-spezifische Antikörper kann sicher verwendet werden, um die Leistung für den einzelnen Patienten zu verbessern. Darüber hinaus können Selektin und Antikörper-Konzentrationen verändert werden, um Capture 8 zu verbessern. &quot;&gt; Ein wesentliches Merkmal der Vorrichtung ist der Einbau von E-Selektin-Moleküle auf der Oberfläche. E-Selektin wird in der Regel auf der luminalen Oberfläche von Endothelzellen und Funktion von sich schnell bewegenden Leukozyten zu einer Entzündung rekrutiert ausgedrückt. Fließenden Leukozyten zu binden, um transient Selektin-Moleküle, was zu einem langsameren, Abrollverhalten, die langsamer und stärkeren Bindung der Zellen an das Endothel durch Integrine erleichtert. eindeutig nachweisen existiert, die den Fall, dass CTC kann durch einen ähnlichen Mechanismus 9,10 extravasieren. Die Einbeziehung von Selektin auch kann das Gerät bei größeren Flussraten betrieben werden, Preise erzielen, die sonst verhindern Zellen, die aus der Bindung an Antikörper 11 wäre. So ist unser Gerät ahmt ein physiologisch Venole zu erfassen biomimetisch fließenden CTC ohne zugleich zellulären Verletzungen. Verbesserte Leistung der Vorrichtung kann die Zugabe des Halloysit Nanoröhrchen-Beschichtung auf der luminalen Oberfläche zurückzuführender Vorrichtung. Frühere Studien haben gezeigt, dass es drei Hauptkomponenten der Nanoröhrchen-Beschichtung, die für eine verbesserte Funktionalität ermöglicht. Erstens stellt die Nanoröhrchen-Beschichtung eine vergrößerte Oberfläche, was eine größere Proteinablagerung auf die Oberfläche 4. Zweitens wird bei der Durchführung Rasterkraftmikroskopie auf der Nanoröhrchen-Beschichtung haben wir festgestellt, dass die einzelnen Nanoröhren von der Oberfläche in die Strömung ragen. Dies ermöglicht Selektin-Moleküle bis zu einem Mikrometer über der Oberfläche präsentiert werden, so dass Zellen aufnehmen können und eingestellt, um die Oberfläche weiter oben in ihrer Flugbahn durch das Rohr 4. Schließlich ist der Halloysit Nanoröhrchen-Beschichtung in der Lage, die Adhäsion von Leukozyten zu verhindern und Verteilen auf der Oberfläche, so dass für eine reduzierte Anzahl von Leukozyten zusammen mit dem CTC erfasst und somit eine größere Reinheit nachfolgenden CTC 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Zahl </td></tr><tr><td> 300 um ID Schlauch </td><td> Braintree Scientific </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> Größere Rohre für die Verbindung mit Spritze </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> 5ml-Spritze für die Pumpe </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Anschluss-Schlauch klein bis groß </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> Anschluss-Schlauch zu großen Spritze </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> F-120 und P-659 </td></tr><tr><td> Spritze für Mikroröhre (3/10cc Insulinspritze U-100 29G 1/2 &#39;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque Zzgl. </td><td> GE Heilenthcare Bio-Sciences AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC Lysis Buffer (Puffer EL, 1000ml) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> Protein G, 5 mg </td><td> Calbiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> Menschliche Antikörper EpCAM/TROP-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA-Antikörper (GCP-04) </td><td> Abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> 96-Well-Platten (Microtest 96) </td><td> BD Falcon </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Blotting Grade Blocker fettfreie trockene Milch, 300g </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Halloysit-Nanoröhren </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> Calcium Carbonate, 5g </td><td> Aldrich Chemie </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> RPMI-Medium 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin 0,1% w / v in Wasser </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td> Sonic Dismembrator </td><td> Fisher Scientific </td><td> Modell 100 </td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum </td><td> Atlanta Biochemikalien </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin </td><td> Sigma Leben Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

rapid isolation of viable circulating tumor cells from patient blood samples

Zirkulierender Tumorzellen (CTC) sind Zellen, die aus einem Primärtumor durch das Kreislaufsystem zu verbreiten und das kann letztlich bilden sekundäre Tumoren an entfernten Stellen. CTC Zählung kann zur Progression der Erkrankung über die Korrelation zwischen CTC-Konzentration im Blut und der Schwere der Erkrankung ein Basis folgen werden. Als Bearbeitungswerkzeug, konnte CTC im Labor, um persönliche Therapien zu entwickeln studiert werden. Zu diesem Zweck ist die Isolierung zu CTC keine Zellschädigung und Kontamination durch andere Zelltypen, insbesondere Leukozyten zu bewirken, muss so weit wie möglich 2 vermieden werden. Viele der aktuellen Techniken, darunter die einzige FDA-zugelassene Gerät für CTC-Enumeration, zerstören CTC als Teil des Isolations-Prozess (für weitere Informationen vgl. Rz. 2). Mikrofluidische Vorrichtung, um lebensfähige CTC erfassen beschrieben, bestehend aus einer Oberfläche mit E-Selektin-Glykoprotein neben Antikörpern gegen epitheliale Marker 3 funktionalisiert. Um Geräte-Performance steigernfunktion sollten eine Nanopartikel-Beschichtung wurde von Halloysit-Nanoröhren, ein Aluminosilikat Nanopartikel aus Ton 4 geerntet angewandte bestehend. Die E-Selektin-Moleküle stellen ein Mittel, um sich schnell bewegende CTC, die durch das Gerät gepumpt werden und verleiht ein Vorteil gegenüber alternativen mikrofluidischen Bauteilen, bei längeren Bearbeitungszeiten sind notwendig, um Zielzellen mit genügend Zeit, um mit einer Oberfläche interagieren zu erfassen. Die Antikörper gegen epitheliale Ziele vorgegeben werden CTC-Spezifität zu dem Gerät, sowie eine leicht einstellbare Parameter, um eine Isolation zu stimmen. Schließlich ermöglicht die Halloysit Nanoröhrchen-Beschichtung deutlich verbesserte Isolation zu anderen Techniken, indem sich schnell bewegenden Zellen einzufangen, Bereitstellen vergrößerte Oberfläche für die Proteinadsorption und Abwehr von Leukozyten, 3,4 verglichen. Dieses Gerät ist durch eine einfache Technik unter Verwendung von Off-the-shelf Materialien hergestellt, und wurde erfolgreich eingesetzt, um Krebszellen aus dem Blut von metastasierendem erfassenKrebspatienten. Captured Zellen werden für bis zu 15 Tage in Kultur nach der Isolierung gehalten wird, und diese Proben bestehen typischerweise aus&gt; 50% lebensfähig primären Krebszellen von jedem Patienten. Dieses Gerät wurde verwendet, um lebensfähig CTC sowohl aus verdünntem Vollblut und Buffy-Coat-Proben zu erfassen. Schließlich präsentieren wir eine Technik, mit der Funktionalität in einer klinischen Umgebung, um persönliche Krebstherapien zu entwickeln.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples at JoVE.com

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Zirkulierender Tumorzellen aus dem Blut von Krebspatienten ohne zugleich Zellschäden isoliert. Isolierung von Tumorzellen wird unter Verwendung eines bimolekularen Oberfläche von E-Selektin neben Antikörpern gegen epitheliale Marker. Ein Nanoröhrchen-Beschichtung fördert gezielt Krebs Zelladhäsion was zu hohen Reinheiten Gefangennahme.

Schnelle Isolierung von lebensfähigen zirkulierende Tumorzellen von Patientenblutproben

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

rapid-isolation-viable-circulating-tumor-cells-from-patient-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

26.5K Aufrufe.  Cornell University. Zirkulierender Tumorzellen aus dem Blut von Krebspatienten ohne zugleich Zellschäden isoliert. Isolierung von Tumorzellen wird unter Verwendung eines bimolekularen Oberfläche von E-Selektin neben Antikörpern gegen epitheliale Marker. Ein Nanoröhrchen-Beschichtung fördert gezielt Krebs Zelladhäsion was zu hohen Reinheiten Gefangennahme.

Serie: Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

Erkennung und Isolierung von zirkulierenden Melanomzellen mit Photoakustische Flowmetrie

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Forschung

Biotechnik

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Isolierung von Cellular Lipid Droplets: Zwei Reinigungstechniken Ausgehend von Hefezellen und menschlichen Plazenten

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Isolierung von primären humanen Colon Tumorzellen von Surgical Gewebe und Kultivierung sie direkt auf weiche elastische Substrate für Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Hyaluronsäure basierte Hydrogele für 3-dimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create anatomically accurate head phantoms with realistic brain imaging properties because standard fabrication methods are not optimized to replicate any patient-specific anatomical detail and 3D printing materials are not optimized for imaging properties. In order to test and validate a novel navigation system for use during brain tumor surgery, an anatomically accurate phantom with realistic imaging and mechanical properties was required. Therefore, a phantom was developed using real patient data as input and 3D printing of molds to fabricate a patient-specific head phantom comprising the skull, brain and tumor with both ultrasound and X-ray contrast. The phantom also had mechanical properties that allowed the phantom tissue to be manipulated in a similar manner to how human brain tissue is handled during surgery. The phantom was successfully tested during a surgical simulation in a virtual operating room.
The phantom fabrication method uses commercially available materials and is easy to reproduce. The 3D printing files can be readily shared, and the technique can be adapted to encompass many different types of tumor.

This protocol describes the fabrication of a patient specific skull, brain and tumor phantom. It uses 3D printing to create molds, and polyvinyl alcohol (PVA-c) is used as the tissue mimicking material.

Patientenspezifische Polyvinylalkohol-Phantomfertigung mit Ultraschall- und Röntgenkontrast für die Planung von Hirntumorchirurgie

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.