Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Science Foundation (CBET 0846453) unterstützt.

1. Herstellung von Silizium-Master mithilfe von Standard-SU-8 Photolithographie 1 (nicht in diesem Video gezeigt). <ol><li> Verwenden Sie Standard-SU-8 Photolithographie Methoden, um eine SU-8 &quot;Master&quot; (SU-8 2025 MicroChem, Newton, MA) zur Herstellung der PDMS Form, dass die mikrofluidischen Netzwerk-und Chemotaxis Kammer enthält. Solche Master-Formen können jederzeit Mikrofabrikation Anlage (, z. B. Stanford Mikrofluidik Foundry hergestellt werden <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Vor PDMS-Replikation, setzen die SU-8 Master Fluorsilan Dampf in einem Exsikkator an einem Vakuum-Quelle auf einfache Veröffentlichung von PDMS aus dem Master zu erleichtern. Einen Tropfen Fluorsilan auf ein Papiertuch und gelten Vakuum für eine min. Entfernen Sie das Vakuum und damit 30 min für die Abscheidung von Fluorsilan. Halten Sie die SU-8-Master in einem geschlossenen Behälter für die zukünftige Verwendung. </li></ol> 2. Replica Formen von PDMS von SU-8-Master: Die fluidische Schicht und die Kontrolle Schicht durch Replikat des PDMS von SU-8 Master gemacht. <ol><li> Mix der PDMS-pre-Polymer und Vernetzer bei einem 10:1-wt. Verhältnis und Degas in einem Exsikkator für 1 Stunde (oder bis Luftblasen aus der PDMS-Mischung entfernt). </li><li> Legen Sie die SU-8 Master in einer Petrischale und vorsichtig gießen Sie die PDMS-Mischung auf der Oberseite des SU-8 Master auf die gewünschte Dicke. </li><li> Erhitzen Sie die Petrischale mit dem PDMS und der SU-8 Master-Form bei 80 ° C für zwei Stunden, um die PDMS zu heilen. </li><li> Entfernen Sie das gehärtete PDMS-bedeckten SU-8 Master von der Heizplatte und schälen die PDMS Form aus dem SU-8-Master. Die gewünschte Struktur wird in der PDMS-Form eingebettet sein. </li><li> Löcher in die PDMS Gussform für Schlauch mit dem Farbverlauf-Generator und Zell-Einlass mit einer 20-Gauge-blunt-end Nadel. </li></ol> 3. Kleben von PDMS-Geräte: <ol><li> Reinigen Sie einen Glasobjektträger mit Isopropanol und mit Stickstoff trocken oder einen Luftstrom. </li><li> Setzen Sie die PDMS-Glas-Folie, um Sauerstoff-Plasma in einem Plasma Asher. </li><li> Bringen Sie die PDMS Form in Kontakt mit dem Objektträger aus Glas. Heizen Sie den Kontakt mit Rutsche und PDMS Form bis 65 ° C für 15 min. </li></ol> 4. Montage der PDMS-Gerät <ol><li> Mit einer Rasierklinge geschnitten Rohres im 45 ° Winkel auf die richtige Länge für das Gerät erforderlich. </li><li> Stecken Sie ein Ende des Schlauches in die Löcher in das Gerät (zB Steckdose) mit einer Pinzette gestanzt. </li><li> Mit einer Pinzette, legen Sie eine stumpfe 30-Gauge-Nadel in das andere Ende des Schlauchs. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.2 für alle übrigen Löcher. </li><li> Sammeln Sie 1 ml der Chemotaxis-Puffer (CB) in einer 3 ml Spritze, kümmert sich um Luftblasen aus der Spritze zu entfernen. </li><li> Fix eine Nadel-Hub an einem Ende der Ablaufschlauch. </li><li> Add CB, um die Nadel-Hub, und tippen Sie auf die Nadel-Hub, um mögliche Luftblasen zu entfernen. </li><li> Schieben Sie ein wenig CB aus der Spitze der Spritze und schließen Sie das 3 ml Spritze mit der Nadel-Hub ohne Lufteinschluss. </li><li> Push-CB durch das Gerät, bis alle verbleibenden Nadel-Hubs mit mit CB gefüllt sind. Dies sollte die Mehrheit der Luftblasen. </li><li> Füllen zwei 500μL Spritzen mit CB mit den entsprechenden Konzentrationen der chemoeffector getestet. Vermeiden Sie Luftblasenbildung, indem ein kleiner Tropfen der Spritze Inhalte und berühren Sie mit dem Tropfen der Flüssigkeit in die Nadel-Hub und Befestigung. </li><li> Ebenso verbinden eine Spritze mit CB, um die Bakterien Einlass. Diese werden entfernt, wenn Bakterien in das Gerät eingeführt werden. </li></ol> 5. Das Wachstum von hoch bewegliche E. coli <ol><li> Wachsen Sie über Nacht Kulturen von E. coli RP437 mit einem GFP-Expressionsplasmid in 20 ml Trypton Bouillon (TB) bei 32 ° C unter Schütteln. Add geeigneten Konzentrationen von Antibiotika, um das Plasmid zu erhalten. In unserem Protokoll, verwenden wir ein low-copy Plasmid pCM182 zum Nachweis von Bakterien auf Fluoreszenz in dem Gerät auf. Für E. coli, wachsenden Kulturen bei 32 ° C ist für hohe Beweglichkeit zu empfehlen, da die Motilität ist niedriger bei höheren Temperaturen. </li><li> Verwenden Sie die Übernacht-Kultur zu einer 20 ml Kultur von TB in einem 250 ml Erlenmeyerkolben impfen zu einer optischen Dichte bei 600nm von ~ 0,05. Die Kultur unter Schütteln bei 32 ° C. </li><li> Ernten Sie die Zellen bei einer OD 600 von ~ 0,35 0,45 langsame Zentrifugation bei 400 xg für 5 min. </li><li> Die Zellen auf eine OD 600 von ~ 0,35 in CB mit der chemoeffector auf die Konzentration in der Mitte des Kanals zu erwarten. </li><li> Add RFP-markierten toten Zellen bei einer OD 600 von ca. 0,35 bis die GFP-exprimierenden lebende Zellen. Die Toten (rot) Zellen sind als interne Kontrolle, um sicherzustellen, dass eine Migration nicht aufgrund Flow-Effekte verwendet. </li></ol> 6. Überwachung Chemotaxis <ol><li> Entfernen Sie einige der CB aus der Zelle EinlassnadelHub. Refill mit der Zellsuspension. </li><li> Vorsichtig füllt die 50 ul Spritze mit der resuspendierten Zellen. Dieser Schritt muss langsam erfolgen, wie Geißeln können geschert werden und Beweglichkeit zu reduzieren. </li><li> Bringen Sie die 50 ul Spritze mit dem Einlass-Kanülenansatz wie in den Schritten Schritt 4.10 beschrieben. </li><li> Stellen Sie das Gerät auf der Bühne ein Fluoreszenzmikroskop mit einem High-Speed-Kamera für die Bildaufnahme ausgestattet. Legen Sie die Einlass-Spritzen (beide 500 mL Gradienten Spritzen und die 50 ul Zell-Spritze) in die Spritzenpumpe und initiieren fließen, so dass der Gradient gebildet wird und die Zellen werden durch den Schlauch fließt. </li><li> Sobald Zellen der Chemotaxis Kammer betreten, warten ca. 20 min, bis das System vor Bildgebung zu stabilisieren. </li><li> Sammeln grün (live) und rot (tot) Fluoreszenzbilder an verschiedenen Orten entlang der Länge der Kammer (entsprechend unterschiedlichen Belichtungszeiten). Normalerweise sammeln wir 100 Bilder an jedem Ort auf 3 Sekunden-Intervallen. </li></ol> 7. Datenanalyse: Die folgenden Schritte kann mit jedem handelsüblichen Bildanalyse-Programm (zB ImageJ, Metamorph) oder mit einfachen Codes in Matlab geschrieben werden. <ol><li> Entfernen Sie den Hintergrund Pixel im Bild (dh eingestellte Schwelle Pixelintensität und entfernen Sie alle Pixel, die Intensität haben weniger als die Schwelle). Dies minimiert die Geräuschentwicklung in der Analyse. </li><li> Verwenden Sie die Position des toten Zellen (rote Fluoreszenz), um die Mitte des Bildes zu bestimmen. Da die toten Zellen keine Chemotaxis zeigen, ist dies die Stelle, an Zellen in die Chemotaxis Kammer und würde in Ermangelung einer Migration erkannt werden. </li><li> Suchen lebenden Zellen (grüne Fluoreszenz) in das Bild. </li><li> Unterteilen Sie das Bild in die Kanäle und die Anzahl der lebenden Zellen in jedem Kanal. In unserer vorherigen Arbeit 3, wurde der 1050 um breit Chemotaxis Kammer in 64 Kanäle, die jeweils ~ 16 &amp;mgr; m breit sind geteilt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 7,1 7,3 für alle Bilder und die Summe der gesamten Zellzahl pro Kanal auf allen Bildern. Dies gibt der gesamten Zellzahl bei jeder Kanal über die Dauer des Experiments erkannt. </li><li> Berechnen Sie die Chemotaxis Verteilungskoeffizient (CPC), die die Richtung der Migration darstellt, wie folgt: Jede Zelle in der hohen Konzentration (rechts) und geringer Konzentration (links) Seiten des toten Zellen befindet, ist ein Multiplikator von +1 und -1 zugeordnet bzw.. Das heißt, eine Zelle, die bis wandert eine Steigung von +1 multipliziert wird, während Zellen bewegten sich die Steigung von -1 multipliziert werden. Alle multiplizierten Werte werden addiert und normiert auf die Gesamtzahl der gefundenen Zellen. Zum Beispiel zeigt eine CPC-Wert von 0,40, dass 40% mehr des gesamten Bakterien, die hohe Konzentration Seite geschoben, als die geringe Konzentration Seite (dh der chemoeffector ist ein Lockstoff als mehr Bakterien nachgewiesen wurden bewegt sich die Steigung). </li><li> Berechnen Sie die Chemotaxis Migration Koeffizient (CMC), die die Migration von Zellen durch die zurückgelegte Strecke, wie folgt wiegt: Gewicht der Zellzahl in jedem Kanal durch einen Faktor, der proportional zum Abstand, dass die Zellen wandern wird. Eine Zelle, die bis in die entferntesten mit hoher Konzentration Position (Kanal 64) bewegt, ist ein Gewichtungsfaktor von +1 gegeben, während eine, die auf halbem Weg bewegt sich in der höheren Konzentration Seite ein Gewichtungsfaktor von +0,5 gegeben wird, und eine Zelle bewegen, die am weitesten low-Konzentration Position ist mit -1 gewichtet. Fassen Sie alle gewichteten Zellzahlen und normalisieren, um die Anzahl der Zellen, die CMC zu generieren. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse 3,4: Wir haben das Mikrofluidikvorrichtung (Abbildung 1A) beschrieben hier, um Chemotaxis von E. untersuchen coli in Gradienten von Lockstoffen (Asparaginsäure, Autoinducer-2) und Repellentien (NiSO 4, Indol) 3,4. Die prototypische Chemotaxis Belastung 5 E. coli RP437, die GFP verwendet wurde, zusammen mit Kanamycin-getötet E. coli TG1-Zellen, die rot fluoreszierendes Protein zu fließen Auswirkungen überwacht. Der Konzentrationsgradient in der μFlow Vorrichtung ausgebildet ist in Abbildung 1B gezeigt. Die Zelle Einlass wurde verschlossen, so dass es keine durchströmt und einen stabilen Verlauf der 0 100 ng / mL fluoresscein im Gerät eingerichtet wurde. Die Pixel-Intensität in das Gerät eingesetzt wurde, um die Konzentration Profil von Fluorescein zu bestimmen. Die Daten zeigen, dass Bakterien einen linearen Verlauf begegnen, wenn sie die Chemotaxis Kammer betreten. 2A und B zeigt Fluoreszenzbilder von E. coli RP437 Migration in Reaktion auf Gradienten von Asparaginsäure (0 100 uM) und NiSO 4 (0 225 uM). Die beobachteten Reaktionen auf diese kanonischen Lockstoff und abweisend sind wie vorhergesagt. 3A zeigt die quantifizierte Verteilung von E. coli RP437 in Abwesenheit eines Konzentrationsgradienten (dh null Gefälle von Asparaginsäure), während3B und C zeigen die Verteilung in Steigungen von Asparaginsäure und NiSO 4. Die Spezifität dieser Reaktion (dh die Vorspannung in der Migration) ist offensichtlich, als E. coli RP437 Δ tar-Stammes (dh, Stamm fehlt die Tar Chemorezeptor, dass in E. coli verwendet wird, um Asparaginsäure und Nickel Sinne) nicht zeigen, die Vorspannung in der Migration in der Gegenwart eines Konzentrationsgradienten von Asparaginsäure oder NiSO 4. Die Trends evident in der räumlichen Verteilung Profile sind auch im Einklang mit den berechneten CPC und CMC-Werte. Die CPC-Werte für die Migration von E. coli RP437 in Steigungen von Asparaginsäure oder NiSO 4 sind +0,33 und -0,33 bzw.. Die entsprechenden CMC-Werte 0,13 und -0,14 bzw.. Im Gegensatz dazu schätzt die CPC und CMC mit dem E. coli RP437 Δ tar-Stamm in Steigungen von Asparaginsäure oder NiSO 4 sind vernachlässigbar. Darüber hinaus sind die CPC und CMC in ein Null-Gradienten von Asparaginsäure 0,03 und 0,02, bzw., und geben Sie die Unbefangenheit bei der Migration in der Abwesenheit eines Gradienten. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="Abbildung 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="Abbildung 1b" /> Abbildung 1. Geräte schematische und Konzentrationsgradienten. (A) Schematische Darstellung der mikrofluidischen Chemotaxis Gerät. Das Gerät besteht aus einem Gradienten-Mischmodul (20 x 100 x 18750 um) und eine Chemotaxis Beobachtung Modul (20 x 1050 x 11500 um). Die Breiten der beiden Gradienten-Kanäle in das Gerät sind 500 mu m und die Breite der Bakterien Einlass ist 50 pm. Der Einschub zeigt eine Steigung von Signalmolekül (grau) und Bakterien wandern in Reaktion darauf. Live-Bakterien sind als feste Ovale dargestellt, von den toten Bakterien als offene Ovale dargestellt. (B) A Konzentrationsgradienten zwischen 0 und 100 ng / mL Fluorescein wurde in das Gerät erzeugt und aufgenommen mit Fluoreszenzmikroskopie. Fluoreszenz-Bilder wurden nach 30 min erworben und quantifiziert durch Bildanalyse. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Chemotaxis von E. coli RP437 in der mikrofluidischen Gerät. E. coli RP437 wurde ein Gradient von exponierten (A) 0-100 uM L-Aspartat oder (B) 0 bis 225 uM NiSO 4 in das Gerät und die Migration von lebenden Bakterien (grün) in Richtung L-Aspartat-oder weg von Nickel abgebildet alle 2,5 sec für 30 min. Tote Bakterien (rot) diente als Kontrolle für die Flow-Effekte in das Gerät. Die Bilder wurden quantifiziert mit einem in-house entwickelte Analyse program3. Die angegebenen Daten sind repräsentativ für pseudo-farbigen Bilder von drei unabhängigen Experimenten. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="Abbildung 3a" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="Abbildung 3b" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="Abbildung 3c" /> Abbildung 3: Quantifizierung der Migration Profile zu einem kanonischen Lockstoff und abweisend. Räumliche Verteilung der RP437 in der mikrofluidischen Vorrichtung in Reaktion auf (A) einheitlich 100 uM L-Aspartat-(dh, keine Steigung), (B) eine 0 100 uM Gefälle von Aspartat, und (C) eine 0 225 uM Steigung NiSO 4 . Die Verteilung der toten Zellen als durchgezogene Linie dargestellt ist, ist die Verteilung der RP437-Zellen als gestrichelte Linie dargestellt, und die Verteilung der RP437 eda + Δ tar-Zellen ist als gestrichelte Linie dargestellt. Die gezeigten Daten sind für die drei unabhängigen Experimenten gemittelt.

<ol>
	<li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly(dimethylsiloxane)+using+solid-object+printing.">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li><li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration.">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li><li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable,+Competing+Gradients.">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li><li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis. , (2009).</li><li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp;amp, M. a. n. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis.">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li></ol>

Die Chemotaxis Verteilungskoeffizient (CPC) und die Chemotaxis Migration Koeffizient (CMC) kann berechnet als in Mao et al 5 beschrieben. Wenn eine Zelle auf die hohe Konzentration Seite erkannt wird, ist es ein Wert von +1 gegeben, während eine Zelle auf die geringe Konzentration Seite hat einen Wert von -1 gegeben ist. Die Werte werden addiert und dividiert durch die Gesamtzahl der Zellen auf die CPC zu generieren. Das Vorzeichen der CPC (positiv oder negativ) gibt die Richtung der Migration (hin...

a microfluidic device for quantifying bacterial chemotaxis in stable concentration gradients

Chemotaxis ermöglicht Bakterien zu den Quellen der Lockstoff Chemikalien-Ansatz oder die Quellen der abweisenden Chemikalien zu vermeiden. Bakterien ständig die Konzentration von bestimmten chemoeffectors durch den Vergleich der aktuellen zur Konzentration detektiert ein paar Sekunden früher. Dieser Vergleich bestimmt, die Netto-Richtung der Bewegung. Obwohl mehrere, konkurrierende Verläufe oft in der Natur existieren, sind konventionelle Ansätze zur Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis suboptimal für die Quantifizierung der Migration in Reaktion auf Konzentrationsgradienten von Lockstoffen und Repellents. Hier beschreiben wir die Entwicklung einer mikrofluidischen Chemotaxis-Modell für die Präsentation präzise und stabile Konzentrationsgradienten chemoeffectors Bakterien und quantitative Untersuchung ihrer Reaktion auf das angelegte Gefälle. Das Gerät ist vielseitig, dass Konzentrationsgradienten beliebiger absolute Konzentration und Gradientenstärke kann leicht durch diffusive Mischen erzeugt werden. Das Gerät wird demonstriert mit der Reaktion der<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 an Steigungen von Aminosäuren und Nickel-Ionen.

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A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis in stabilen Konzentrationsgradienten chemoeffectors.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Quantifizierung von bakteriellen Chemotaxis in Stable Konzentrationsgradienten

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Aufrufe.  Texas A&M University. Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis in stabilen Konzentrationsgradienten chemoeffectors.

Serie: A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Studium der bakteriellen Chemotaxis Mit Mikrofluidik - Interview

Forschung

Biologie

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Herstellung eines mikrofluidischen Vorrichtung für die Abschottung der Neuron Soma und Axonen

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung mit Groove Patterns für ein Studium Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Ein Gradient-Erzeugung Mikrofluidikvorrichtung für Zellbiologie

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Vorbereitung E18 Kortikale Rattenneuronen für Kompartimentierung in einer mikrofluidischen Vorrichtung

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lymphozyten Erfassen mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip für HIV

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Zell-Capture mit einer mikrofluidischen Vorrichtung

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

Ein Multi-Parametric Islet Perifusion System innerhalb eines mikrofluidischen Perifusion Geräte

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...