Wir möchten Drs danken. James Bowie und Salem Faham für die technische Expertise und Beratung über die Bicellen Methode und Dr. Aviv Paz für hilfreiche Diskussionen. Wir erkennen Le Du für experimentelle Unterstützung. Rachna Ujwal hat finanzielles Interesse an MemX Biosciences LLC, die jedoch nicht unterstützen diese Arbeit. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse der NIH (RO1 GM078844) unterstützt.

I) Vorbereitung einer Bicellen Lipid: Bicellen Basis Kristallisation von vier grundlegenden Schritten (Abbildung 2) besteht; ii) der Einbau von gereinigtem Protein in die Bicellen Medium; iii) Kristallisation Studien (manuell oder maschinell); amphiphile Mischung und iv) Visualisierung, Kristall-Extraktion und Einfrieren. Diese Schritte werden im Folgenden detailliert beschrieben 1. Vorbereitung der Bicellen Amphiphile Kombinationen und über einen weiten Konzentrationsbereich: Bicellen können in einer Vielzahl von Lipid zu bilden. Daher ist Konditionen-eine anfängliche Zusammensetzung-Basis von früheren, erfolgreichen empfohlen (Tabelle 1). Die gelungene Mischung ist der DMPC: CHAPSO Bicellen Formulierung, die entweder gekauft werden kommerziell als vorgemischte ready-to-use Formulierung (siehe Tabelle der Reagenzien unten) oder vorbereitet in das Labor, wie beschrieben. CHAPSO Mischung bei einer 2,8:1 Molverhältnis: Bei dieser Übung werden wir 1 ml 35% DMPC vorzubereiten. <ol><li&gt; abwiegen 0,26 g DMPC (Mr 677,9 g / mol), 0,09 g CHAPSO (Mr 630,9 g / mol) und fügen deionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 1,0 ml. <ul type="disc"><li> Die Bicellen Prozentsatz zwischen 10% -40% mit variieren DMPC: CHAPSO Molverhältnis von 2.6-3.0:1 (Tabelle 1). </li><li> Hinweis: Je höher die Konzentration der Bicellen desto schwieriger ist es mit dem Lipid was zu einer höheren Viskosität der Lösung auflösen. Allerdings kann eine konzentrierte Bicellen Formulierung vorteilhaft sein, wenn die Protein-Konzentration niedrig ist. </li></ul></li><li> Lösen des Lipid, um eine homogene Lösung zu erhalten erfordert erhebliche Anstrengungen, so dass dieser Schritt die meiste Zeit in Anspruch in der Bicellen Methode. Radeln Sie durch die folgenden Schritte, bis die DMPC ist völlig gemischt: <ol><li> Wärmen Sie die Mischung auf ~ 40 ° C mit einem Wasserbad oder einem Inkubator und Wirbel für ~ 1 Minute. <ul type="disc"><li> Hinweis: Da mehrere Zyklen durchgeführt werden, die Erwärmung der Mischung in eine gelartige con ErgebnisKonsistenz macht es schwierig, Wirbel. </li></ul></li><li> Das Gemisch wird auf Eis und Wirbel für ein paar Minuten. Kühlung hilft verflüssigen die Lösung macht es einfacher, Wirbel. <ul type="disc"><li> Hinweis: Da mehrere Zyklen durchgeführt werden, kann die Mischung beim Abkühlen trübe. </li></ul></li><li> Wiederholen Sie die oben aufgeführten Schritte (1.2.1 und 1.2.2), bis die Lipid vollständig gelöst ist. <ul type="disc"><li> Hinweis: Dieser Vorgang kann mehrere Stunden dauern. CHAPSO Formulierung: Bicellen Bildung wird durch die Änderungen in Phasenverhalten des DMPC angegeben. Nach der Fertigstellung wird die Mischung ein klares Gel auf oder oberhalb der Raumtemperatur und einer viskosen Flüssigkeit auf Eis. </li></ul></li></ol></li><li> Die Bicellen Mischung ist nun einsatzbereit und kann bei -20 ° C für eine langfristige Lagerung (bis 5 Jahre) gehalten werden. Wegen der Gefahr der Hydrolyse der Phospholipid-Kopfgruppe, ist es nicht ratsam, Bicellen bei Raumtemperatur zu lagern für längere Zeit. </li></ol> 2. Der Einbau von Protein in Bicellen Die meisten MP Strukturen aus Bicellen erhalten wurden in DMPC kristallisiert: CHAPSO Bicellen Konzentration im Bereich von 2 bis 8% mit einer Proteinkonzentration von 8 bis 12 mg / ml (Tabelle 1). Wenn möglich, sollte Einstiegsbildern nutzen diese Richtlinien sowie die Konzentrationen können bei der Optimierung der Bühne zu sehen sein. Im Vergleich zu den LCP-Verfahren wird das Protein Aufnahme mit Bicellen ein einfacher Prozess (Abbildung 3), die am selben Tag sollte die Kristallisation Studien sein. <ol><li> Auftauen DMPC: CHAPSO Bicellen Mischung bei Raumtemperatur, bis die Phase Änderungen ein klares Gel. <ul type="disc"><li> Hinweis: Mehrere Frost-Tauwetter wirkt sich nicht auf Bicellen Verhalten. </li></ul></li><li> Legen Sie die Mischung auf Eis zu verflüssigen und kurz vortexen, um eine homogene Bicellen Phase wieder herzustellen. Wenn auf Eis gelegt, kann die Mischung trübe. </li><li> From diesem Punkt an, halten Sie die Bicellen Mischung und gereinigtes Protein auf Eis. Dies wird die Bicellen in einer flüssigen Phase macht es zugänglich Pipettieren zu halten. </li><li> Fügen Sie die Bicellen Mischung auf das gereinigte Detergenz-solubilisierten Proteins in einem 1:4 (V / V)-Verhältnis. <ul type="disc"><li> Zum Beispiel: 100 ul Protein-Bicellen Mischung wird durch Mischen von 80 ul Protein mit 20 ul Bicellen erhalten. Wenn die Protein-Konzentration beträgt 15 mg / ml und die Konzentration Bicellen beträgt 35%, wird dies ein Bicellen-integriert Proteinmischung mit einer Proteinkonzentration von 12 mg / ml und eine Bicellen Konzentration von 7% zu geben. </li></ul></li><li> Durch vorsichtiges Pipettieren den Inhalt auf und ab, bis die Lösung klar und homogen. <ul type="disc"><li> Hinweis: Wenn Blasen erscheinen, eine schnelle Runde (30-60 Sekunden, 13000 rpm, 4 ° C) mit einer Tischzentrifuge können sie entfernen. </li></ul></li><li> Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für mindestens 30 min, um vollständige Einbindung von Protein int förderno Bicellen. Die Protein-Bicellen Mischung ist nun bereit für die Kristallisation Studien. </li></ol> 3. Einrichten Kristallisation Studien Weitere Lipid-Kristallisation Techniken wie die LCP erfordern eine spezielle Ausrüstung durch das Medium der hohen Viskosität, aber die einzigartige Phasenverhalten Bicellen ermöglicht die Umsetzung in praktisch jeder Standard-Kristallisation Format, einschließlich Robotik (Abbildung 3). Kristallisation Studien können entweder in hängenden oder sitzenden Tropfen Formate mit handelsüblichen Bildschirmen durchgeführt werden. <ol><li> Ob die Einrichtung Trays manuell oder mit Hilfe eines Roboters Kristallisation, zur Erhaltung des Protein-Bicellen Mischung auf Eis. Dies hält die Protein-Bicellen Mischung kalt und sicherzustellen, dass die Viskosität der Lösung ist minimal. </li><li> Manuelle Kristallisation Trials - Mit einem Standard-Pipette, kann das Protein-Bicellen Mischung mit Reservoir-Lösung in der gleichen Weise vermischt werden als normal funktionierened für lösliche oder Reinigungsmittel-solubilisierten Membranproteinen. <ul type="disc"><li> Hinweis: Bewahren Sie die Protein-Bicellen Mischung auf Eis während der Studien. </li></ul></li><li> Robotic Kristallisation Trials - Wir haben diese Studien für die Mosquito Kristallisation Roboter zugeschnitten sind, aber im Prinzip (nach dem gleichen Vorsichtsmaßnahmen) die Technik soll kompatibel mit allen Kristallisation Roboter. Die folgenden Tipps sollen sicherstellen, dass die Protein-Mischung Bicellen kühl bleibt und genau durch den Roboter pipettiert: <ol><li> Vorkühlung der Platte hält die Protein-Mischung Bicellen indem man sie auf Eis. </li><li> Pipette das Protein-Bicellen Mischung in der Platte und weiter auf die Platte auf Eis halten. Diese Platte sollte der letzte Punkt, auf den Roboter vor Beginn der Ausführung zu gehen. </li><li> Set-up das Reservoir-Fach und Kristallisation Deckel auf der Plattform 3 und 5 jeweils der Mücke Roboter. </li><li> Die Platte enthält Protein-Bicellen Mischung auf Gleis 4der Mücke Roboter. Dadurch ist gewährleistet, das Protein-Bicellen Mischung ist der letzte, von dem Roboter aufgenommen und es wird sofort entlassen. </li><li> Um zu verhindern, Heizung und erhöhter Viskosität, nicht zu verwechseln das Reservoir mit dem Protein-Bicellen Mischung. </li><li> Bei der Durchführung von mehreren Bildschirmen, sofort wieder die Bicellen-Protein-Platte auf Eis für die Kühlung, sobald ein Durchlauf beendet ist. </li></ol></li><li> Tropfenvolumentensiometer und Verhältnis (Protein: Reservoir) kann als bei herkömmlichen Kristallisation Studien gewählt werden. Zum Beispiel können erste Kristall-Studien mit dem Mosquito Roboter eingerichtet werden mit 0,25 ul Protein: Bicellen Mischung plus 0,25 ul Reservoir. </li><li> Inkubieren Sie die Kristall-Studien in einer Kammer bei 20 ° C. Die Temperatur ist ein guter Screening und Optimierung Parameter, da das Phasenverhalten Bicellen ist temperaturabhängig. <ul type="disc"><li> Höhere Temperaturen verursachen die lamellare Phase 12 (Abbildung 1), die den Vorteil der Pre-Organisation hatdas Protein in Schichten. Temperaturen unter 20 ° C kann abgeschirmt werden, aber man sollte nicht unter 4 ° C, da dies die Lipide zu fällen führen über längere Zeiträume. </li></ul></li><li> In der gleichen Weise wie herkömmliche Kristallisation Studien sollten Bicellen Studien auf einer regulären Basis für Kristall-Optik und das Wachstum überwacht werden. Wir empfehlen die Schalen auf den 1. und 3. Tag nach dem Setup durch wöchentliche Kontrolle folgte überprüfen. </li><li> Kristall-Optimierung durchgeführt werden kann mit Methoden routinemäßig für Waschmittel Kristalle einschließlich Grid-Screening, Additiv-Screening, wechselnde Temperaturen etc. Zusätzlich Bicellen Prozentsatz und Protein verwendet: Bicellen Verhältnis variiert werden kann. Darüber hinaus können Bicellen mit spezifischen Lipiden, die notwendig für die Stabilität des Proteins oder Funktion kann dotiert sein. </li></ol> 4. Visualisierung, Kristall-Extraktion und Gefrieren Seit Kristall Studien mit dem Protein-Mischung Bicellen<html> eine Viskosität ähnlich Protein-Detergenz Tropfen-, Visualisierungs-und Kristall-Extraktion ist Routine und wird wie herkömmliche Set-ups durchgeführt. <ol><li> Visualisierung: Im Gegensatz zu LCP Medien, erfordert oft hochwertige Beleuchtung unter normalen und polarisiertem Licht für Kristall-Erkennung, Visualisierung wird nicht durch Bicellen behindert. Farbige sowie farblos Proteinkristall Tropfen können leicht analysiert werden mit Standard-Mikroskope und keine besondere Ausrüstung erforderlich ist. </li><li> Bicellen, wie andere Lipid-Medien neigen dazu, einen hohen Prozentsatz der Fehlalarme zu erzeugen. Ein UV-Mikroskop hilft enorm bei der Differenzierung von Protein aus Salzkristallen (Abbildung 4). </li><li> Extraktion und Gefrieren: Crystal Gewinnung und Einfrieren ist relativ einfach und erfordert keine Auflösung der umgebenden Bicellen Medien. Darüber hinaus bietet die Bicellen Phase selbst einige moderate Kryo-Schutz. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <html> nt &quot;&gt; Es dauert in der Regel 2-3 Tage nach Kristallen zu erscheinen und etwa eine Woche oder mehr für sie, um ihre maximale Größe wachsen. Dies war der Fall für Bakteriorhodopsin und Maus voltage-dependent Anion Channel 1 (mVDAC1) Kristalle 4,8 . Für andere Membranproteine ​​kann es mehrere Wochen dauern, für das Kristallwachstum, so ist es wichtig, weiterhin die Überwachung der Kristall-Studien weit über die ersten Wochen. Wie bei anderen fetthaltigen Medien neigen Bicellen zu Formen, die zu sein scheinen kristalline bilden können. Es wurde auch beobachtet, dass sie einen höheren Anteil an Salz und Spülmittel Kristalle führen. Ein UV-Mikroskop, das Tryptophan-Fluoreszenz detektiert kann erheblich dazu beitragen, zu eliminieren, wie nicht-proteinhaltigen Fehlalarme. Abbildung 4 zeigt Lipid Formen, Salz und Protein-Kristalle als im sichtbaren und UV-Licht betrachtet, um zu unterscheiden die verschiedenen Ergebnisse, die beobachtet werden können. 83fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Bicellen Schematische. Bicellen sind von einer Doppelschicht Lipid-Molekül wie DMPC (blau) und ein Amphiphil wie CHAPSO (grün), welche die hydrophoben Kanten der Doppelschicht schützt zusammen. Da die Temperatur erhöht wird, durchlaufen Disc-like Bicellen eine Phasenumwandlung in eine perforierte Lamellen-Blatt 12. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig2.jpg" /> Abbildung 2. Flowchart für die Bicellen Kristallisationsverfahren, in der die vier grundlegenden Schritten. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig3.jpg" /> Abbildung 3. Kristall Studien set-up schematisch. Gereinigtes Detergenz-solubilisierten Membranproteinen können direkt mit Bicellen auf Eis durch einfaches Pipettieren den Inhalt vermischt. Nach Inkubation der Protein / Bicellen Mischung auf Eis ~ 30 Minuten, Kristallisation Studienkann so eingerichtet werden mit einem beliebigen Standard-Format, einschließlich Robotik. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig4.jpg" /> Abbildung 4. Visualisierung von Kristall-Studien. Sichtbares Bild (oben) und UV-Bild (unten) von (A) nadelförmige Kristalle in einem Salz-only Zustand beobachtet. Keine Fluoreszenz kann von den Kristallen nachgewiesen werden, ein Hinweis auf falsch positive. (B) stabförmige Kristalle gebildet in einem MPD Zustand. Der Kristall fluoresziert schwach, aber erwies sich als nicht-proteinhaltigen mit Röntgenbeugung. (C) Crystal etwa vier Wochen nach dem Einrichten Studien beobachtet. Die starke Fluoreszenz unter UV-Licht bestätigt es ist ein Protein-Kristall. <table border="1"><tbody><tr><td> Nein. </td><td> Protein </td><td> Quelle </td><td> Bicellen Formulation </td><td> Protein Concentratiauf </td><td> Detergens 1 </td><td> Auflösung (A) </td><td> Referenz </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Bacteriorhodopsin 2 </td><td> Halobacterium salinarum </td><td> 8% DMPC: CHAPSO (2,8:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 2,0 </td><td> Faham und Bowie, 2002 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 8% DTPC: CHAPSO (3:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 1,8 </td><td> Faham et al., 2005 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> β2-adrenergen Rezeptor / Fab-Komplex </td><td> Homo sapiens </td><td> 8,3% DMPC: CHAPSO (3:1) </td><td> 10 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 3.4/3.7 </td><td> Rasmussen et al., 2007 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Voltage-dependent Anion Kanal 1 </td><td> Mus musculus </em&gt; </td><td> 7% DMPC: CHAPSO (2,8:1) </td><td> 12 mg / ml </td><td> LDAO </td><td> 2,3 </td><td> Ujwal et al., 2008 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Xanthorhodopsin </td><td> Salinibacter ruber </td><td> 4,2% DMPC, 5% NM </td><td> 4 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 1,9 </td><td> Luecke et al., 2009 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Rhomboid Protease </td><td> Escherichia coli </td><td> 2% DMPC: CHAPSO (2,6:1) </td><td> 9 mg / ml </td><td> Nonyl Glucosid </td><td> 1,7 </td><td> Vinothkumar, 2011 </td></tr></tbody></table> 1-Waschmittelformulierungen für Membran-Protein-Aufreinigung verwendet 2 native Lipide aus Purpurmembranen kann entlang während der Reinigung durchgeführt werden Tabelle 1. Zusammenfassung der Kristallisationsbedingungen für Membran-Protein-Strukturen gelöst mit Bicellen.

<ol>
	<li>Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phases:+A+novel+concept+for+the+crystallization+of+membrane+proteins.">Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).</li><li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+Monoacylglycerols:+The+Workhorse+Lipids+for+Crystallizing+Membrane+Proteins+in+Mesophases.">Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases.</a> Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).</li><li>Nollert, P., Landau, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+release+of+crystals+from+lipidic+cubic+phases.">Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases.</a> Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).</li><li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5+Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles.">Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).</li><li>Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+bacteriorhodopsin+from+bicelle+formulations+at+room+temperature.">Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature.</a> Protein Science. 14, 836-840 (2005).</li><li>Luecke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+structure+of+xanthorhodopsin,+the+light-driven+proton+pump+with+a+dual+chromophore.">Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).</li><li>Ujwal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+&#197;+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating.">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 &#197; resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).</li><li>Vinothkumar, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+rhomboid+protease+in+a+lipid+environment.">Structure of rhomboid protease in a lipid environment.</a> J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).</li><li>Rasmussen, S. G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+human+[bgr]2+adrenergic+G-protein-coupled+receptor.">Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 450, 383-387 (2007).</li><li>Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+aligned+phospholipid+bilayers+with+positive+ordering:+a+new+model+membrane+system.">Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system.</a> Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Bicellen sind eine einzigartige Lipid-Medien, die eine native Doppelschicht-ähnliche Umgebung bieten und gleichzeitig verhalten, als ob durch Detergenzien solubilisiert. Diese Eigenschaft verleiht Bicellen einen entscheidenden Vorteil gegenüber anderen Lipid-basierte Kristallisationsverfahren, da es keine Lernkurve oder spezielle Geräte für diese Technik erforderlich. Sobald Bicellen verfügbar sind, weder zu kommerziellen oder vorbereitet in das Labor, können sie direkt gemischt mit gereinigtem Protein und von die...

high-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method

Membranproteine ​​(MPs) spielen eine entscheidende Rolle in vielen physiologischen Prozessen wie Pumpen spezifische Moleküle durch die ansonsten undurchlässige Membran-Doppelschicht, dass alle Zellen und Organellen umgibt. Änderungen in der Funktion des Abgeordneten führen in vielen menschlichen Krankheiten und Störungen, daher bleibt ein komplexes Verständnis ihrer Strukturen eine entscheidende Ziel für die biologische Forschung. Allerdings bleibt die Strukturbestimmung der Abgeordneten eine große Herausforderung oft aus ihrer Hydrophobizität. Abgeordnete haben erhebliche hydrophobe Regionen innerhalb der Doppelschicht eingebettet. Reinigungsmittel werden häufig verwendet, um diese Proteine ​​aus der Doppelschicht erzeugt ein Protein-Detergenz Mizellen, die dann in ähnlicher Weise als lösliche Proteine ​​manipuliert werden können aufzulösen. Traditionell gehen Kristallisation Studien mit einem Protein-Waschmittel-Gemisch, aber oft widerstehen Kristallisation oder erzeugen Kristalle von schlechter Qualität. Diese Probleme entstehen aufgrund derReinigungsmittel in der Lage ist, angemessen imitieren die Doppelschicht zu einer schlechten Stabilität und Heterogenität. Darüber hinaus das Waschmittel schirmt die hydrophobe Oberfläche des MP Reduzierung der Fläche für Kristall-Kontakte. Zur Umgehung dieser Nachteile Abgeordnete kann in Lipid-Medien, die eine bessere Simulation ihrer endogenen Umgebung kristallisiert werden, und hat vor kurzem zu einem de novo-Technik für MP Kristallisation. Lipidische kubische Phase (LCP) ist ein dreidimensionales Lipiddoppelschicht durch ein vernetztes System von wässrigen Kanäle 1 eingedrungen. Obwohl Monoolein ist das Lipid der Wahl haben Lipide wie monopalmitolein und monovaccenin auch genutzt, um LCP 2 zu machen. Abgeordnete werden in das LCP, wo sie in drei Dimensionen und Futtermitteln Kristallkeime diffuse eingearbeitet. Ein großer Vorteil des LCP ist, dass das Protein in einer nativen Umgebung bleibt, aber die Methode hat eine Reihe von technischen Nachteilen einschließlich High viscosity (erfordert spezialisierte Einrichtungen) und Schwierigkeiten bei der Kristall-Visualisierung und Manipulation 3,4. Aufgrund dieser technischen Schwierigkeiten, verwendeten wir eine andere Lipid-Medium für die Kristallisation-Bicellen 5,6 (Abbildung 1). Bicellen sind Lipid / amphiphile Mischungen hergestellt, indem ein Phosphatidylcholin Lipid (DMPC) mit einem Amphiphil (CHAPSO) oder eine kurzkettige Lipid (DHPC) gebildet. Innerhalb der einzelnen Bicellen Disc erzeugen die Lipid-Moleküle eine Doppelschicht, während die amphiphile Moleküle Linie der apolaren Ecken für eine vorteilhafte Eigenschaften der beiden Doppelschichten und Waschmittel. Wichtig ist, dass unter ihrer Sprungtemperatur haben Protein-Bicellen Mischungen eine reduzierte Viskosität und sind in einer ähnlichen Weise wie Waschmittel-solubilisierten Abgeordnete manipuliert, so dass Bicellen kompatibel mit Kristallisation Roboter. Bicellen wurden erfolgreich eingesetzt, um kristallisieren verschiedene Membranproteine ​​5,7-11 (Tabelle 1). Diese wachsende Sammlungvon Proteinen demonstriert die Vielseitigkeit des Bicellen zur Kristallisation sowohl alpha Helix und beta-Faltblatt Abgeordneten aus prokaryotischen und eukaryotischen Quellen. Aufgrund dieser Erfolge und der Einfachheit der High-Throughput-Umsetzung sollte Bicellen Bestandteil jedes Membranprotein Kristallographen Arsenal sein. In diesem Video beschreiben wir die Bicellen Methodik und bieten eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Aufbau High-Throughput-Kristallisation Studien von gereinigtem MPs mit Standard-Robotik.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method at JoVE.com

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Bicellen sind Lipid / amphiphile Mischungen, die Membranproteine ​​(MPs) halten in einer Lipid-Doppelschicht, sondern verfügen über einzigartige Phase Verhalten, das High-Throughput-Screening ermöglicht durch Kristallisation Roboter. Diese Technik hat erfolgreich eine Reihe von hochaufgelösten Strukturen von prokaryotischen und eukaryotischen Quellen erzeugt. Dieses Video beschreibt Protokolle zur Erzeugung der Lipid-Bicellen Mischung unter Einbeziehung Abgeordneten in die Bicellen Mischung, die Einrichtung von Kristallisationen Studien (sowohl manuell als auch maschinell) und Ernte-Kristalle aus dem Medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

high-throughput-crystallization-membrane-proteins-using-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

23.5K Aufrufe.  University of California Los Angeles. Bicellen sind Lipid / amphiphile Mischungen, die Membranproteine ​​(MPs) halten in einer Lipid-Doppelschicht, sondern verfügen über einzigartige Phase Verhalten, das High-Throughput-Screening ermöglicht durch Kristallisation Roboter. Diese Technik hat erfolgreich eine Reihe von hochaufgelösten Strukturen von prokaryotischen und eukaryotischen Quellen erzeugt. Dieses Video beschreibt Protokolle zur Erzeugung der Lipid-Bicellen Mischung unter Einbeziehung Abgeordnet...

Serie: High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Forschung

Biologie

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

RNA Secondary Structure Prediction Mit High-Throughput-SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Nachweis von miRNA Targets in Hochdurchsatz-Verwendung des 3&#39;LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...