Wir möchten Unterstützung von US-amerikanischen National Institutes of Health gewährt R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 und R01EB007279 und American Heart Association gewähren 0855772D anzuerkennen.

1. Großes Sehfeld Bildgebung von pO2 in kortikalen Gefäße der Ratte <ol><li> Ratten (250 g -350 g) werden zunächst mit Isofluran betäubt, und die Arteria und Vena femoralis sind katheterisiert auf Herzfrequenz, Blutdruck und Blutgase, sowie für intravenöse Infusion zu überwachen. Die Körpertemperatur ist bei 37 ± 0,1 ° C. Tracheotomie durchgeführt wird, und Ratten sind mit einer Mischung aus Luft und Sauerstoff belüftet. </li><li> Blutproben zur Messung der Blutgase sind alle 30-45 min genommen und Beatmung und Anästhesie werden angepasst, um die Blutgase innerhalb der normalen physiologischen Bereich zu halten. </li><li> Ein geschlossener Schädel-Fenster auf dem Scheitelbein 4 mm x 4 mm groß ist für die Bildgebung vorbereitet. Die Knochen und Dura entfernt und die kraniale Fenster ist mit 1,5% Agarose gefüllt und mit einem Mikroskop Deckglas. Eine zusätzliche 1 mm 2 Bohrloch auf dem Stirnbein wird verwendet, um CSD durch intrakortikale Mikroinjektion von KCl (~ 10 ul 1 M) zu induzieren. Extreme Vorsicht ist geboten, um eine Beschädigung der kortikalen Gefäße zu vermeiden. Überschüssige Wärme, mechanische Druck-oder kurzen Zeitraum von Hypoxie kann Bluthirnschranke und zu Undichtigkeiten des Farbstoffes aus dem Gefäßsystem Kompromiss in interstitiellen Raum. </li><li> Eine Maske aus optisch opaken Material ist rund kranialen Fenster platziert. Der Zweck der Maske wird auf Phosphoreszenz Signal, das aus dem Farbstoff, der in das Gewebe von den Rändern der Dura Sache durchgesickert kommt zu absorbieren. Der Farbstoff in den interstitiellen Raum ist die Quelle des sehr hellen Phosphoreszenz, dass die Messung verderben können. Die erhöhte Helligkeit des Farbstoffs in interstitiellen Raum ist das Ergebnis der Aufbau des Farbstoffes in einer Umgebung mit niedrigem Sauerstoffgehalt Druck und niedrigen Abkühlgeschwindigkeit. Der Schaden des Gefäßsystems in Experiment ist daher leicht durch Auftreten von hellen Flecken Phosphoreszenz, in welchem ​​Fall die experimentellen Daten abgelehnt wird anerkannt. </li><li> Nach Abschluss der Operation wird Isofluran eingestellt und Anästhesie ist die Chloralose (50 mg / kg iv Bolus von 40 mg / (kg h) Infusion) eingeschaltet. </li><li> Tier ist auf einem Wagen mit Ventilator, Blutdruck und Temperatur überwachen übertragen. Während die Atmung der Raumluft, wird das Tier schnell auf die Bildgebung Setup verschoben und wieder an den Durchflussmesser mit entsprechenden Gemisch aus Luft und Sauerstoff. </li><li> Die stereotaktischen Rahmen, dass das Tier hält, ist unter dem Ziel gestellt. Der kraniale Fenster in das Sichtfeld unter das Ziel zentriert und parallel zur Bildebene positioniert. </li><li> Der gepulste Laser wird eingeschaltet und auf minimale Pulsenergie. Der Lichtstrahl ist auf Pulsenergie Meter und Pulsenergie geliefert, um die Probe gerichtet wird angepasst, um nicht mehr als 10 mJ / cm 2. Der Strahl iss auf dem kranialen Fenster mit schrägen Einfallswinkel von ~ 60 Grad und Laser iss zentriert ausgeschaltet. </li><li> Blut-Gas-Messungen und Einstellungen der Lüftungs-und Anästhesie durchgeführt werden, bis alle physiologischen Parameter des Tieres wurden im Rahmen der normalen physiologischen Bereich. </li><li> Unter der Annahme, dass das Blut liegt bei rund 7% des Körpergewichts, eine angemessene Höhe der Phosphoreszenz Sonde Oxyphor R3 in 1 ml Kochsalzlösung auf 4 x 10 -5 M Konzentration im Blut der Sonde zu erreichen, ist aufgelöst. Die Sonde Lösung wird über die Vena femoralis injiziert. </li><li> Eine 1 M Lösung von Kaliumchlorid ist vorbereitet und ~ 1 ul ist mit der Spritze durch das Bohrloch auf dem Stirnbein injiziert, um CSD zu induzieren. </li><li> Der Laser wird eingeschaltet und Bildgebung ist unmittelbar nach der Injektion der KCl-Lösung gestartet. Imaging der Phosphoreszenz wird während ca. 10 min durchgeführt. </li><li> Ein weiterer Blut-Gas-Messung durchgeführt, um zu bestätigen, dass tierische physiologische Parameter noch im normalen Bereich. </li><li> Phosphoreszenz Lebensdauern sind für alle Pixel durch Anpassung der einzelnen exponentiellen mit nichtlinearen quadratischen Fitting mit statistischer Gewichtung in Matlab erhalten. Phosphoreszenz Lebensdauern sind die pO2-Werte mit einer empirischen Stern Volmer-like-Beziehung (siehe unten) umgewandelt. </li></ol> 2. Hochauflösende Zwei-Photonen-Imaging-pO2 in kortikalen micro Gefäßsystem der Maus <ol><li> Mäuse sind narkotisiert mit isofluorene und Femoralarterie wird katheterisiert, um die Herzfrequenz, Blutdruck und Blutgase, sowie für die Verwaltung des Farbstoffes zu überwachen. Die Körpertemperatur ist bei 37 ± 0,1 ° C und Tiere sind spontan atmenden ein Gemisch aus Luft und Sauerstoff. </li><li> Ein Schädel-Fenster wird nach ursprünglich von David Kleinfeld und Winfried Denk entwickeltes vorbereitet. Ein guter sollte darauf geachtet werden, um Schäden des Gefäßsystems zu vermeiden, um ein Auslaufen des Farbstoffs in interstitiellen Raum zu verhindern. </li><li> Ein paar Blutproben zur Messung der Blutgase während eines ganzen Vorbereitung Verfahrens getroffen und Beatmung und Anästhesie werden angepasst, um die Blut-Gas haltenes innerhalb der normalen physiologischen Bereich. </li><li> Das Tier ist es, die bildgebenden Einrichtung verlegt. Eine modifizierte stereotaktischen Rahmen, dass das Tier hält, ist unter dem Ziel gestellt. Der kraniale Fenster in das Sichtfeld unter der Olympus 4X Ziel zentriert und parallel zur Bildebene positioniert. </li><li> Ein Bild von der Schädelbasis Fenster wird mit der Digitalkamera durch die Okulare genommen, und die 4X Ziel ist es, mit der Olympus 20fach Objektiv (NA = 0,95) ersetzt. </li><li> Blut-Gas-Messungen und Einstellungen der Lüftungs-und Anästhesie durchgeführt werden, bis alle physiologischen Parameter des Tieres innerhalb einer normalen physiologischen Bereich liegen. </li><li> Unter der Annahme, dass das Blut liegt bei rund 7% des Körpergewichts, eine angemessene Höhe der Phosphoreszenz Sonde PtP-C343 ist in 0,2 ml Kochsalzlösung, um ~ 15 nM Konzentration im Blut der Sonde zu erreichen aufgelöst. Die Sonde Lösung wird über die Femoralarterie injiziert. </li><li> Beginnen Sie das Experiment, indem Sie die gewünschte Zeitintervall für Farbstoff Anregungs-und Emissions-Sammlung an jedem Pixel. </li><li> Erwerben Sie eine Umfrage scannen, die eine langsame 2-dimensionalen Raster-Scan der Phosphoreszenz Intensitätsschwankung, dass das Gefäßsystem Struktur auf der aktuellen Tiefe anzeigt. Das Ziel ist senkrecht zur Schädelbasis Fenster verschoben (Z-Achse) und langsame 2D-Umfrage Scans Phosphoreszenzintensität werden mithilfe des minimal Laserleistung bei 840 nm, die Mikrogefäßen in der Bildebene zu finden. </li><li> An jedem bildgebenden Tiefe, auf die Umfrage-Scan der Phosphoreszenz in dieser Tiefe basieren, sind eine Reihe von Punkten im Gefäßsystem gewählt, und die Aufnahme der Phosphoreszenz zerfällt in jedem Punkt ist für eine vorgegebene Anzahl von durchschnittlich wiederholt. </li><li> Stellen Sie die gewünschte Menge an Mittelung, Messintervall und Experiment Dauer und die Messung gestartet. pO 2-Messungen werden an den ausgewählten Orten an der angegebenen Messintervall für die Dauer des Experiments erworben. </li><li> Während der Messungen die Software erneut leitet die Anregungslasers zu den ausgewählten Orten durch Veränderung der Position des Galvanometers Scanspiegel. Die Steuerung der Galvanometer-Scannern, elektro-optische Modulator, und alle anderen Geräte werden von den Kunden zugeschnittene Software in LabView durchgeführt. </li><li> Phosphoreszenz Lebensdauern sind für alle ausgewählten Punkte durch Anpassung der einzelnen exponentiellen mit nichtlinearen quadratischen Einbau in Matlab erhalten. Phosphoreszenz Lebensdauern sind die pO2-Werte mit einer empirischen Stern Volmer-like-Beziehung (siehe unten) umgewandelt. </li><li> Nach dem Sammeln der Daten in verschiedenen kortikalen Tiefen, injizieren Dextran-konjugierten Fluorescein in Gefäßen für die Abbildung der Mikrovaskulatur Struktur. </li><li> Besorgen Sie sich einen Stapel von strukturellen Bilder des Gefäßsystems, indem Sie die Zwei-Photonen-Imaging von FITC-Fluoreszenz mit einem grünen Kanal in der Vier-Kanal-Detektor. </li><li> Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von Massachusetts General Hospital Unterausschuss für Forschung Animal Care Set durchgeführt. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Panel (a) auf der linken Seite dieser Figur zeigt ein weites Sichtfeld Bild von Sauerstoff Druck vor der Ankunft eines CSD-Welle. Panel (b) auf der rechten Seite zeigt die zeitliche Entwicklung der durchschnittlichen Sauerstoffdruck während CSD Ausbreitung innerhalb der Region von Interesse auf Holz markiert (a). Abbildung 2 (AVI-Film): Dieser Film zeigt die zeitliche Entwicklung der Sauerstoff-Druck in der gesamten kranialen Fenster während der Ausbreitung der CSD-Welle. Maßstabsbalken zeigt Sauerstoffdruck in Millimeter Quecksilbersäule. <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. 3D-Projektion der abgebildeten Gefäße Stapel. Die Grautöne repräsentieren eine volumetrische Schiff Maske, erstellt auf der Grundlage der strukturellen Bildes. Gemessen pO 2-Werte sind farblich gekennzeichnet. Scale-Bar ist 200 Mikrometer. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group. 7

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	<li>Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y., Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+occlusion+to+surface+and+deep+vessels+in+neocortex+via+linear+and+nonlinear+optical+absorption,+Animal+Models+of+Acute+Neurological+Injuries.">Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries.</a> Contemporary Neuroscience Series. , (2007).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Phosphorescent+Probes+for+Oxygen+Imaging+in+Biological+Systems.">Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems.</a> Applied Materials &#38; Interfaces. , (2009).</li><li>Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+microscopy+by+two-photon-excited+phosphorescence.">Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence.</a> Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).</li><li>Sakad&#382;i&#263;, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+cerebral+partial+pressure+of+oxygen+and+blood+flow+during+functional+activation+and+cortical+spreading+depression.">Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression.</a> Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).</li><li>Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+monitoring+of+oxygen+tension+in+cortical+microvessels+with+confocal+microscopy.">Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy.</a> Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).</li><li>Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat Methods. 7, 755-759 (2010).</li></ol>

Wir haben gezeigt, zwei Anwendungen der pO2-Messung in kortikalen Mikrovaskulatur auf Sauerstoff-abhängigen Löschung der Phosphoreszenz basiert. Während die erste Methode auf CCD-Bildgebung bietet weites Sichtfeld Überwachung von pO2-, Mess-Partialdruck des Sauerstoffs in kortikalen Mikrovaskulatur auf 2-Photonen-Mikroskopie basieren bietet Kapillare Auflösung und ermöglicht die Abbildung in die Tiefe. Beide Methoden sorgen für hohe Geschwindigkeit und hohes Signal-Rausch-Messungen. Darüber hinaus ist die Phosph...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycopyrrolate</td>
<td>Reagent</td>
<td>American Regent Inc.</td>
<td>NDC 0517-4605-25</td>
<td>Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Lidocaine HCL</td>
<td>Reagent</td>
<td>Hospira Inc.</td>
<td>NDC 0409-4277-01</td>
<td>Used as the local anesthesia during surgeries.</td>
</tr>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>Reagent</td>
<td>Baxter Healthcare Corp.</td>
<td>NDC 10019-360-40</td>
<td>Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alpha Chloralose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0128</td>
<td>Used as a general anesthesia during experiments with rats.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescein isothio-cyanate&#x2013;dextran</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>FD2000S</td>
<td>Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cerebral blood oxygenation measurement based on oxygen-dependent quenching of phosphorescence

Die Überwachung der raum-zeitlichen Eigenschaften des zerebralen Blut-und Sauerstoffversorgung des Gewebes ist entscheidend für ein besseres Verständnis der neuro-metabolisch-vaskuläre Beziehung. Entwicklung neuer pO2 Messmodalitäten mit gleichzeitiger Überwachung von pO2 in größeren Sehfelder mit höherer räumlicher und / oder temporale Auflösung wird einen tieferen Einblick in die Funktionsweise des gesunden Gehirns zu aktivieren und haben auch erhebliche Auswirkungen auf die Diagnose und Behandlung von neurovaskulären Erkrankungen wie Schlaganfall, Alzheimer, und Kopfverletzungen. Optische Bildgebungsverfahren haben ein großes Potenzial, um hohe räumlich-zeitliche Auflösung und quantitative Abbildung der pO2 auf Hämoglobin-Absorption im sichtbaren und nahen infraroten Bereich des optischen Spektrums Basis bieten gezeigt. Allerdings stützt sich multispektrale Messung der zerebralen Sauerstoffsättigung auf Photonen Wanderung durch die stark streuenden Hirngewebe. Schätzung und Modellierung von Gewebe optischen Parameter, die dynamischen Veränderungen während des Experiments unterziehen können, ist in der Regel für eine genaue Schätzung der Blutoxygenierung erforderlich. Auf der anderen Seite, sollte eine Schätzung der Sauerstoff-Partialdruck (pO2) auf Sauerstoff-abhängigen Löschung der Phosphoreszenz beruht, nicht signifikant von den Veränderungen in den optischen Parametern des Gewebes beeinflusst werden und stellt ein absolutes Mass der pO2. Experimentelle Systeme, die Sauerstoff-sensitiven Farbstoffen nutzen haben in in-vivo-Studien des perfundierten Geweben sowie für die Überwachung des Sauerstoffgehaltes in Gewebekulturen, die zeigen, dass Phosphoreszenz Abschrecken ist ein potenter Technologie, mit der genauen Sauerstoff Bildgebung in der physiologischen pO2 Bereich demonstriert. Hier haben wir mit zwei verschiedenen bildgebenden Verfahren wie der Messung von pO2 in kortikalen Gefäßen auf Phosphoreszenz lifetime imaging Basis durchführen zu demonstrieren. In ersten Demonstration präsentieren wir großes Sehfeld Bildgebung von pO2 an der kortikalen Oberfläche einer Ratte. Dieses bildgebende Verfahren ist relativ einfach Versuchsaufbau auf einer CCD-Kamera und einer gepulsten grünen Laser basiert. Ein Beispiel für die Überwachung der kortikalen Spreading Depression auf Phosphoreszenz Lebensdauer Oxyphor R3 Farbstoff vorgestellt wurde. In der zweiten Demonstration präsentieren wir Ihnen eine hohe Auflösung Zwei-Photonen-Imaging-pO2 in kortikalen micro Gefäßsystem einer Maus. Der Versuchsaufbau enthält einen speziell angefertigten 2-Photonen-Mikroskop mit Femtosekunden-Laser, elektro-optischen Modulator, und Photon-Counting Photomultiplier. Wir präsentieren ein Beispiel für die Abbildung der pO2 Heterogenität in der kortikalen Mikrovaskulatur einschließlich Kapillaren, mit einem neuartigen PtP-C343 Farbstoff mit verbesserter 2-Photonen-Anregung Querschnitt. Klicken Sie hier, um den zugehörigen Artikel anzuzeigen <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=1731">Synthese und Kalibrierung von Phosphorescent Nanoprobes für Oxygen Imaging in biologischen Systemen.</a>

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Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Wir präsentieren ein experimentelles Verfahren zur Messung der Sauerstoff-Partialdruck (pO2) in zerebralen Gefäßen auf Sauerstoff-abhängigen Löschung der Phosphoreszenz basiert. Tierische Vorbereitung und bildgebenden Verfahren wurden sowohl für großes Sichtfeld CCD-basierten Imaging von pO2 in Ratten und 2-Photonen-Anregung Bildgebung des pO2 bei Mäusen beschrieben.

Cerebral Blutoxygenierung Messung auf Sauerstoff-abhängige Quenching der Phosphoreszenz Based

Monitoring of the spatiotemporal characteristics of cerebral blood and tissue oxygenation is crucial for better understanding of the 
...

cerebral-blood-oxygenation-measurement-based-on-oxygen-dependent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. Wir präsentieren ein experimentelles Verfahren zur Messung der Sauerstoff-Partialdruck (pO2) in zerebralen Gefäßen auf Sauerstoff-abhängigen Löschung der Phosphoreszenz basiert. Tierische Vorbereitung und bildgebenden Verfahren wurden sowohl für großes Sichtfeld CCD-basierten Imaging von pO2 in Ratten und 2-Photonen-Anregung Bildgebung des pO2 bei Mäusen beschrieben.

Serie: Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Einem Rattenmodell der milden Intrauterine Hypoperfusion mit Microcoil Stenose

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Isolierung der zerebralen Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it is thought that dysregulation of protein synthesis in the nervous system may be a core phenotype in some developmental disorders. Accurate measurement of rates of cerebral protein synthesis in animal models is important for understanding these disorders. The method that we have developed was designed to be applied to the study of awake, behaving animals. It is a quantitative autoradiographic method, so it can yield rates in all regions of the brain simultaneously. The method is based on the use of a tracer amino acid, L-[1-14C]-leucine, and a kinetic model of the behavior of L-leucine in the brain. We chose L-[1-14C]-leucine as the tracer because it does not lead to extraneous labeled metabolic products. It is either incorporated into protein or rapidly metabolized to yield 14CO2 which is diluted in a large pool of unlabeled CO2 in the brain. The method and the model also allow for the contribution of unlabeled leucine derived from tissue proteolysis to the tissue precursor pool for protein synthesis. The method has the spatial resolution to determine protein synthesis rates in cell and neuropil layers, as well as hypothalamic and cranial nerve nuclei. To obtain reliable and reproducible quantitative data, it is important to adhere to procedural details. Here we present the detailed procedures of the quantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine method for the determination of regional rates of protein synthesis in vivo.

Protein synthesis is&#160;a critical biological process for cells. In brain, it is required for adaptive changes. Measurement of rates of protein synthesis in the intact brain requires careful methodological considerations. Here we present the L-[1-14C]-leucine quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo.

Quantitative autoradiografische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Auswirkungen der Explosion-induzierte Neurotrauma auf Druck Nagetier mittlerer Hirnarterien

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Cheek Injection Model for Simultaneous Measurement of Pain and Itch-related Behaviors

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts are typically counted to evaluate itch induced by pruritogens. However, previous reports have shown that algesic substances also induce scratching behaviors in a mouse neck injection model, which is the most common test used for scratching behaviors. This finding makes it difficult to study itch in mice. &#160;In contrast, capsaicin, a common algogen, reduced scratching behaviors in some neck injection experiments. Therefore, the effect of pain on scratching behaviors remains unclear. It is thus necessary to develop a method to concurrently investigate itch and pain sensation using behavioral tests. Here, a cheek injection model is introduced which can be used to simultaneously measure pain- and itch-related behaviors. In this model, pruritogens induce scratching behaviors while algesic substances induce wiping behaviors. Using this model, lysophosphatidic acid (LPA), an itch mediator found in cholestatic patients with itch, is shown to exclusively induce itch but not pain. However, in mouse models, LPA has been reported to be both a pruritogen and an algogen. Investigation into the effects of LPA in a mouse cheek injection model showed that LPA only induced scratching, but not wiping behaviors. This indicates that LPA acts as a pruritogen similarly in mice and humans, and demonstrates the utility of a cheek injection model for itch research.

Typically, the mouse neck injection model is used for evaluate pruritogen-induced scratch behaviors. However, the model provides information only on itch, not pain. Here, a cheek injection model is introduced in mice which can be used to simultaneously measure pain and itch-related behaviors.

Wangeninjektionsmodell zur gleichzeitigen Messung von Schmerz- und Itch-bezogenen Verhaltensweisen

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Generation von 3-D-Kollagen-basierten Hydrogelen zur Analyse des axonalen Wachstums und Verhaltens während der Entwicklung des Nervensystems

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Kartierung des zerebralen Blutflusses und der elektrischen Felder: Elektrodenplatzierung bei Mäusen

Placement of Extracranial Stimulating Electrodes and Measurement of Cerebral Blood Flow and Intracranial Electrical Fields in Anesthetized Mice

The detection of cerebral blood flow (CBF) responses to various forms of neuronal activation is critical for understanding dynamic brain function and variations in the substrate supply to the brain. This paper describes a protocol for measuring CBF responses to transcranial alternating current stimulation (tACS). Dose-response curves are estimated both from the CBF change occurring with tACS (mA) and from the intracranial electric field (mV/mm). We estimate the intracranial electrical field based on the different amplitudes measured by glass microelectrodes within each side of the brain. In this paper, we describe the experimental setup, which involves using either bilateral laser Doppler (LD) probes or laser speckle imaging (LSI) to measure the CBF; as a result, this setup requires anesthesia for the electrode placement and stability. We present a correlation between the CBF response and the current as a function of age, showing a significantly larger response at higher currents (1.5 mA and 2.0 mA) in young control animals (12-14 weeks) compared to older animals (28-32 weeks) (p &lt; 0.005 difference). We also demonstrate a significant CBF response at electrical field strengths &lt;5 mV/mm, which is an important consideration for eventual human studies. These CBF responses are also strongly influenced by the use of anesthesia compared to awake animals, the respiration control (i.e., intubated vs. spontaneous breathing), systemic factors (i.e., CO2), and local conduction within the blood vessels, which is mediated by pericytes and endothelial cells. Likewise, more detailed imaging/recording techniques may limit the field size from the entire brain to only a small region. We describe the use of extracranial electrodes for applying tACS stimulation, including both homemade and commercial electrode designs for rodents, the concurrent measurement of the CBF and intracranial electrical field using bilateral glass DC recording electrodes, and the imaging approaches. We are currently applying these techniques to implement a closed-loop format for augmenting the CBF in animal models of Alzheimer's disease and stroke.

Autor im Rampenlicht: Stimulationsbasierter Ansatz zur Verbesserung des zerebralen Blutflusses im Alzheimer-Modell 

We describe a protocol for assessing dose-response curves for extracranial stimulation in terms of brain electrical field measurements and a relevant biomarker-cerebral blood flow. Since this protocol involves invasive electrode placement into the brain, general anesthesia is needed, with spontaneous breathing preferred rather than controlled respirations.

[Platzierung von extrakraniellen Stimulationselektroden und Messung des zerebralen Blutflusses und intrakranieller elektrischer Felder bei anästhesierten Mäusen

The detection of cerebral blood flow (CBF) responses to various forms of neuronal activation is critical for understanding dynamic brain function and ...