Die Autoren bedanken sich bei Dana Kamalidenova, Morgan Autexier und Roch Chopier, die das Video und Animationen aus, sowie Florian Beck für die Fotos und die Post-Produktion des Videos Voice-over danken. Diese Arbeit wurde von Olympus gesponsert und unterstützt durch Zuschüsse aus dem HFSPO (Career Development Award), ANR (Programme Jeunes chercheurs und Programm Blanc Neurowissenschaften), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), INSERM und La Pitié Salpêtrière Krankenhaus (Translationale Forschung Vertrag) NR, aus Französisch Bundesforschungsministerium und die Deutsche Forschungsgemeinschaft Postdoc Stipendien an hoch, und aus den Doctoral School &quot;Frontiers in Life Science&quot;, Paris Diderot Universität, Bettencourt Schuller Fundament und FRM (Fondation pour la Recherche Médicale) Promotionsstipendium für JS

Ein. Herstellung künstlicher Liquor und intrazelluläre Lösung <ol><li> Vor dem Start des Experiments ist es nötig, die interne Lösung für die Patch-Clamp-Aufnahmen sowie die künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) für den Hippocampus präparieren. Sie werden darüber hinaus brauchen eine Dissektion Kit bestehend aus chirurgischen Schere und feine Iris Schere, zwei Spatel und Pinzette (Fine Science Tools), ein Glas Begasungseinrichtung (Mikro-Filterkerze ROBU Deutschland) und Gewebe Grid (Moskitonetz oder Nylon fest), sowie Sekundenkleber (Uhu Dent). Die Konfiguration der Patch-Setup Elektrophysiologie Scheibe wurde durch Finkel &amp; Bookman, 2001 1 beschrieben. </li><li> Für die interne Lösung, aufzulösen (in mM): 105 K-gluconat, 30 KCl, 10 HEPES und 0,3 EGTA in entionisiertem Wasser (in 70-80% des Endvolumens). Man kühlt die Lösung auf 4 ° C und addiert (in mM): 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Tris und 10 Phosphokreatin. Der pH-Wert auf 7,4 mit KOH und fill up mit deionisiertem Wasser auf das Endvolumen. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Filter für diese Lösung (Porengröße 0,2 &amp;mgr; m). Aliquotierte Lösung ist stabil für 3-4 Wochen bei - 20 ° C. Für ein experimentelles Tag, ~ 1 ml der internen Lösung benötigt. </li><li> Sofern nicht anders angegeben, enthält das für ACSF Hippocampus Herstellung und Aufnahmen von Zellen in der CA1-Region verwendet wird, (in mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1 NaH 2 PO 4, 26,2 NaHCO 3 und 11 Glucose. Lösen Sie diese Salze in destilliertem Wasser (Osmolarität ~ 320 mOsm) und Sauerstoff dieser Lösung für mindestens 10 min (pH ~ 7,3 - 7,4) mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO 2). Planen mindestens 1 Liter Lösung pro Versuch. Besondere Sorgfalt ist bei der Zubereitung von hippocampalen Gewebe, verwendet werden, um Experimente in der CA3 Region des Hippocampus durchführen wird, zu berücksichtigen. Tatsächlich ist diese Region anfällig für Aktivität und anschließende Neuronentod epileptiforme. So SYNAPTic Aktivität sollte stark während slice Vorbereitung reduziert werden, und dies wird erreicht, indem die Hippocampus Dissektion in eiskaltem Saccharose-Lösung enthält (in mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 1 NaH 2 PO 4 , 25 NaHCO 3, 10 Glucose und 75 Sucrose. Bei dieser Lösung ist die Kombination von niedrigem Natriumgehalt, niedrige Kalzium und hohen Magnesium-Konzentrationen massiv reduzieren präsynaptischen Brenn-und Freisetzungs-Wahrscheinlichkeit sowie postsynaptischen NMDA-Rezeptor-Aktivität, und minimiert so spontane Aktivität und Zelltod. Einmal hergestellt, hippocampalen Schnitten für Aufnahmen von Zellen aus der CA3 Region verwendet werden mit modifiziertem ACSF perfundiert, enthaltend 4 mM CaCl 2 und 4 MgSO4, um polysynaptischen zu minimieren. </li></ol> 2. Akute Hippocampusschnitt Vorbereitung <ol><li> Cool down ~ 300 ml ACSF zum Aufschneiden Kammer, als auch für die Vorbereitung bei 4 ° C, während er ständig sauerstoffartig mitCarbogen. Vorbereiten eines kleinen Becherglas mit ACSF bei Raumtemperatur (RT) für Slice Speicherung, die auch mit Carbogen (Schema 1) wird mit Sauerstoff angereichert. </li><li> Anesthetize die Maus unter einer Haube mit einem kleinen Papiertuch mit 1 ml Isofluran, die in den Käfig gegeben wird eingeweicht. </li><li> Nachdem die Maus ist tief narkotisiert, schneiden Sie den Kopf ab und fügen Sie ihn direkt in eine kleine Schüssel mit eiskaltem oxygenierten ACSF. Entfernen Sie die Kopfhaut mit einer kleinen Schere und überweisen Sie den Kopf auf das Gewebe für die nachfolgenden Schritte. Start, um den Hippocampus zu sezieren, wie dargestellt und beschrieben in Abbildung 1. </li><li> Cut 300-400 um dicke Transversalschichten bei niedriger Drehzahl (3 um / sec) und Vibration Frequenz von 70 Hz in eiskaltem Sauerstoff ACSF, und übertragen Sie sie in eine Vorratskammer. Lassen Sie die Scheiben Rest bei RT für mindestens 1 Stunde vor der Aufnahme. Slices für CA3 Experimente werden 25 min bei 34 ° C gelagert und mindestens 30 min bei RT, um aus dem Aufschneidebereich Prozess wiederherzustellen. </li></ol&gt; 3. Dual Recording evozierter astrogliale Currents und neuronale Feldpotentiale Wir beschreiben hier, wie die Aufnahme astrogliale und neuronalen Reaktionen, dh Reaktionen von synapse Aktivierung durch Afferenz Stimulation mit einer extrazellulären Elektrode induziert synaptisch-evozierte. <ol><li> Ständig versorgen die Aufnahme Kammer mit sauerstoffreichem ACSF (1.5-2 ml / min, RT), mit 100 uM Picrotoxin (GABA A-Antagonist) auf exzitatorische Antworten zu isolieren. Übertragen einer Scheibe auf eine Poly-L-Lysin (1,5 bis 3 mg / ml) beschichteten Deckglas, genießen die Flüssigkeit ein gutes Stück Haftung zu erzielen und einen Tropfen ASCF auf der Scheibe. Legen Sie das Deckglas in die Aufnahme Kammer. Blockade der inhibitorischen Übertragung durch Picrotoxin können in epileptiforme Aktivität führen, dh spontan, synchrone Feuern von neuronalen Populationen, die die Messung evozierter Ereignisse verfälscht wird. So zum epileptiforme Aktivität zu vermeiden, stellen einflachen Einschnitt (nur die Oberfläche) zwischen den CA1 und CA3 Regionen zur Verhinderung der Ausbreitung über die Schaffer-Kollateralen (wie in 2a gezeigt). </li><li> Stratum radiatum Astrozyten können durch ihre geringe soma Größe (~ 10 &amp;mgr; m) und sternförmige Prozess der Montage identifiziert werden. Wählen Sie eine Zelle mindestens 20-30 um unterhalb der Scheibenoberfläche. Montieren Sie ein Glas Stimulationselektrode (Kippstabilität ~ 1 M) auf dem Silberdraht, die auf den Reiz Isolation Box verbunden und geerdet, um das Bad (einfach durch Umwickeln des zweiten Silberdraht um die Glaspipette). Platzieren Sie die Stimulationselektrode in die Schaffer Sicherheiten Region, wie in 2A in einem Abstand von 200-300 um weg von der gewählten Astrozyten gekennzeichnet. Montieren Sie die field recording Elektrode (~ 2-5 MOhm) auf einem chlorierten Silberdraht mit dem Headstage des Verstärkers. Beide Elektroden befinden sich vorher mit ACSF gefüllt. Wählen Sie in MultiClamp den Modus I = 0, die externe com deaktiviertBefehls-Eingang und die Elektrode ~ 50 um weg von der Astrozyten in das Stratum radiatum Bereich (2A). Notieren Sie die Antworten mit Gain 2 bis 10 und Filter mit einem 2 kHz Bessel-Filter. Elektrische Strominjektion in die Hirnschnittkultur auslöst Aktionspotentiale in den umliegenden Schaffer Sicherheiten Axonen und anschließende Transmitterausschüttung an den präsynaptischen Enden dieses Projekt an postsynaptische CA1 pyramidalen Neuronen. Die freigesetzten Transmitter löst eine positive Ladung fließen in die Zellen durch postsynaptische ionotropen Rezeptoren, die messbar ist extrazellulär als ein kleines negatives Potential. Dieses Feld exzitatorischen postsynaptischen Potentials (fEPSP) integriert die Aktivität einer Gruppe von gleichzeitig aktiven Neuronen, während hemmende Übertragung pharmakologisch blockiert ist. Gelten einige Testimpulse (0,1 ms Dauer), um eine fEPSP erinnern, einige Neupositionierung der Stimulationselektrode könnte helfen, die fEPSP erhöhen. Ein typisches CA1 Stratum Radiatum fEPSP ist in 2B dargestellt. Weitere Einzelheiten zur Positionierung und Antwort Wellenformen können in Yuan et al. 2003 2. Die fEPSP Amplitude in einem gesunden Hippocampusschnitt sollte in der Regel mehr als doppelt so groß wie die Amplitude der Faser volley. Für eine genaue Quantifizierung der fEPSP Amplitude oder Neigung sollte der evozierten reponse sein monosynaptischen als polysynaptischen Aktivität (detektierbaren als Multi-Spitzenempfindlichkeit) zeigt synaptischen Aktivität unabhängig von der elektrischen Stimulation, die ein Zeichen für Übererregbarkeit sein könnten. Für Experimente in der CA3 Region des Hippocampus durchgeführt werden Stimulation und Ableitung Pipetten positioniert, wie in 3C veranschaulicht. Zur eindeutigen Identifizierung Moosfaser Eingänge, die dringend erleichtert werden, gepaarte-Puls Stimulation (50 Zwischenpulsintervall msec) und 1 Hz Stimulation für einige Sekunden aufgebracht massiv verbessern die anfänglich niedriger Amplitude hervorgerufen fEPSP responses.At das Endeder Versuch DCGIV ein mGluR2 / 3 Rezeptor-Antagonist kann in weiter sicherzustellen, dass tatsächlich Moosfaser Eingänge stimuliert wurden gewaschen werden. Anwendung dieses Antagonisten sollten die fEPSP von ~ 90% aufgrund der hohen Expression von mGluR2 / 3 Rezeptoren hemmen präsynaptischen Freisetzung aus Moosfaser boutons reduzieren. </li><li> Füllen eines Patch-Pipette (~ 2-5 MOhm) mit gefilterter interne Lösung und montieren es auf einem chlorierten Silberdraht mit dem zweiten Headstage gelten Überdruck mit einer Spritze, die über eine Rohrleitung in einen Pipettenhalter verbunden ist. Ständig gilt ein 20 ms Testimpuls von 10 mV und bewegen Sie die Pipette in das Gewebe bis zur Zelloberfläche und erreichen eine Auslenkung der Membran sichtbar. Null der Pipette Offset, entfernen Sie den Überdruck, und klemmen Sie die Membran auf - 80 mV. Warten Sie, bis eine undurchlässige (mindestens 1 G) erreicht ist (es sollte nicht länger dauern als ein paar Sekunden). Sanfte Anwendung einiger negativer Druck könnte helfen, ag erreichenigaseal. Brechen Sie in die Zelle wird durch einen kurzen Anwendung von Unterdruck erreicht oder mit dem zap Funktion Muffe. Starten Sie die gleichzeitige Aufzeichnung der Schaffer Sicherheiten evozierte fEPSP und die astrogliale Antwort in Spannungsklemme (Vhold - 80 mV, Frequenzbereich 0,1 Hz, Bessel-Filter 2 kHz, Verstärkung 10). Die astrogliale aktuelle Antwort ist biphasisch: Zuerst wird eine schnelle transiente Auswärtsstrom zu sehen, was fEPSPs durch benachbarte Pyramidenzellen generiert. Dies wird durch einen langsam ansteigenden und abfallenden Einwärtsstrom (mehrere Sekunden andauernde (&gt; 10 sec) nach Beendigung des neuronalen Antworten) gefolgt. Dieser Strom ist vor allem Kalium Einstieg in Astrozyten, nach der Entlassung von umliegenden depolarisiert postsynaptischen Terminals. Ein gleichzeitig aktiviert schnelle transiente Glutamat-Transporter Strom (GLT), gefolgt von präsynaptischen Freisetzung von Glutamat ausgelöst wird durch die kaliumsparende aktuellen maskiert. Die Haltepotential der Astrozyten, sowie der Zugang Widerstand der Patch sollte sein monitored während des Experiments und sollte nicht um mehr als ca. 20%, zu ungenauen Überwachung astroglialen reponses aufgrund von Veränderungen in den Aufnahmebedingungen vermeiden. Nur Astrozyten mit einer anfänglichen Beteiligung Potenzial&gt; -70 mV sollte untersucht werden, um gesunde Zellen zu studieren. </li><li> Umschalten von Spannungs-Strom-Clamp um die evozierte astrozytären Membrandepolarisierung aufzuzeichnen. Isolieren der glialen Glutamat-Transporter (GLT) Strom durch Perfusion des ionotropen Glutamat-Rezeptor-Blocker Kynurensäure (5 mM), bis die fEPSP vollständig blockiert ist und die Amplitude GLT ein Plateau erreicht. Zur eindeutigen Identifizierung der GLT Strom, gelten die spezifischen Antagonisten DL-threo-β-Benzyloxyaspartatic Säure (DL-TBOA, 200 uM). Steigern der Stimulation igen 2-fach bis 5-fach bis neuronalen und astroglialen Reaktionen bei unterschiedlichen synaptischen Stärke aufzunehmen, und wenden zwei eng beabstandeten Stimuli (50 msec Intervall), um Antworten auf gepaarten Impulses Stimulation untersucht. Stabilität der Serie resistance und Membranpotential des Gliazelle sollte während der Aufzeichnung überwacht werden. </li><li> Zur Visualisierung der Umfang des Gap-Junction vermittelt astroglialen Netzwerken sollte Farbstoff-Kupplung Experimente in Stromklemme Modus durchgeführt werden, ohne Strominjektion auf passive Diffusion niedermolekularer Farbstoffe (&lt;1,5 kDa), wie Sulforhodamin-B zu ermöglichen, durch Gap Junction Kanälen. Farbstoffzubereitungen Übergreifen in das umgebende Gewebe zu minimieren, sollte Überdruck durch die Patch-Pipette aufgetragen werden nur bei der Eingabe des Gewebes und das Pflaster sollte so rasch wie möglich erreicht werden. </li></ol>

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	<li>Finkel, A., Bookman, R., Crawley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6+The+electrophysiology+setup.">Chapter 6 The electrophysiology setup.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Yuan, Y. A., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elelctrophysiological+studies+of+neurotoxicants+on+central+synaptic+transmission+in+acutely+isolated+brain+slices.">Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2003).</li><li>Bergles, D. E., Jahr, C. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dual-Aufnahme synaptisch-induzierte neuronale und gliale Reaktionen ist eine nützliche Methode, um Online-Änderungen in prä-und postsynaptischen Aktivitäten verbundenen Änderungen in astrogliale Eigenschaften zu studieren. Die synaptisch hervorgerufenen glialen Membrandepolarisierung ist ein direktes Maß für die extrazelluläre Kalium Anstieg 8, die zum Teil auf präsynaptische Aktionspotential Brennen, aber meist an postsynaptische Depolarisation 7. Deshalb Aufnahmen von Gliazellen Membranpotential Dynamik kann verwendet werden, um Änderungen in präsynaptische Erregbarkeit, postsynaptische Aktivität extrazelluläre Raumvolumen und Kalium Pufferkapazitäten 6, 8 untersucht werden. Die astrogliale Glutamat-Transporter Strom ist ein empfindliches Maß der präsynaptischen Freisetzung von Glutamat in der Lage, kurzfristige Änderungen in Release Wahrscheinlichkeit 3, 5, 9 überwachen. Es kann weiterhin verwendet werden, um die funktionalen synapse-Glia Interaktionen bei verschiedenen Synapsen oder in unterschiedlichen Entwicklungsstadien st charakterisierenim Alter von 10. Es sollte betont werden, dass GLTs stark temperaturempfindlich sind 11 und werden durch die elektrochemische Gradient von Na +, K + und H 12 antreibbar ist. So ist die Amplitude und Kinetik der GLT bisher stark von den gewählten experimentellen Bedingungen abhängen. Ferner ist der zeitliche Verlauf der Ist-astroglialen Glutamat Clearance aus dem aufgezeichneten GLT Strom abgeleitet bekanntermaßen teilweise verdeckt werden. Dies liegt an der Filterung der GLT Ströme durch Faktoren wie den Eigenschaften der elektrotonischen Astrozyten oder dem asynchronen Sender-Mitteilung, welche die Kinetik verzerren 13. Verfahren Extrahieren der zeitlichen Merkmale der Filtermechanismen entwickelt worden und kann zur Ableitung der tatsächlichen Glutamat Räumzeit Kurs in physiologischen oder pathologischen Situationen, wie recenly 6,13,14 durchgeführt. Zusätzlich wird die gleichzeitige Aufnahme des astrogliale Membrandepolarisation, in Stromzange bieten kann INSIGhts zu möglichen Veränderungen der extrazellulären Kalium-Transienten. Einzel Astrozyten Kontakt bis zu 100.000 Synapsen von ~ 100 verschiedene Neuronen und müssen daher integrieren und modulieren die Aktivität der lokale neuronale Netze. Bei der Verwendung der hier vorgestellte Technik, dh Aufzeichnung elektrophysiologischer whole-cell Antworten von Astrozyten, um Einblicke in basale synaptische Aktivität zu gewinnen, sollte man im Hinterkopf behalten, dass in Astrozyten, Patch-Clamp-Aufnahmen im soma Ebene Erfassen von Strömen meist Ursprung aus der Zelle soma ermöglichen oder proximalen Prozesse. Tatsächlich Ströme am Soma detektiert nur teilweise aus feinen distalen Prozessen stammen, wenn eine starke Aktivierung von Rezeptoren und Kanäle vorkommende in mehreren Prozessen feinen Ströme ausbreitet zum Zellsoma erzeugen kann. So basalen Rezeptor und Kanal-Aktivität in einzelnen kleinen astrogliale Prozesse abdeckt synaptischen Kompartimenten ist kaum nachweisbar. Dies ist zum Teil aufgrund der eingeschränkten Laichial und zeitliche Kontrolle der Membran Ströme und Spannungen durch whole-cell Patch-Clamp-Aufnahmen von Astrozyten in situ. Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass die Oberfläche der reichlich vorhandenen winzigen Astrozytenfortsätze bei weitem die Membranfläche der Soma und Hauptprozesse überschreitet. Zusätzlich enthalten diese perisynaptic astroglialen Mikrodomänen die funktionsrelevanten Rezeptoren und Kanäle, die wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Kommunikation und neuroglialen synaptischen Regulierung. Die Technik, die wir hier vorgestellten ist daher meist sinnvoll, die Astrozyten Integration synchroner Aktivität von neuronalen Ensembles studieren, auftretende insbesondere während Afferenz Stimulation. Es sollte nicht verwendet werden, um den Dialog zwischen den einzelnen Synapsen und benachbarten feinen astrozytären Vorgänge während basal spontane Aktivität zu untersuchen. Eine alternative Methode zur lokalen astrogliale Antworten durch basale synaptische Aktivität induziert studieren wäre Patch-Clamp-Aufnahmen von feinen Prozesse ausführen, wie dein in Dendriten 15. Obwohl Patchen diese feinen astrogliale Prozesse wahrscheinlich herausfordernd ist aufgrund ihrer geringen Größe, ist es wahrscheinlich eine Allee zu verfolgen, um mehr intime Dialog zwischen astrogliale Mikrodomänen und einzelner Synapsen zu entwirren. Allerdings können die Wahrscheinlichkeit kleiner elektrophysiologischen astrogliale Reaktionen aus einzelnen feinen astrogliale Prozesse unter Schwellenwerterkennung sein, da elektrische Störungen erreicht im Durchschnitt 5.3 pA in Patch-Clamp-Aufnahmen. Eine andere Methode zur astrogliale Antworten auf synaptische Aktivität zu studieren, ist Calcium Imaging, da die Aktivierung der Astrozyten Membran-Rezeptoren oder Transporter durch neuroaktive Stoffen intrazellulären Calcium-Transienten auslösen können. Allerdings kann Bulkbeladung von Astrozyten mit Kalzium-Indikatoren ebenfalls hauptsächlich reflektieren somatische Aktivität 16. Die Kombination von Elektrophysiologie und Kalzium-Imaging ermöglicht auch die Erkennung kleiner Calcium-Signale aus feinem astrogliale Prozessen, entweder spontan auftretende oder ausgelöst by minimal synaptischer Stimulierung 17, 18. Allerdings sollte man im Hinterkopf behalten, dass eine hohe Affinität Calcium-Indikatoren könnten wie Kalzium Puffer, hemmen wichtige Calcium Signalwege wirken, wohingegen niedriger Affinität Indikatoren unterhalb der Nachweisgrenze Ebene funktionieren könnte. Schließlich besteht ein elegantes und nicht-invasive Technik, um Calcium Ereignisse in feinen astrozytären Prozesse, die auch unter Umgehung des Auswaschens von intrazellulären Signalmolekülen während Ganzzell-Patch-Clamp, studieren Verwendung einer Membran gezielt Calcium-Sensor, der in Astrozyten ausgedrückt werden kann in situ, sowie in vivo-19. Allerdings können Calcium-Imaging nur Auskunft über ein Signalmolekül, das in vielen beteiligt ist, aber nicht alle zellulären Aktivitäten, während Ganzzell-Patch-Clamp liefert quantitative Informationen über alle verschiedenen Ionenströme auf Kanal und Rezeptoraktivierung ausgelöst. Deshalb gleichzeitige elektrophysiologische Aufnahmen von Neuronen und Astrozytensind eine einzigartige und leistungsfähige Methode zu entwirren Online die Dynamik der neuroglialen ionischen Signalisierung und seine Rolle Gehirn Informationsverarbeitung.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Picrotoxin </td><td> Sigma </td><td> P1675 </td><td> lösen sich in DMSO </td></tr><tr><td> Kynurensäure </td><td> Tocris </td><td> 0223 </td><td> lösen sich bei 34 ° C Rühren oder Ultraschallbehandlung </td></tr><tr><td> DL-TBOA </td><td> Tocris </td><td> 1223 </td><td> DCG IV Tocris 0975 </td></tr></tbody></table>

dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices

Astrozyten bilden zusammen mit Neuronen dreigliedrigen Synapsen, wo sie zu integrieren und zu modulieren neuronalen Aktivität. Tatsächlich spüren Astrozyten neuronale Eingänge durch Aktivierung ihrer Ionenkanäle und Neurotransmitter-Rezeptoren, und Prozess-Informationen in Teil durch Aktivitäts-abhängigen Freisetzung von gliotransmitters. Weiterhin Astrozyten die Haupt-Aufnahme-Systems bilden für Glutamat, Kalium räumlichen Pufferung wirken, sowie an GABA Clearance. Diese Zellen beobachten daher fortwährend synaptische Aktivität und sind dabei sensible Indikatoren für Veränderungen in synaptisch-released Glutamat, GABA und extrazellulären Kaliumspiegel. Darüber hinaus können Änderungen in astrogliale Aufnahme Aktivität oder Pufferkapazität schwerwiegende Auswirkungen auf neuronale Funktionen und vielleicht übersehen bei der Charakterisierung physiopathologische Situationen oder Knockout-Mäusen werden. Dual-Aufzeichnung von neuronalen und astrogliale Aktivitäten ist daher eine wichtige Methode zur Veränderungen in studierensynaptischen Stärke assoziiert Änderungen in astrogliale Aufnahme und Pufferung Kapazitäten Vorsicht geboten. Hier beschreiben wir, wie man Hippocampusschnitte, wie stratum radiatum Astrozyten zu identifizieren, und wie gleichzeitig neuronalen und astrogliale elektrophysiologischen Reaktionen aufzeichnen vorzubereiten. Darüber hinaus beschreiben wir, wie man pharmakologisch isolieren synaptisch-evozierte astrogliale Ströme.

Eine repräsentative gleichzeitige Aufzeichnung von synaptisch hervorgerufenen astroglialen und neuronale Reaktionen (fEPSPs) in der CA1-Region des Hippocampus wird in Abbildung 2 AB gezeigt. Die evozierte astroglialen zweiphasigen Strom, dh es besteht aus einer transienten Auswärtsstrom und einer langsam abklingenden Einwärtsstrom (&gt; 10 Sekunden) (2B). Die Auswärtsstrom spiegelt die evozierte fEPSP, und nach Hemmung der ionotropen Glutamat-Rezeptoren durch Kynurensäure (dunkelgrau Spur, 2B) 3 blockiert. Die Mehrheit der langsamen Einwärtsstrom reflektiert Kalium Eintritt in den Astrozyten folgenden postsynaptischen Depolarisation, da sie ebenfalls durch Kynurensäure, welche postsynaptische ionotropen Glutamat-Rezeptor-Aktivität hemmt (2B und 2C 1) 3-6, bekannt, den Haupt repräsentieren abgeschafft Quelle (80%) Kalium-Version 7. Die restlichen rapide eind verfallenden innen Strom wird durch die GLT-Antagonisten DL-TBOA (hellgrau Spur, 2B und 2C 2) gehemmt. Post-hoc-Subtraktion des verbleibenden langsamen Strom in TBOA (hellgrau Spur) aus dem Strom in Kynurensäure (dunkelgrau Trace) erlaubt die Isolierung des reinen astroglialen Glutamattransporter Strom (schwarze Kurve), wie in 2C 2 dargestellt. Die persistente langsam abfallenden in Kynurensäure aktuellen und TBOA (hellgrau Spur, 2B und 2C 2) durch TTX (Daten nicht gezeigt) blockiert werden, und spiegelt wahrscheinlich die Anhäufung von extrazellulären K +-Freigabe während präsynaptischen afferenten Feuerung 3. Moderates Stimulation der Schaffer-Kollateralen induziert eine relativ große synaptisch hervorgerufenen astroglialen aktuellen Vergleich zur geringen evozierte Depolarisation in der gleichen Zelle (2D) erfasst. Dies ist auf dieniedrige Membranwiderstände von Astrozyten. Aufzeichnung der synaptisch hervorgerufenen astroglialen Membranpotential Dynamik, wie in 2D dargestellt, ist ein direktes Maß für lokale extrazellulären Kaliumspiegel 8. Normalisierung der evozierten astrogliale Antworten auf die zugrunde liegenden neuronalen Aktivität ermöglicht den direkten Vergleich von verschiedenen Experimenten, wie jüngst 6 dargestellt. Astroglialen Ströme kann weiterhin sehr zuverlässig überwachen Veränderungen exzitatorischen Übertragung, als die Gesamtzahl synaptisch hervorgerufenen astroglialen Strom folgt linear die Erhöhung des fEPSP (2E). Astroglialen Ströme reflektieren auch kurzfristige synaptischen Plastizität, da sie zeigen, wie Neuronen, gepaarten-Puls Erleichterung (2F). Gepaarten Ganzzell-Aufzeichnung eines CA1-Pyramidenzellen und einem Astrozyten offenbaren sehr unterschiedliche elektrophysiologischen Verhalten in beiden Zelltypen, da die Anzeige Neuron Aktionspotentiale in Reaktion auf eine depolarisierende Puls,während die benachbarten Astrozyten schweigt (3A-B). Allerdings kann moderate Belebung des Schaffer-Kollateralen gleichzeitig evozieren eine schnelle exzitatorische posynaptic Potenzial in der CA1-Pyramidenzellen und eine schnelle Hin-und langsam nach innen Ströme in den benachbarten Astrozyten (3B 2). Dual Aufnahmen synaptisch hervorgerufenen neuronalen und astroglialen Reaktionen können auch in der CA3 Region des Hippocampus aufgezeichnet werden, wie in 3C gezeigt. Tatsächlich erinnert einzigen Stimulation der CA3 Moosfasern in basalen Bedingungen sehr kleinen neuronalen Antworten, wie lokale fEPSPs, verbunden mit kleinen schnellen Hin-und langsame Einwärtsströme in Astrozyten (Abbildung 3D 1) aufgezeichnet. Dagegen 1 Hz Stimulation CA3 Moosfasern für einige Sekunden stark potenziert die fEPSP, während sie erhöht die nur mäßig astroglialen Reaktion (3D 2). Abbildung 1. Hippocampus Trennung nach transversale Schnitte vorzubereiten. Um das Gehirn sezieren, schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie (a). Einen Schnitt an der koronalen Ebene der Riechkolben (b) und anschließend auf der Ebene des Cerebellums (c). Entfernen Sie vorsichtig den Schädel mit Hilfe einer Zange (d), trennen die beiden Hemisphären mit einer Klinge (e), und übertragen Sie sie auf einem kleinen Löffel in kaltem Sauerstoff ACSF (f). Nach ca. 5 min Äquilibrierung, legen eine Hemisphäre auf trockenen Gewebe mit der medialen Oberfläche bis (g). Mit Hilfe von zwei Löffeln entfernen Zwischenhirn (hj). Der Hippocampus ist jetzt sichtbar, wie durch die gestrichelten Linien (k) dargestellt. Präparieren des Hippocampus mit einem Löffel aus ausgehend von der Fimbrien, sichtbar als weiße Struktur (lm). Übertragen Sie die Hippocampus zurück in den kalten ACSF. Bereiten Sie eine kleine Agarose-Block, Position der beiden hippocampi mit dem alveus Seite nach oben und der ventralen Hippocampuns zugewandten Rand der Agar-Block und einweichen sorgfältig gesamte Flüssigkeit entfernt, um eine gute Befestigung an den Agar (n) zu ermöglichen. Kleber der Hippocampus der Agar-Block auf das ventrale Teil (o) angebracht ist. <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2.jpg" alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2highres.jpg"/> Abbildung 2. Gleichzeitige neuronalen und astrogliale Antworten in der CA1-Region des Hippocampus-synaptisch hervorgerufen. A) Schematische Darstellung des Hippocampusschnitt welche die Anordnung der stimulierenden Elektrode, um die Schaffer-Kollateralen (SC), der Patch-Pipette Elektrode, zu aktivieren, um astrozytären Ströme aufnehmen und die extrazelluläre Elektrode aufnehmen fEPSP, hervorgerufen durch SC Stimulation im hippocampalen CA1-Region. B) Repräsentative Spuren gleichzeitige Aufnahmen fEPSPs (oberes Feld) und astrozytären Ströme (unteres Bild) hervorgerufenen synaptisch von SC Stimulation in der presence pharmakologischer Wirkstoffe. Die Antworten werden zunächst in Gegenwart eines GABA A-Rezeptor-Blocker (Picrotoxin, 100 pM, schwarz Spuren) zu isolieren exzitatorischen Reaktionen aufgezeichnet. Anschließendes Aufbringen eines ionotropen Glutamat-Rezeptor-Blocker (Kynurensäure, 5 mM, dunkelgrau Spuren), hemmt die fEPSP und den größten Teil des lang anhaltenden astroglialen aktuellen und demaskiert eine kleine und schnelle transiente Komponente des astrozytären Stromantwort, das ist empfindlich auf eine Glutamat-Transporter-Blocker (TBOA, 200 uM, hellgrau Spuren). Maßstab, fEPSP 0,1 mV, astrozytären derzeit 15 pA, 10 msec. C 1). Probe Spur des astroglialen Kaliumstrom (1-2), die aus der evozierten Reaktion, in B (untere Tafel, schwarze Kurve) dargestellt ist, durch Subtrahieren der Gleichstromkomponente verbleibenden Kynurensäure (2) von den Summenstrom isoliert werden ( 1). Maßstab, 20 pA, 1 sec. C 2) Probe Spur des aktuellen Glutamattransporter (2-3), durch Subtraktion des erhaltenen TBOA insensitive langsame Komponente (3) aus dem Strom in Kynurensäure (2). Maßstab, 2,5 pA, 25 msec. D) Beispiel Spuren von einer nach innen gerichteten Strom in Spannung-Klammer (untere Tafel) und dem entsprechenden Membrandepolarisierung in den Strom-Klemme (oberes Feld) in einem Astrozyten durch SC Stimulation induziert aufgezeichnet. Maßstab, Strom-klemmen 1,5 mV, Voltage-Clamp-5 pA, 1 sec. E) Eingangs-Ausgangs-Kurven, die die Beziehung zwischen der präsynaptischen Faser Salven (Input) und das Gesamtgewicht astroglialen Strom (Leistung) gleichzeitig aufgenommen in Reaktion auf SC Stimulation (n = 6). Die astrogliale Strom steigt linear mit den erhöhten Faser Salven, wie die neuronale fEPSP. F) Sample Spuren der neuronale Antwort (fEPSP) und der astrozytären Strom werden für gepaarte-Puls-Stimulation bei einer 40 msec Zwischenpulsintervall gezeigt. Die synaptisch-evozierte astrogliale aktuellen Exponaten, wie Neuronen, paired-pulse Erleichterung. Maßstab, 0,1 mV, 5 pA, 20 msec. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3.jpg" alt="Abbildung 3" fo:content-width="3.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3highres.jpg"/> Abbildung 3. Dual Aufnahmen synaptisch-induzierte neuronale und astroglialen Reaktionen in den CA1 und CA3 Bereiche des Hippocampus. A) Rekonstruktion eines CA1 Pyramidenzellen mit Sulforhodamin-B (rot, 0,1%) und einem Astrozyten mit Fluorescein Dextran (grün, 0,1%) gefüllt, mit der whole-cell Patch-Clamp-Technik injiziert. Maßstab, 10 mm. B 1) Repräsentative Spuren der gleichzeitigen Ganzzellableitungen des Membranpotentials in Current-Clamp aus einer CA1 Pyramidenzellen und einem benachbarten Astrozyten aufgenommen. Neuronale Feuern Aktionspotentials (schwarze Kurve), hervorgerufen durch Injektion einer 20 pA depolarisierenden Stromimpulses, evoziert keine Reaktion in dem benachbarten Astrozyten (graue Kurve). Maßstab, 20 mV, 10 pA, 100 msec. B 2) Probe Spuren von zwei Ganzzellableitungen eines CA1 Pyramidenzellen in Strom-clamp und ein benachbarter Astrozyten im Voltage-Clamp nach SC Stimulation in Gegenwart Picrotoxin (100 pM). SC Stimulation evoziert eine exzitatorischen postsynaptischen Potentials (EPSP, schwarze Kurve), verbunden mit einem kleinen und langlebige astrozytären Strom (graue Kurve). Maßstabsbalken, 5 mV, 10 pA, 100 msec. C) Schematische Darstellung des Hippocampusschnitt Darstellung im Gyrus dentatus (DG) und CA3 Bereiche die Anordnung von der stimulierenden Elektrode, um die Moosfasern, die Patch-Pipette Elektrode (grau), um astrozytären Ströme aufnehmen und die extrazelluläre Elektrode zu aktivieren Rekord fEPSP von CA3 Moosfasern Stimulation hervorgerufen. D, E) Repräsentative Spuren von paarweisen Aufnahmen von CA3 fEPSPs (obere Felder, schwarz Spuren in D 1 und D 2) und astrozytären Ganzzell-Reaktionen (untere Felder, grau Spuren in D 1 und D 2), um einzelne Stimulation von CA3 moosigen Fasern bei 0,02 Hz (zoom im Einschub) (D 1) oder bei 1 Hz Stimulationsfrequenz (D 2). Maßstab für D <sub&gt; 1 und D 2, 0,2 mV, 15 pA, Zeit: D 1 1 sec; D 2 100 msec. Inset Maßstab, 0,1 mV, 100 ms.

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Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Die Herstellung von akuten Hirnschnitten aus isolierten hippocampi, sowie die gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen von Astrozyten und Neuronen in<em&gt; Stratum radiatum</em&gt; Während der Stimulation der Schaffer-Kollateralen beschrieben. Die pharmakologische Isolation astrogliale Kalium und Glutamat-Transporter Ströme demonstriert.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

dual-electrophysiological-recordings-synaptically-evoked-astroglial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.1K Aufrufe.  Collège de France. Die Herstellung von akuten Hirnschnitten aus isolierten hippocampi, sowie die gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen von Astrozyten und Neuronen in Stratum radiatum Während der Stimulation der Schaffer-Kollateralen beschrieben. Die pharmakologische Isolation astrogliale Kalium und Glutamat-Transporter Ströme demonstriert.

Serie: Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH). These gonadotropins are essential for the regulation of reproductive function. The GnRH-containing neurons are distributed diffusely throughout the hypothalamus and project to the median eminence where they release GnRH from their axon terminals into the hypophysiotropic portal system (1). In the portal capillaries, GnRH travels to the anterior pituitary gland to stimulate release of gonadotropins into systemic circulation. GnRH release is not continuous but rather occurs in episodic pulses. It is well established that the intermittent manner of GnRH release is essential for reproduction (2, 3).
Coordination of activity of multiple GnRH neurons probably underlies GnRH pulses. Total peptide content in GnRH neurons is approximately 1.0 pg/cell (4), of which 30% likely comprises the releasable pool. Levels of GnRH during a pulse (5, 6), suggest multiple GnRH neurons are probably involved in neurosecretion. Likewise, single unit activity extracted from hypothalamic multi-unit recordings during LH release indicates changes in activity of multiple neurons (7). The electrodes with recorded activity during LH pulses are associated with either GnRH somata or fibers (8). Therefore, at least some of this activity arises from GnRH neurons.
The mechanisms that result in synchronized firing in hypothalamic GnRH neurons are unknown. Elucidating the mechanisms that coordinate firing in GnRH neurons is a complex problem. First, the GnRH neurons are relatively few in number. In rodents, there are 800-2500 GnRH neurons. It is not clear that all GnRH neurons are involved in episodic GnRH release. Moreover, GnRH neurons are diffusely distributed (1). This has complicated our understanding of coordination of firing and has made many technical approaches intractable. We have optimized loose cell-attached recordings in current-clamp mode for the direct detection of action potentials and developed a recording approach that allows for simultaneous recordings from pairs of GnRH neurons.

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Activity in neuronal systems often requires synchronous action potential discharges from neurons within a specific population. For example, pulses of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) likely require coordinated activity between GnRH neurons. We present our methodological approach for reliably obtaining simultaneous electrophysiological recordings from the diffusely distributed GnRH neurons.

Dual-Somatische Recordings von Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neuronen von Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamus Slices Identified

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Forschung

Neurowissenschaften

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

Untersuchung von Synaptic Tagging / Erfassung und Lang Capture mit akuten Schnitten des Hippocampus von Nagetiere

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

Akut<em&gt; In vivo</em&gt; Elektrophysiologische Aufzeichnungen von lokalen Feldpotentialen und Multi-Unit-Aktivitäten von der Hyperdirect-Pathway in anästhesierten Ratten

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetische Mitnahme von Hippocampal Theta Schwingungen im Verhalten der Mäuse

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

Vorbereitung von akuten menschlichen Hippocampusscheiben für elektrophysiologische Aufnahmen

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.