Die Autoren möchten die technischen Beitrag von Gloria Benavides A bestätigen. Diese Arbeit wurde von der American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC) unterstützt, NIDDK Diabetische Komplikationen Consortium (Diacomp, www.diacomp.org) Zuschuss DK076169 (subaward VDU), und der O&#39;Brien-Center P30 DK079337 (VDU).

Alle in diesem Manuskript für die Blutentnahme, Isolierung und Analyse beschriebenen Protokolle wurden überprüft und an der Universität von Alabama in Birmingham vom Institutional Review Board genehmigt. 1. Zellisolation (Geändert von Histopaque Sigma-Aldrich Protokoll Nr. 1119 und Miltenyi Biotec MICROBEAD positive und negative Selektion Protokolle) <ol><li> Centrifuge Vollblut bei 500 g für 15 min in einer Zentrifuge mit einem Schwenkbecherrotor (Beschleunigung = 5-6 und ohne Bremse) (in ACD oder EDTA-Röhrchen gesammelt). </li><li> Entfernen Sie die obere Schicht, die die plättchenreichem Plasma (PRP) enthält mit einer Transferpipette bis 1 cm über der Zellschicht (Erythrozyten / Buffy-Coat) bleibt. Beiseite das PRP bei Raumtemperatur für die Verarbeitung später. </li><li> Übertragung der Leukozytenmanschette in einem sterilen 50 ml konischen Röhrchen auf 24 ml mit RPMI basalen verdünnen oder mindestens 4-fache Ausgangsvolumen Buffy Coat. Hinweis: Die obere Hälfte des RBC-Schicht kann have einbezogen werden, obwohl dies bei der Erhöhung der RPMI Volumen proportional führen. </li><li> Vorbereitung der Dichtegradient unter Verwendung von Ficoll niedriger Dichte mit einem spezifischen Gewicht von 1,077 (1077) für die obere Schicht und eine hohe Dichte Ficoll mit einem spezifischen Gewicht von 1,119 (1119) für die untere Schicht in drei 15 ml konische Röhrchen (jeweils 3 ml). Um diesen Schritt durchzuführen, zuerst in jedes Röhrchen hinzufügen 1077. Unter Verwendung einer 5 ml Pipette hinzu schmalen 1119 bis der Boden des Röhrchens, indem die Pipettenspitze unterhalb 1077 und das Reagenz langsam freisetzen, ohne Vermischung mit dem oberen Gradienten. Insgesamt 6 ml Dichtegradient Medien sollten vorhanden sein, in dieser Phase mit einem sichtbaren Trennungsphase in der 3-ml-Marke. </li><li> Mit Hilfe einer automatisierten Pipette 8 ml verdünntem Blut (aus Schritt 1.3) vorsichtig, um jede Steigung Rohr mit der Low-Power-Einstellung, um aus der Steigung Schichten gestört wird. Das Gesamtvolumen sollte 14 ml bei diesem Schritt. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 700 × g für 30 min bei Raumtemperatur (BeschleuniRation 6, keine Bremse). Hinweis: In dieser Phase sollten drei unterschiedliche Zell Bands offensichtlich (Abbildung 1A) sein. Die obersten Bänder (zwischen 1077 und Plasma) enthält mononuklearen Zellen (MNC) und Thrombozyten, und der mittlere Band (zwischen 1007 und 1119) enthält polymorphkernigen Zellen (PMN) und unteren Band (unter 1119) enthält Erythrozyten. </li><li> Sammeln Sie die MNC und PMN separat mit sterilen Glaspipetten ohne Störung der anderen Zell Bands. Kombinieren Sie die MNC Bevölkerung aus jedem Röhrchen in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die PMN Bevölkerung. </li><li> Hinzufügen von 4 Volumen RPMI zu jedem Röhrchen, enthaltend die MNC und PMN-Fraktionen, die jeweils mit den Dichtegradienten verdünnen. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 700 g für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> MNC Zellpellet resuspendieren und PMN Zellpellet in 1 ml RPMI mit 0,5% ultra-reinen fettsäurefreies BSA (RPMI-BSA) und Transfer zum 1,5-ml-Röhrchen steril. Pellet die Zellen unter Verwendung eines Tisch picofuge 30sek. </li><li> Überstand verwerfen und Pellet resuspendieren jede Zelle in 80 ul RPMI-BSA. </li><li> Mit 20 ul magnetischen Kügelchen antiCD14 markiertem Antikörper zu dem Röhrchen mit dem MNC-Fraktion zur positiven Selektion von Monozyten. Für das Röhrchen mit dem PMN Zellfraktion, mit 20 ul magnetischen Kügelchen markierten Antikörper-antiCD15 für positive Selektion von Neutrophilen. Inkubieren jeder Zellsuspension für 15 min bei 4 º C. </li><li> Waschen Sie jede Zellsuspension mit 1 ml RPMI-BSA Medien und Pellet wie vorher und resuspendieren jedes Pellet in 500 ul RPMI-BSA. </li><li> Die markierten Zellen werden in dem Magnetfeld der magnetischen Zellsortierung (MACS) abgetrennt. Vorbereitung der MACS LS Spalten (eine für jeden Zellsuspension), indem die Spalte auf der MACS-Separator und Waschen mit 3 ml RPMI-BSA vor der Zugabe der Zellsuspension. </li><li> Nach der Anwendung von Zellsuspensionen, waschen jede Spalte 3x mit 3 ml RPMI-BSA Medien (achten Sie darauf, lassen Sie die Medien drain vollständig zwischen Waschungen). Sammeln Sie die Zellsuspension Durchfluss-und Spalten wäscht in einem sterilen Röhrchen. </li><li> Um Monozyten und Neutrophilen zu isolieren, entfernen Sie die Säule aus dem Magnetfeld nach dem letzten Waschen und Elution der positiv markierten Zellen in einem sterilen Röhrchen mit 5 ml RPMI-BSA mit der Spalte Kolben. </li><li> Zur Isolierung Lymphozyten zu pelletieren die Durchfluss-Waschfraktion der MNCs aus Schritt 1.15 bei 300 g für 10 min. Überstand verwerfen und Zellpellet in 80 ul RPMI-BSA. In 20 ul CD61 und CD235a Antikörper und Inkubation Zellsuspension für 15 min bei 4 º C Wiederholen Sie den MACS-Trennung vor und sammeln die Strömung durch die die Lymphozyten. </li><li> Um nach wie vor (Schritt 1,9) Diabolo Monozyten, Neutrophile und Lymphozyten Fraktionen, Zentrifuge und Überstände verwerfen. Zellpellets sollten in 1 ml extrazellulären Flussmedien (XF-DMEM) für die Zählung erneut suspendiert werden. &lt;br /&gt; Hinweis: 8 ml Vollblut in 5.1 x 10 6 Monozyten / ml, und 5-20 x 10 6 Lymphozyten und Neutrophile / ml führen. </li><li> Um Thrombozyten, Zentrifuge PRP (Schritt 1.2) für 8-10 min bei 1.500 × g bei Raumtemperatur zu isolieren. Entfernen des Plasmas und waschen Zellpellet einmal mit 5 ml steriler PBS, ergänzt mit 1 &amp;mgr; g / ml PGI 2, repellet auszusetzen und endgültige Pellet in 1 ml PBS-Puffer PGI 2. </li><li> Bestimmen Thrombozytenzahl durch Turbidimetrie, wenn die Blutplättchen in PBS-Puffer von PGI 2 Spektrophotometer wie Walkowiak et al suspendiert, die folgende Gleichung: [6,23 / (2,016 - Abs 800)] - 3,09 x Verdünnungsfaktor = # x 10 8. Thrombozyten / ml 12. </li></ol> 2. Überzug der Zellen <ol><li> Herstellung von Zell-Tak (Zell Kleber): In 90 ul Zell Klebstoff zu 180 ul diH 2 0, 540 ul 0,1 N Natrium-biCarbonat (pH 8,0) und Einstellen des pH auf 7,2-7,8 ​​unter Verwendung von 1 N NaOH. Bereiten XF Platten (24-well, V7 Mikroplatten) durch Beschichtung jede Vertiefung mit 30 ul hergestellten Zellkleber. Hinweis: Die Zelle Klebstoff sollte für jede Verwendung frisch hergestellt werden. </li><li> Inkubieren Platte bei 37 ° C für 20-30 Minuten und dann gründlich absaugen und waschen zelladhäsiven Vertiefungen mit PBS zweimal (1 ml / Vertiefung). </li><li> Führen Sie eine Zellzahl auf isolierten Monozyten, Lymphozyten, Neutrophile und Thrombozyten und in angemessener Lautstärke mit XF-DMEM, eine Aussaatdichte von 250 T-Zellen / well, Monozyten, Lymphozyten und Neutrophile zu ermöglichen, und 25 x 10 6 / gut für Thrombozyten. Alternativ zur oxidativen Burst Reaktion messen, Neutrophilen kann 125k Zellen / Well ausgesät werden. Die letzte Aussaat Lautstärke für jeden Zellsuspension sollte 200 ul / gut. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 g für 1 Sekunde ohne Bremse. Drehen Sie die Platte 180 ˚ und Zentrifuge wieder ohne Bremse bei 300 x g. </li><li> Bringen letzten gut volStärke in 660 &amp;mgr; l DMEM mit XF-und bei 37 º C für 30 min vor der XF-Assay. Anmerkung: Mikrophotographien von plattierten Zellen vor und nach dem Test kann verwendet werden, um eine angemessene Beschichtung zu gewährleisten und auszuschließen Zellablösung werden. </li></ol> 3. Herstellung einer 24-Well-Extrazelluläre Flux Assay-Kennzeichen (XF24) <ol><li> Hydrate XF-Sonden mit Kalibrierungslösung für mindestens 2 Stunden vor dem Test. </li><li> Bereiten 10x Bestände von 0,5 ug / ml Oligomycin 0,6 uM FCCP und 10 uM Antimycin A in XF-DMEM und Last 75 ul von Stammlösungen in die Patrone Einspritzöffnungen in der obigen Reihenfolge. Wenn oxidativen Burst-Messungen zu erhalten sind, können Injektion von 10-faches von 100 ng / ml PMA nach Antimycin-A injiziert werden. </li><li> Kalibrieren Sie den hydratisiert und geladenen Patrone und führen Sie die XF-Assay. Die detaillierten Verfahren für die Analyse und Interpretation der beiden Sauerstoffverbrauch und pH-Veränderungen wurden in früheren Publikationen 9,13,14 beschrieben und sind nicht dim Detail iscussed hier. </li><li> Nach XF Assay absaugen alle, aber die letzten 50 ul der XF-DMEM nach Assay zum Verlust von Zellen von der Platte zu verhindern, und 50 ul RIPA Zelllysepuffer und führen Sie einen Protein-Assay für die Normalisierung. </li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+mitophagy+activation+in+blood+mononuclear+cells+of+fibromyalgia+patients:+implications+in+the+pathogenesis+of+the+disease.">Mitochondrial dysfunction and mitophagy activation in blood mononuclear cells of fibromyalgia patients: implications in the pathogenesis of the disease.</a> Arthritis Res. Ther. 12, R17 (2010).</li><li>Japiassu, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+failure+of+human+peripheral+blood+monocytes+in+patients+with+septic+shock+is+mediated+by+reduced+F1Fo+adenosine-5'-triphosphate+synthase+activity.">Bioenergetic failure of human peripheral blood monocytes in patients with septic shock is mediated by reduced F1Fo adenosine-5'-triphosphate synthase activity.</a> Crit. Med. 39, 1056-1063 (2011).</li><li>Widlansky, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+membrane+potential,+mass,+and+morphology+in+the+mononuclear+cells+of+humans+with+type+2+diabetes.">Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2 diabetes.</a> Transl. Res. 156, 15-25 (2010).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ageing+and+Alzheimer's+disease+on+mitochondrial+function+of+human+platelets.">Effects of ageing and Alzheimer's disease on mitochondrial function of human platelets.</a> Exp. Gerontol. 43, 589-594 (2008).</li><li>Avila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+mitochondrial+dysfunction+is+evident+in+type+2+diabetes+in+association+with+modifications+of+mitochondrial+anti-oxidant+stress+proteins.">Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120, 248-251 (2012).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab. Invest. 93, 690-700 (2013).</li><li>Hill, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cellular+bioenergetics+with+mitochondrial+quality+control+and+autophagy.">Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy.</a> Biol. Chem. 393, 1485-1512 (2012).</li><li>Hultqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+autoimmunity,+arthritis,+and+encephalomyelitis+in+mice+with+a+reduced+oxidative+burst+due+to+a+mutation+in+the+Ncf1+gene.">Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12646-12651 (2004).</li><li>Rosa-Borges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency+with+recurrent+infections:+case+report.">Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency with recurrent infections: case report.</a> J. Ped. 77, 331-336 (2001).</li><li>Walkowiak, B., Kesy, A., Michalec, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+reader--a+convenient+tool+in+studies+of+blood+coagulation.">Microplate reader--a convenient tool in studies of blood coagulation.</a> Thromb. Res. 87, 95-103 (1997).</li><li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling.">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radic. Biol. Med. 51, 1621-1635 (2011).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp.. (46), e2511 (2010).</li></ol>

VDU ist ein Mitglied der Seahorse Bioscience Scientific Advisory Board.

Dieses Protokoll stellt die Zusammenstellung mehrerer häufigsten verwendeten Techniken für die Blutzellisolation in einer für die Analyse der Bioenergetik Weise. Sind die zusammenhängenden Techniken vorgestellt vorteilhaft zu anderen Trennverfahren (zB FACS-Analyse) für ihre Fähigkeit, eine große Anzahl von Zellen in kontrollierten Medien Bedingungen mit minimalen Belastungen auf den isolierten Zellen platziert isolieren. Es hat den Nachteil der langen Isolierungen auch mit minimalen Unterbrechungen. Dieses Protokoll dient als Grundlage für die Isolierung von primären Blutzellen aus menschlichen Probanden, die in klinischen und translationalen Forschung extrapoliert werden kann. MACS ist eine zuverlässige Trennung Zellisolationsverfahren, das die Möglichkeit zur Isolierung von Zellen direkt aus Vollblut bietet, jedoch erfordert dieses Verfahren größere Mengen an Antikörper und ist nicht optimal für die Trennung aller vier verschiedene Zelltypen, wie in diesem Verfahren beschrieben. Es hat been keine Beweise, um zu zeigen, dass die positive Selektion von Leukozyten durch MACS Trennergebnisse bei der Aktivierung mit unserer Isolation Protokoll. MACS Spalten funktionieren durch Sequestrierung von markierten Zellen in einem Magnetfeld unter Verwendung von Antikörpern zu 50 nm superparamagnetischen Teilchen konjugiert. Markierten Zellen werden dann aus der Säule eluiert. Positive und negative Selektionen werden in diesem Protokoll implementiert, um schnelle Isolierung und Reinheit zu gewährleisten. Wenn nicht genug Zellzahlen werden aus der Isolation erhalten oder Reinheit in Frage, mehr Antikörper kann der Probe nach Anweisung des Herstellers und zweiten Durchgang durch den LS Spalte hinzugefügt werden können, in größerer Reinheit (Tabelle 2) führen. Unser Labor fand hohe Reinheit und Beschichtungseffizienz mit Hilfe der bestehenden Protokolls durch die Analyse von Zellsuspensionen Abschluss durch FACS-Analyse 8. Extrazelluläre Fluss Analysatoren haben die Möglichkeit, sowohl den Sauerstoffverbrauch und Medien Versauerung in Echtzeit über die der ot überwachenihr Elektroden. Der Sauerstoffverbrauch durch den oxidativen Burst in Monozyten Reaktion und Neutrophile beobachtet NADPH-Oxidase-abhängige wie durch Hemmung mit DPI 8 gezeigt. Wir haben eine zeitabhängige Verlust in oxidativen Burst Kapazität bei längerer oder Isolierungen erweitert XF-Tests gesehen. Dieses Protokoll wurde für die Verwendung im XF24 entworfen und entwickelt, sondern ist auch mit dem XF96 kompatibel zu etwa ein Drittel bis eine Hälfte der Zelle XF24 Einsaatdichten (Abbildung 3). Im Entwurf des Protokolls wurde die Einhaltung der bestehenden Protokollen für jede Technik für optimale Leistung mit Modifikationen vorgenommen hat, nur um Medienbedingungen für bioenergetische Analyse Kontrolle erforderlich. Nach dem Mastering-Techniken kann ein solches Protokoll in einer breiten Palette von Translations-und Forschungsanwendungen verwendet werden, um die Toxizität und Wirksamkeit von Behandlungsstrategien zu messen, zu erkunden metabolischen Eigenschaften der Krankheit, und Oxidationsmittel-Produktion durch Monozyten-und neut werdenrophils bei Entzündungen.

Überwachen des bioenergetischen Gesundheits von Immunzellen (Monozyten, Lymphozyten, Neutrophile) und Blutplättchen aus dem Blut ist seit einiger Zeit als ein potentiell nützliches Diagnosewerkzeug, um die Gesamt bioenergetischen Gesundheitszustand einer Person zu beurteilen erkannt. Es ist eine neue Körper der Literatur zuschreibt eine Reihe von Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und neurodegenerativen Krankheiten zu mitochondriale Dysfunktion 1,2. Dies ist klinisch wichtig, da die mitochondriale Dysfunktion kann eine Reihe von zellulären Ereignissen, die pro-inflammatorische Signalwege zu fördern oder zu Zelltod einzuleiten. Mehrere Studien haben die mitochondriale Funktion von peripheren mononukleären Blutzellen und Plättchen in Erkrankungen wie Fibromyalgie, Diabetes, septischem Schock, Alzheimer-Krankheit und 3-7 gekennzeichnet. Zum Beispiel eine aktuelle Studie untersuchte die Bioenergetik von Blutplättchen als Marker für die Funktion der Mitochondrien und fand, dass Thrombozyten von Typ-2-Diabetikeric Patienten hatten mitochondriale Sauerstoffverbrauch 7,8 verringert. Aus diesen Erkenntnissen und anderen, ist es klar, dass Monozyten, Lymphozyten, Neutrophile und Thrombozyten können als Surrogatmarker der Veränderungen in der Bioenergetik unter pathologischen Bedingungen zu dienen, da sie überblicken den systemischen Kreislauf und können lokale und globale Stoffwechselveränderungen zu reflektieren. Um festzustellen, ob dieser Ansatz hat prognostischen oder diagnostischen Wert eine hohe Durchsatzanalyseverfahren und eine einheitliche Methode für die Zell Vorbereitung erforderlich. Die Methoden, um die Funktion der Mitochondrien in Leukozyten und Thrombozyten messen zuvor beteiligt Isolierung von Mitochondrien oder Beurteilung der zellulären Bioenergetik in intakten Zellen 4,9. Der Vorteil der zellulären bioenergetischen Bewertung mit einer extrazellulären Fluss (XF)-Analysator ist, dass die Funktion der Mitochondrien in den Zellen mit endogenen Substraten und Atmungsparameter wie Protonenleck und maximale Atmungs eingerichtet werdenKapazität bestimmt werden. Wir und andere haben diese Technik verwendet, um zu zeigen, dass bioenergetische Profile in Thrombozyten, Monozyten und Lymphozyten aus menschlichem Blut isoliert etabliert und kann im Vergleich zu Zelltypen 8 werden. Außerdem sind beide Neutrophilen und Monozyten besitzen einen oxidativen Burst-Eigenschaft, in der NADPH-Oxidasen aktiviert und verbrauchen Sauerstoff in Superoxid. Wichtig ist, dass dieser Weg ein wichtiger Bestandteil der angeborenen Immunität und wird durch systemische Entzündung moduliert. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Veränderungen in der oxidativen Burst Kapazität mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen wie Multiple Sklerose, Arthritis und wiederkehrenden Infektionen 10,11 verbunden. Derzeit gibt es keine hohen Durchsatz quantitative Tests zur Verfügung, um den oxidativen Burst in klinischen Proben zu messen. Dies ist wichtig, da die Charakterisierung der oxidativen Burst Kapazität von Neutrophilen und Monozyten kann auch als ein wichtiges diagnostisches Werkzeug für mehrere Pathologen dienengien. Die wichtigsten technischen Herausforderungen wurden geringe Empfindlichkeit für die Messung der Sauerstoffverbrauch mit herkömmlichen Techniken polarographischen und der Notwendigkeit, anhaftenden Zellen verwenden, wenn Sie empfindlicher Mikro fluorimetrischen Techniken. In diesem praktischen Video beschreiben wir die technische Lösung für diese Probleme. Wir detailliert die Methoden zur Isolierung, Beschichtung und Messung der Bioenergetik von Monozyten, Lymphozyten, Neutrophile und Thrombozyten und der oxidativen Burst von Monozyten und Neutrophilen aus menschlichem Blut. Diese Methode eignet sich für die klinische Beurteilung der Bioenergetik und oxidativen Burst für die Ermittler, die haben Zugang zu einer Patientenpopulation und der Fähigkeit, frische Blutproben zu erhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-094-833</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"><a name="RANGE!A3">CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human</a></td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-501</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD61 MicroBeads, human&#160; for platelets</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-051-101</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD14 MicroBeads, human&#160; for monocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-201</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD15 MicroBeads, human&#160; for granulocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-046-601</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">LS Columns</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-042-401</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">BD Vacutainer ACD Blood collection tubes</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">02-684-26</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">11835-030</td>
			<td style="width:215px;">with L-glutamine and without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Prostaglandin I2, sodium salt</td>
			<td style="width:215px;">Cayman</td>
			<td style="width:215px;">18220</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">1.5 ml semi-micro cuvettes</td>
			<td style="width:215px;">Phenix Research Products</td>
			<td style="width:215px;">SC-2410</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.077</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">10771</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.119</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">11191</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td style="width:215px;">Roche</td>
			<td style="width:215px;">3117405001</td>
			<td style="width:215px;">fatty-acid ultra-free</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8139</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">100850-001</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DMEM</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">MT90113PB</td>
			<td style="width:215px;">w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">L-Glutamine, 200mM (100x)</td>
			<td style="width:215px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:215px;">25030-081</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">G7528</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8574</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Cell-Tak (cell adhesive)</td>
			<td style="width:215px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">CB-40242</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">O4876</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A8674</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C-2920</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent A</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0113</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent S</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0015</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent B</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0114</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Vendor</td>
			<td style="width:215px;">Product #</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Seahorse</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-090-976 and 24039</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets

Mitochondriale Funktionsstörung ist bekannt, eine wichtige Rolle in einer Reihe von pathologischen Zuständen, wie Atherosklerose, Diabetes, septischer Schock, und neurodegenerative Krankheiten, sondern die Beurteilung von Veränderungen in bioenergetischen Funktion bei Patienten ist eine Herausforderung zu spielen. Obwohl Erkrankungen wie Diabetes oder Atherosklerose vorliegenden klinisch bestimmten Organ Beeinträchtigung, die systemischen Komponenten der Pathologie, wie Hyperglykämie oder Entzündung kann bioenergetischen Funktion der zirkulierenden Leukozyten oder Blutplättchen zu verändern. Dieses Konzept hat sich vor einiger Zeit erkannt worden, aber seine weit verbreitete Anwendung ist durch die große Anzahl von Primärzellen für Bioenergetische Analyse benötigt eingeschränkt. Diese technische Einschränkung wurde durch die Kombination der Spezifität der magnetischen Kügelchen Isolationstechniken, Zelladhäsion Techniken, die Zellen ohne Aktivierung zu ermöglichen Mikroplatten befestigt werden überwunden, und die Empfindlichkeit der neuen Technologien für hohen Durchsatz ausgelegt microplate Respirometrie. Ein Beispiel für dieses Gerät ist die extrazelluläre Fluss Analysator. Solche Instrumente verwendet in der Regel Sauerstoff-und pH-empfindliche Sonden an Veränderungsraten in diesen Parametern in adhärenten Zellen, die dann um den Stoffwechsel bezogen werden können, zu messen. Hier werden wir ausführlich die Methoden zur Isolierung und Beschichtung von Monozyten, Lymphozyten, Neutrophile und Thrombozyten, ohne Aktivierung, aus menschlichem Blut und der Analyse der mitochondrialen bioenergetischen Funktion in diesen Zellen. Darüber hinaus zeigen wir, wie die oxidative in Monozyten und Neutrophilen-Burst kann auch in den gleichen Proben gemessen werden. Da diese Verfahren nur 8-20 ml menschlichem Blut haben Potential zur Überwachung Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und bioenergetischen in einer klinischen Umgebung.

Um die Bioenergetik von Blutzellen zu bewerten, ist Vollblut von Probanden durch Venenpunktion in einem EDTA oder ACD Vacutainer Sammelröhrchen gesammelt. Die Isolierung von Leukozyten und Thrombozyten nach der Blutentnahme ist in 1A visualisiert, wie im Protokoll aufgeführt. Vollblutproben werden innerhalb von 8 h Kollektion verarbeitet, um den Zelltod und Aktivierung zu vermeiden. Erweiterte Lagerzeiten von mehr als 8 Stunden wurden nicht getestet, kann aber in veränderter Bioenergetik führen und weniger Vertreter der physiologischen Bedingungen. Säure-Citrat-Dextrose (ACD-8 ml) und EDTA-Vacutainer-Röhrchen wurden für Zellisolierungen ohne beobachtete Effekt auf die bioenergetische Funktion der isolierten Zellen verwendet worden. Antikoagulantien sind notwendig, da Blutgerinnsel verringern die Anzahl der Zellen erhalten, stören richtige Phasenbildung während Ficollgradientenzentrifugation und führen zu wenig bis gar keine Blutplättchen in zentrifugiert Serum erhalten. Alle Blut stellt eine biologischschen Gefahr und richtige persönliche Schutzausrüstung muss während des gesamten Verfahrens auch nach Zellpopulationen isoliert oder Zelllysaten erzeugt werden implementiert werden. Die Proben sind entsprechend den menschlichen Entsorgungsstandards der Einrichtung entsorgt werden. Vollblut wird zentrifugiert, um das plättchenreiche Plasma aus dem Buffy-Coat, der weißen Schicht gerade oberhalb der gepackten roten Blutkörperchen, die Leukozyten enthält, zu trennen. Die Buffy Coat wird Dichtegradienten aufgetragen und zentrifugiert, um die peripheren mononukleären Blutzellen (Monozyten und Lymphozyten) und polymorphkernige Zellen (Granulozyten) zu erhalten. RBC-Kontamination der einzelnen MNC und PMN Zellphasen zu diesem Zeitpunkt häufig und sollten während des MACS Reinigung gelöst werden. Die verschiedenen Zelltypen werden dann durch Inkubation mit magnetischen Antikörpern erhalten zu reinen Fraktionen erhalten. Monozyten werden durch Inkubation der PBMC-Fraktion mit CD14, dem Durchfluss von t gesammeltener Monozyten Lymphozyten enthalten, die dann von roten Blutkörperchen und Blutplättchen erschöpft. Die Neutrophilen werden durch Inkubation der polymorphkernige Zellschicht mit CD15-Antikörper (Fig. 1A) erhalten. Danach können die Blutplättchen durch Zentrifugation von dem plättchenreichen Plasma pelletiert und gewaschen, um andere Plasmabestandteile zu entfernen. Nach dieser Auswahl die Blutplättchen, CD14 + Monozyten, Lymphozyten, CD15 + Neutrophilen gezählt und plattiert werden auf einer Zelladhäsion mittelbeschichteten XF Analysator Platte für Bioenergetik und oxidativen Burst-Analyse. Jede Stufe des Verfahrens sollte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden und wird empfohlen, um eine vorzeitige Aktivierung des oxidativen Burst in Monozyten Reaktion und Neutrophilen verhindern. Ein Indikator von weniger als sterilen Bedingungen bei der Isolierung ist offensichtlich, wenn Neutrophilen, die unter basalen Bedingungen wenig bis gar keine Sauerstoffverbrauch haben, beginnen die extrazelluläre Flusstest mit erhöhten OCR-Messungen, dieschrittweise zu erhöhen oder zu abzulehnen während des Tests. Wir unterstreichen die Bedeutung der Bildgebung von Zellen mittels Lichtmikroskopie bei 200-facher oder höher, um sicherzustellen, dass keine morphologischen Zeichen der Aktivierung haben vor dem Test aufgetreten. Zum Beispiel Neutrophile normalerweise eine abgerundete unregelmäßige Form angezeigt mit ausgeprägter Zellgrenzen, wie in Fig. 1B zu sehen. Allerdings werden diese Zellen auf die Oberfläche der Platte flach, wenn sie aktiviert und verlieren ihre unterschiedliche Zellmorphologie. Wir haben bereits berichtet, die morphologischen Veränderungen der aktivierten Leukozyten und Thrombozyten mit diesem Protokoll und zusätzliche Maßnahmen zu ergreifen, um sterile Bedingungen zu gewährleisten, wenn der Begegnung Aktivierung 8. Ein vereinfachtes Schema des Protokolls ist in Abbildung 2 als Zeittabelle, in der die wichtigsten Schritte der Zellisolierung, XF Plattenvorbereitung und XF-Assay sind detaillierte gesehen. Isolierung besteht aus der Dichtegradienten Abtrennung von Zelltypen unddurch magnetische Trennung folgt. Parallel zur Zellisolierung Prozess, XF Plattenvorbereitung notwendig, um Verzögerungen bei der Zellbeschichtung oder dem Beginn der XF-Assay zu vermeiden. Dies ist entscheidend, weil erhebliche Verspätungen zu-Zell-Aktivierung und verminderte Bioenergetik Parameter führen. Unzureichende Zellkonzentrationen nach der Isolierung sind ein häufiges Problem und Optimierung jedes Zentrifugation Prozess ist notwendig, um Zellverlust zu vermeiden. Erfolgreiche Isolierungen wurden auf weniger als 6 ml Blut durchgeführt wurde, aber in Abhängigkeit von zirkulierenden Konzentrationen des gewünschten Zelltyps können Änderungen vorgenommen werden. Wenn die Dichte Gradienten unsachgemäß vorbereitet, kann verschiedene Zell Phasen nicht sichtbar sein und der Verlust von Zellen auftreten (siehe JoVE Lehr-Video für eine visuelle Demonstration). Zu wenig Blutplättchen aus dem PRP isoliert ist selten, aber liegt vor, wenn Waschpuffer nicht PGI 2 enthält oder wenn die Isolierung unterhalb der Raumtemperatur stattfindet. Die Gefahr der Thrombozyten einctivation wird oft verhindert werden, wenn Thrombozyten sind die letzten Zellen isoliert werden, aber wenn Thrombozyten bleiben in Waschpuffer für längere Zeit die Bioenergetik betroffen sein werden. Es wurden Fälle von kleineren Plättchenpopulationen, die nicht während der 1.500 xg Zentrifugation pelle hat und die bioenergetischen dieser Zellen wurde nicht ausführlich charakterisiert. Siehe Tabelle 2 für eine vollständige Anleitung zur Fehlerbehebung. Bioenergetischen Profile von Leukozyten und Blutplättchen mit der XF-Analysator, der Echtzeit-O 2-Verbrauchs in Zellen mißt nichtinvasiv bestimmt werden. Jeder Zelltyp auf der XF24 Platte mit fünf Wiederholungen plattiert, wie in der 3A gezeigt. Tabelle 1 zeigt die erwartet basalen und oxidativen Burst-Werte von Zelltyp während des Tests und den durchschnittlichen Proteinkonzentrationen pro Vertiefung. Hochdurchsatz-Technologien zur Verfügung, wie der XF96, die ermöglichtvier Spendern, gleichzeitig, wie in 3B gezeigt, beurteilt werden. Nach dem Test werden die Daten auf einen Arbeitsplatzrechner für die Analyse unter Verwendung der geeigneten Software und XF Microsoft Excel exportiert. Die OCR-Werte wurden auf den Gesamtproteingehalt in den entsprechenden Vertiefungen normiert und als pmol / min / mg Protein. Die repräsentativen bioenergetischen oxidativen Burst-Profile der einzelnen Zelltyp wurden kürzlich von unserer Gruppe 8 angegeben. Die weitere Analyse der bioenergetischen Parameter des Tests (basal, ATP-gebundenen Protonen Leck, maximal, nonmitochondrial und oxidativer Burst) kann für einzelne Vertiefungen wie zuvor gezeigt, und unter 8 beschrieben, berechnet werden. Die basale Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) wird durch den ersten 3 Messungen festgestellt, wie in Fig. 4A gezeigt. Oligomycin (0,5 ug / ml), ein Inhibitor der mitochondrialen ATP-Synthase in der XF Medium injiziert wird, um zu ermitteln, um die OCR-ATP-Synthese gekoppelt und Vertre<html> ted als ATP-verknüpft. Die Rest OCR abzüglich der nonmitochondrial OCR können Protonenleck zurückzuführen. Dann FCCP Entkoppler wird gegeben, um die maximale OCR, gefolgt von Antimycin-A, ein Inhibitor der mitochondrialen Atmung, um nonmitochondrial Quellen Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Reservekapazität ist ein Maß der Menge an ATP, die unter energetischen Bedarf hergestellt werden können und als die Differenz zwischen der maximalen Rate der Atmung und der basalen berechnet. Um den oxidativen Burst Kapazität zu bestimmen, Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) ein PKC-Agonisten injiziert, um NADPH-Oxidase-Aktivität zu erhöhen und die Erhöhung der Sauerstoffverbrauchsrate nach PMA-Stimulation mit der XF-Analysator gemessen werden. 4B zeigen, wie die verschiedenen Parameter der Funktion der Mitochondrien und oxidativer Burst berechnen. <html> 1301/51301fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Isolierung von Leukozyten und Thrombozyten aus Vollblut. A) Frisch gesammelten Proben werden durch Zentrifugation in ihre Plasma und Zellbestandteile getrennt und durch Ficoll-Dichtegradienten gereinigt und Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) von positiven (Monozyten und Neutrophilen) oder negative Selektion (Lymphozyten), während die Thrombozyten werden durch hohe isoliert Speed-Zentrifugation der plättchenreiches Plasma. B) Bilder der isolierten Zellpopulationen XF einmal in DMEM resuspendiert und bei der angegebenen Zelldichten plattiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51301/51301fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ghres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Vorbereitung der XF24 Platten für Bioenergetische Studien von Leukozyten und Thrombozyten. Detaillierte Zeitplan für die Vorbereitung einer XF24 Testplatte durch Zellisolierung und-Beschichtung und Patrone Hydratation und Injektionsöffnung Belastung. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig3.jpg" /> Abbildung 3. Aufbau der Leukozyten und Blutplättchen auf XF24 und XF96-Analysator-Platten. A) Leukozyten (125-250k Zellen / Vertiefung) und Thrombozyten (25 x 10 6 Zellen / Well) von einem einzigen Spender werden auf der Testplatte unter XF24 Hintergrund vergoldet Kontrollen. 75 ul 10x Bestände Oligomycin (0,5 ug / ml), FCCP (0,6 uM), Antimycin A (10 &amp;mgr; M) und PMA (100 ng / ml) in Medium verdünnt XF werden geladenauf die angegebenen Einspritzöffnungen. B) Leukozyten (75-150k Zellen / Vertiefung) und Plättchen (10 x 10 6 Zellen / Vertiefung) von weniger als vier Geber auf der XF96 in einem Gesamtvolumen von 180 &amp;mgr; l DMEM-XF werden. 20 ul 10x Bestände Oligomycin (1,0 ug / ml) werden FCCP (0,6 uM), Antimycin A (10 &amp;mgr; M) und PMA (100 ng / ml) in DMEM-XF in den angegebenen Einspritzöffnungen geladen. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig4.jpg" /> Abbildung 4. Bioenergetische Analyse der Indizes. A) Repräsentative Spur von Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von Mitochondrien und oxidativen Burst in Monozyten. Basal OCR ansässig ist (ersten 3 Preise durch Zahlen in den Kreisen angedeutet). Dann aufeinanderfolgende Zugaben von Oligomycin (O, 0,5 ug / ml), FCCP (F, 0,6 &amp;mgr; M) und Antimycin-A (A; 10 uM) werden eingespritzt, um die mitochondriale Atmung und nonmitochondrial von nicht-aktivierten Zellen zu bestimmen. Schließlich PMA (100 ng / ml) wird zugesetzt, um oxidativen Burst. B messen) Modulare Analyse der Funktion der Mitochondrien und oxidativer Burst sind durch die Unterschiede in den Raten wie angegeben berechnet. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:215px;"></td><td style="width:215px;"> Optimale Aussaatdichte </td><td style="width:215px;"> Rel. Basal OCR (pmol O 2 / min) </td><td style="width:215px;"> Rel. Oxidativer Burst OCR (pmol O 2 / min) </td><td style="width:215px;"> Rel. Protein (ug) / gut </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Monozyten </td><td> 250k Zellen / </td><td> 83,9 (± 13,0) </td><td> 300,3 (± 58,8) </td><td> 19,0 (± 2,4) </td></tr><tr height="40"><td height="40"style = &quot;height: 40px;&quot;&gt; Neutrophile </td><td> 250k Zellen / </td><td> 6,1 (± 2,2) </td><td> 1411,8 (± 233,3) </td><td> 20,6 (± 2,7) </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Lymphozyten </td><td> 250k Zellen / </td><td> 52,9 (± 7,7) </td><td> 15 (± 4,1) </td><td> 13,2 (± 2,1) </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Thrombozyten </td><td> 25 x 10 6 Zellen / Well </td><td> 199,4 (± 20,3) </td><td> 24 (± 2,7) </td><td> 47,5 (± 3,1) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Normale Parameter für die XF24-Test: Die durchschnittliche basale (Rate 3) und oxidativen Burst (Rate 7) OCR nicht nonmitochondrial OCR oder Protein korrigiert werden von Zelltyp zu den angegebenen Zelldichten überzogen dargestellt. Die durchschnittliche Proteingehalt pro Vertiefung dargestellt, wie durch einen Gleichstrom Lowry-Assay durchgeführt. Diese Daten stellen die Mittelwerte6-8 gesunden Spendern mit Klammern enthalten, ± SEM. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="4" /></colgroup><tbody><tr height="66"><td> Schritt </td><td> Problem </td><td> Mögliche Ursache </td><td> Lösung </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.2 </td><td style="width:199px;"> klare Plasma </td><td style="width:199px;"> Blutplättchen während der Zentrifugation pelletiert </td><td style="width:199px;"> verringern Zentrifugation Zeit auf 10 min oder langsam zu 400 xg </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> milchig-Plasma </td><td style="width:199px;"> überschüssige Lipide </td><td style="width:199px;"> vermeiden postprandiale Sammlung </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.6 </td><td style="width:199px;"> unvollständige Zellbändern gebildet </td><td style="width:199px;"> KoboldRoper Gradienten Vorbereitung, Kälte-Reagenz </td><td style="width:199px;"> nicht zu stören Gradienten beim Pipettieren, Verwendung Raumtemperatur Reagenz </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> Klumpen in Zell Bands </td><td style="width:199px;"> Gerinnung des Blutes stattgefunden haben könnte </td><td style="width:199px;"> Sammle Blut mit Antikoagulantien wie ACD oder EDTA </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.10 </td><td style="width:199px;"> keine Zellpellet </td><td style="width:199px;"> siehe Schritt 1.6 </td><td style="width:199px;"> Wenn trübe Überstand siehe unten </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> trübe Überstand </td><td style="width:199px;"> Schwere Ficollgradienten Verschmutzung, Kontamination Thrombozyten </td><td style="width:199px;"> Steigern Zentrifugationsgeschwindigkeit bis 900 g, diLaute mit RPMI </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.16, 1.17 </td><td style="width:199px;"> geringe Ausbeute von Leukozyten </td><td style="width:199px;"> RBC schwere Kontamination, nicht genug, Vollblut, Gerinnungs </td><td style="width:199px;"> Doppel-Antikörper-und RPMI-BSA-Bände, mehr Blut zu sammeln, fügen Antikoagulans </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1,19 </td><td style="width:199px;"> Plättchenaggregation </td><td style="width:199px;"> PGI 2 weggelassen, Erkältung Medien, längerer Lagerung im Plasma </td><td style="width:199px;"> hinzufügen PGI 2 Thrombozytenwaschpuffer, Verwendung Raumtemperatur Reagenzien </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1,20 </td><td style="width:199px;"> niedrige Thrombozytenzahl </td><td style="width:199px;"> Verlust während der primären Zentrifugation, die Thrombozytenaggregation </td><td style="width:199px;"> SehenSchritte 1.2 und 1.19 </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 2.3 </td><td style="width:199px;"> RBC Kontamination </td><td style="width:199px;"></td><td style="width:199px;"> Wiederholen MACS Trennung </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Leukozyten-und Thrombozyten Isolierung der Fehlersuche. Tabelle sind häufige Probleme bei Leukozyten-und Thrombozytenzellisolierung aus Vollblut und Lösungen, die den Benutzer durch den Fehlerbehebungsprozess angetroffen.

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Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Blut-Leukozyten und Blutplättchen können als Marker der Gesamt bioenergetischen Gesundheit einer Person verwendet werden und so das Potenzial haben, pathologische Prozesse und die Auswirkungen der Behandlung zu überwachen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zu isolieren und zu messen, die Funktion der Mitochondrien und die oxidative Burst in diesen Zellen.

Bioenergetik und die Oxidative Burst: Protokolle für die Isolierung und Bewertung der menschlichen Leukozyten und Thrombozyten

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

bioenergetics-oxidative-burst-protocols-for-isolation-evaluation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.9K Aufrufe.  University of Alabama at Birmingham.  Blut-Leukozyten und Blutplättchen können als Marker der Gesamt bioenergetischen Gesundheit einer Person verwendet werden und so das Potenzial haben, pathologische Prozesse und die Auswirkungen der Behandlung zu überwachen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zu isolieren und zu messen, die Funktion der Mitochondrien und die oxidative Burst in diesen Zellen. 

Serie: Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

Muster-Triggered Oxidative Burst und Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect of breast milk (BM). Unless access to clean water and appropriate infant formula is reliable, the WHO does not recommend cessation of breastfeeding for HIV-infected mothers. Numerous factors likely work in tandem to reduce BM transmission. Breastfed infants ingest ~105&#8722;108 maternal leukocytes daily, though what remains largely unclear is the contribution of these cells to the antiviral qualities of BM. Presently we aimed to isolate cells from human BM in order to measure antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), one of the most essential and pervasive innate immune responses, by BM phagocytes against HIV targets. Cells were isolated from 5 human BM samples obtained at various stages of lactation. Isolation was carried out via gentle centrifugation followed by careful removal of milk fat and repeated washing of the cell pellet. Fluorescent beads coated with HIV envelope (Env) epitope were used as targets for analysis of ADCP. Cells were stained with the CD45 surface marker to identify leukocytes. It was found that ADCP activity was significant above control experiments and reproducibly measurable using an HIV-specific antibody 830A.

Breast milk transmits human immunodeficiency virus (HIV), though only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected. Breastfed infants ingest ~105&#8722;108 maternal leukocytes daily, though these cells are understudied. Here we describe the isolation of breast milk leukocytes and an analysis of their phagocytic capacity.

Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Assay von HIV-Zielen

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...