Unterstützung von den National Institutes of Health (GM092804 gewährt, DE019938) und Verbrennungen Shriners Hospital.

1. Mikrofluidikvorrichtung Fabrication <ol><li> Mit Standard-Photolithographietechniken, fabrizieren die Master-Form-Wafer in einer Klasse 1000 Reinraum. Muster der ersten 3-um-dünnen Epoxid-Basis negativen Photoresist-Schicht, um die Migrationskanäle nach den Anweisungen des Herstellers zu definieren. Muster der zweite 50 um dicke Schicht, um die Zell-Be-und Chemokin-Kammern zu definieren. </li><li> Verwenden Sie die strukturierten Wafer zu Polydimethylsiloxan (PDMS)-Geräte werfen. Kräftig mischen PDMS (20 g) mit Initiator (2 g) für 5 min mit Plastikgabel in großen Plastik Waagschale. </li><li> Vorsichtig gießen PDMS auf die Form. </li><li> Entgasen Sie die PDMS, indem Form gegossen mit PDMS im Vakuumtrockenschrank für 1 Stunde. </li><li> Backen und PDMS mikrofluidischen Systemen für mindestens 3 Stunden zu heilen in einem Ofen auf 65 ° C eingestellt </li><li> Stanzen Sie die zentralen WBLCs mit einem Puncher mit einem Spitzendurchmesser von 1,5 mm. </li><li> Punch-Out ganze Donut-förmigen Geräte mit einem puncsie mit einem Spitzendurchmesser von 5,0 mm. </li><li> Entfernen von Teilchen Donut Geräte mit Klebeband. </li><li> Spülen Sie ein 12-Well-Platte mit VE-Wasser und dann mit Stickstoff trocken. Zeigen Platte in 60 ° C-Ofen für 5 min. </li><li> Sauerstoff-Plasma-Behandlung der 12-Well-Platte zweimal; einmal allein für 35 sec und dann wieder mit den Donut-Geräte für weitere 35 Sekunden. </li><li> Geräte vorsichtig in die Vertiefungen der Platte mit einer Pinzette. </li><li> Bake-Platte mit gebundenen Geräte auf einer Heizplatte auf 80 ° C für 10 min eingestellt. </li></ol> 2. Mikrofluidik-Assay Vorbereitung <ol><li> Prime mikrofluidischen Vorrichtungen unmittelbar nach der Sauerstoffplasmabehandlung, wenn die Vorrichtung ist hydrophil und Kapillarwirkung die Grundierung der kleinen Kanäle in der Vorrichtung zu fördern. </li><li> Neues chemoattractant Lösung durch Mischen von 5 ul fMLP [Stammlösung 10 uM] mit 5 ul Fibronektin [Stammlösung 1 mg / ml] und 490 ul HBSS. </li><li> Langsam Pipette &amp; #160; chemoattraktive Lösung in WBLC, mit einer Spitze für Gel (Abbildung 1A). Pipette weitere 20 ul des chemoattraktiven um die Außenseite der Vorrichtung. </li><li> Zeigen Platte in einem Exsikkator für 15 min. Durch Anlegen eines Vakuums an die Vorrichtung wird die Lösung in die Seitenkanäle des Geräts und der verdrängten Luft durch die PDMS diffundiert tropft. </li><li> Entfernen Platte aus und bestätigen Exsikkator Benetzung der Gerätekanal unter dem Mikroskop. Beobachten Sie, wie Blase wird kleiner, chemoattraktive Lösung in die Kammer eintritt. Keine Blase sollte innerhalb des Gerätes nach der Vakuumbehandlung vorhanden sein. </li><li> Waschen Sie die WBLC und außerhalb des Gerätes gründlich, um überschüssige chemoattraktive Lösung zu entfernen. Dieser Schritt erzeugt einen Gradienten von chemoattraktiven von jedem der Brennchemotaktische Kammern (FCC) an die Vorrichtung entfernt. <ol><li> Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit PBS, fügen Sie eine 30 G stumpfen Nadelspitze zu Spritze. Vorsichtig die Nadel Spitze der Spritze inzum Zentrum des torusförmigen Lochs. Drücken Sie vorsichtig 100 ul PBS in das Loch, so dass ein Tropfen PBS bildet sich auf der Oberseite des Gerätes. </li><li> Neigungsplatte und Pipette 1 ml PBS, um Vorrichtung, so daß die Flüssigkeit am Boden der Mulde sammelt. Saugen Sie die Flüssigkeit und wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt 3x mit frischen Pufferlösung (Mediennutzung statt Puffer, wenn die getrennten Neutrophilen in Medien geladen werden) 9. </li></ol></li><li> Füllen Sie jeweils gut mit Medien, bis die Oberseiten der Geräte sind unter Flüssigkeit eingetaucht. Lassen Sie die Geräte für 15 Minuten sitzen, damit Gefälle zu stabilisieren. Experimentelle Ergebnisse und theoretischen Daten von Finite-Elemente-Simulationen zeigen, dass die Steigungen in diesen Geräten sind stabil bis zu 24 h für kleine Moleküle (z. B. fMLP) und bis zu mehreren Tagen bei höherem Molekulargewicht (z. B. IL-8). </li><li> Mit Gel-Beladungstipps, langsam pipettieren 2 ul Blut (oder isolierten Neutrophilen) in jedes Vollblut loading Kammer (WBLC) (Abbildung 1A). </li></ol> 3. Probenvorbereitung Human-Neutrophilen aus Kapillarblut <ol><li> Sammle Blut aus der Stich in den Finger von gesunden Freiwilligen, die auf keine Immunsuppressiva ist. Alle Patientenproben wurden mit schriftlicher Einwilligung durch Verfahren, die von der MGH und Shriners Institutional Review Boards genehmigt erhalten und. <ol><li> Für Stich in den Finger Blutentnahme, waschen die Hände mit Wasser und Seife und trocknen Sie die Haut. Bereiten anti-coagulant/stain Stammlösung durch Zugabe von 1 ml HBSS + 0,2% HSA und 10 ul Hoechst-Färbung (32,4 uM), um den Blutsammelröhrchen (1,65 USP/50 ul Blut) Heparin. Stechen Sie den Finger mit einem SurgiLance Sicherheitslanzetten (2,2-mm Tiefe, 22 G), abwischen ersten Tropfen Blut und sammeln Sie 50 ul Blut in Eppendorf-Röhrchen, die das Lager Antikoagulans und Hoechst Fluoreszenzfarbstoff-Lösung (10 ul) und sanft mischen. </li></ol></li&gt; <li> Inkubieren Sie die Blut-und Hoechst-Färbung für 10 min bis zum Kern Fluoreszenzfärbung zu ermöglichen. Führen Probe innerhalb 1 h nach der Blutentnahme. </li></ol> Human-Neutrophilen aus venösem Blut <ol start="3"><li> Draw 10 ml peripheres, venöses Blut in Röhrchen mit 33 USP Heparin. </li><li> Dann werden 50 ul Venenblut auf Medien und Hoechst-Färbung wie oben beschrieben. Inkubieren Sie die Blut-und Hoechst-Färbung für 10 min bis zum Kern Fluoreszenzfärbung zu ermöglichen. Führen Probe innerhalb 1 h nach der Blutentnahme. </li></ol> Neutrophile Trennung von Vollblut - Positive Control <ol start="5"><li> Um Neutrophilen zu trennen, sterile Techniken an Neutrophile aus dem 10 ml venöses Vollblutprobe mit Hetastarch isolieren (6% w / v) Dichtegradienten gefolgt von einer negativen Selektion Magnetic-Bead-Isolations-Kit nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Resuspendierte die endgültige Aliquot von Neutrophilen bei einer konzation von 4000 Zellen / ul in 1X HBSS + 0,2% Humanserumalbumin. Halten Zellen bei 37 ° C bis bereit, das Experiment laufen. </li></ol> 4. Mikroskopie und Bildanalyse für die Neutrophilen-Chemotaxis-Messungen <ol><li> Einrichtung Biokammer Temperatur auf 37 ° C, Luftfeuchtigkeit 80% und CO 2 bei 5%. </li><li> Start sofort Bildgebung mit Zeitraffer-Bildgebung an einem Mikroskop (10X oder höher Vergrößerung). </li></ol> 5. Statistische Analyse <ol><li> Manuell verfolgen mindestens 50 Neutrophilen in jeder Probe. </li><li> Zählen der Zellen in die FCC im Laufe der Zeit (Fig. 2). </li><li> Berechnen Neutrophilen Geschwindigkeiten im Kanal zwischen WBLC und FCC mit ImageJ (NIH) (Abbildung 2). </li><li> Quantifizierung Direktionalität von Neutrophilen durch Zählen der Anzahl von Zellen, die die Verzweigung passieren und Berechnen des Verhältnisses zwischen der Anzahl der Zellen, die zu dem FCC und Zellen, die Austritts th drehenE-Gerät. Zellen, die nicht gerichtet sind, folgen nicht dem chemotaktischen Gradienten und daher in gleicher Anzahl zu der FCC-und der Austrittskanal (2) zu migrieren. </li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+injury+reduces+neutrophil+directional+migration+speed+in+microfluidic+devices.">Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices.</a> PloS one. 5, (2010).</li><li>Lavrentieva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+markers+in+patients+with+severe+burn+injury.+What+is+the+best+indicator+of+sepsis.">Inflammatory markers in patients with severe burn injury. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+kit-on-a-lid:+a+versatile+platform+for+neutrophil+chemotaxis+assays.">Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays.</a> Blood. 120, (2012).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chambers+for+monitoring+leukocyte+trafficking+and+humanized+nano-proresolving+medicines+interactions.">Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).</li><li>Nauseef, W. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+neutrophil+speed+and+directionality+during+chemotaxis,+directly+from+a+droplet+of+whole+blood.">Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood.</a> Technology. , 1-9 (2013).</li><li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvin+D2+restores+neutrophil+directionality+and+improves+survival+after+burns.">Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).</li><li>Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. 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Es gibt keine Interessenkonflikte offen zu legen.

In dieser Arbeit entwickelten wir eine mikrofluidische Plattform Neutrophilen-Chemotaxis von einem Tropfen Blut (2 ul) zu messen. Der On-Chip-mechanische Filtration von Erythrozyten aus aktiv Migration Neutrophilen umgeht die Notwendigkeit umständlicher Zelltrennverfahren, wie Dichte-Gradienten 10, 11 positive Selektion, negative Selektion oder 12, die anfällig für Artefakte, die durch Neutrophile aktivierenden einzuführen. Die mechanische Filtration von Erythrozyten unterscheidet unsere Techno...

<html> Neutrophile Handel spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des Fortschritts und der Auflösung von vielen entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Atherosklerose 1, bakterielle Infektion oder Sepsis 2, 3 und Verletzungen zu verbrennen. Für ihren wichtigen Beitrag zur Gesundheit und Krankheit Bedingungen ist Neutrophilenzahl Teil der Standard-Blutanalyse oft in der klinischen und Forschungslabors berücksichtigt. Doch obwohl sie eine der am weitesten verbreiteten Tests, der Wert der Neutrophilen in der Diagnostik von Infektionen und Sepsis ist häufig in Frage 4 wurde. Zum Beispiel, eine Studie von Neutrophilen bei Verbrennungspatienten ergab, dass Neutrophilen und die Migration von Neutrophilen-Funktion nicht korrelieren; was bedeutet, dass allein der neutrophilen Granulozyten ist nicht eine genaue Anzeige des Immunstatus 3. Obwohl schwieriger zu messen, hat Neutrophilen funktionale Kompetenz als wertvoller in einem breiten Bereich von Bedingungen vorgeschlagen worden. t &quot;&gt; Wichtig ist, dass viele der Neutrophilen-Defekte sind flüchtig und werden durch permanente genetische Defekte, eine Unterscheidung, die weitgehend in der Klinik übersehen wurde bis vor kurzem ausgelöst. Im Rahmen der Brandverletzungen, könnte die Migration von Neutrophilen im Verlauf überwacht werden Behandlung eines Patienten als Indikator der Entzündungszustand oder Infektions 3. Die Migrationsassays gegenwärtig im Labor (Boyden-Kammer, Dunn Kammer Mikroassay) verwendet wird, kann nicht in einer klinischen Umgebung umgesetzt werden, da sie große Mengen an Blut und umständlich zeitraub Neutrophilen-Isolationstechniken (Tabelle 1). Diese Tests können auch nicht verwendet werden, um vorübergehende Veränderungen in Neutrophilen-Chemotaxis in kleinen Labortieren wie Mäusen zu überwachen, da die Lautstärke von Blut für neutrophile Isolierung erforderlich ermöglicht nur eine Probe und oft sogar erfordert die Bündelung von Blut von verschiedenen Tieren für einen einzelnen Assays. Zum Beispiel eine Studie mit mehrere Bedingungen und Behandlungen über mehrere Zeitpunkte erfordern möglicherweise Tausende von Mäusen mit aktuellen Chemotaxis-Assays. Dies schränkt die biologische Grundlagenforschung, die getan werden, um die komplexe Dynamik der Immunfunktion im Zusammenhang mit Verletzungen, Infektionen oder verstehen oft brennen in den Mausmodellen 5 untersucht werden. Um die Notwendigkeit für einen Neutrophilen-Funktionsassay, das eine schnelle, robust ist, während bei minimaler Blutvolumen zu lösen, haben wir eine Mikrofluidvorrichtung, die Neutrophilen-Chemotaxis von einer kleinen Tröpfchen von Blut misst direkt entwickelt. Es ist bekannt, daß viele Faktoren in Vollblut, Serum, einschließlich Plättchen 6 und 7 betreffen Neutrophilen-Funktion. Es ist daher vorteilhaft, dass das Vollblut mikrofluidischen Tests minimiert Probenverarbeitung, um die in vivo-Mikroumgebung der Neutrophilen zu halten, wenn die Messung Unterschiede in Chemotaxis mit einem in vitro-Assay-8. Dieser Ansatzreduziert die Zeit von der Blutentnahme bis die Migration von Neutrophilen-Assays von Stunden mit traditionellen Techniken, um nur Minuten (Tabelle 1). Das Vollblut mikrofluidischen Plattform eine stabile lineare chemoattractant Gradienten für die Dauer des Experiments, hat keine beweglichen Teile und keine externe Druckquelle (z. B. eine Spritzenpumpe) erforderlich. Das Schlüsselmerkmal bei der Gestaltung des Gesamtblut mikrofluidischen Vorrichtung ist der Einbau von roten Blutkörperchen (RBC), die mechanisch Filtration Kammfilter von RBCs in die Migration Kanal des Gerätes. Die Rechtskurven dieser Filterkamm verhindern, dass die Notwendigkeit für Größenausschluss-Filtration, die wahrscheinlich von RBC verstopft sein würde und deshalb blockieren die chemoattractant Gradienten vom Erreichen der Migration von Neutrophilen aktiv in der WB. Der Einbau des Vollbluts in einer Mikrofluidik-Vorrichtung 12 oder 24-Well-Platte erleichtert das Screening mehrerer Mediatoren der humanen oder murinen Neutrophilenchemotaxis sizeitig.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:179px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:191px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Device Fabrication</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">SU8&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Microchem</td>
			<td style="width:179px;">Y131273</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:191px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:179px;">Sylgard 184 1.1 lb. Kit</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Standard glass slides</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">125495</td>
			<td style="width:191px;">1 X 3 inches</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Glass-bottom plate</td>
			<td style="width:191px;">MatTek</td>
			<td style="width:179px;">P12G-1.5-14-F</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm</td>
			<td style="width:191px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:179px;">15081</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm</td>
			<td style="width:191px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:179px;">15072</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Microfluidic Assay Preparation and Analysis</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Gel-loading pipet tip</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">02-707-139</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Syringe</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientfic</td>
			<td style="width:179px;">309602</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Blunt tip needle, 30g &#189; in.</td>
			<td style="width:191px;">Brico Medical Supply</td>
			<td style="width:179px;">BN3005</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Vacutainer, Heparin</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Human serum albumin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">A5843-5G</td>
			<td style="width:191px;">0.2% final concentration in HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">F0895-1MG</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">fMLP</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">F3506-10MG</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;">SLN240</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Hoescht stain</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:179px;">H3570</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Positive Control&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">HetaSep</td>
			<td style="width:191px;">STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td style="width:179px;">7906</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit</td>
			<td style="width:191px;">STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td style="width:179px;">19257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Equipment</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Plasma Asher</td>
			<td style="width:191px;">March Instruments</td>
			<td style="width:179px;">P-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Lindberg/Blue M Oven</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:179px;">13-258-30C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Stainless Steel Precision Tweezers</td>
			<td style="width:191px;">Techni Tool</td>
			<td style="width:179px;">758TW458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">08-594-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Dataplate Digital Hot Plate</td>
			<td style="width:191px;">Alpha Multiservices</td>
			<td style="width:179px;">PMC 720&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Nikon TiE inverted microscope</td>
			<td style="width:191px;">Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective</td>
			<td style="width:191px;">Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">MRH20101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon</td>
			<td style="width:191px;">Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">500-L200NI2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:211px;">DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters - 25mm Emitters</td>
			<td style="width:191px;">Chroma - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">31013v2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600x1200 pixels</td>
			<td style="width:191px;">Qimaging - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td>RET-2000R-F-M-12-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed whole blood

Neutrophile Granulozyten spielen eine wesentliche Rolle beim Schutz gegen Infektionen und ihre Zahl im Blut sind häufig in der Klinik gemessen. Höhere Anzahl von neutrophilen Granulozyten im Blut sind in der Regel ein Indikator für die laufende Infektionen, während niedrige neutrophilen Granulozyten sind ein Warnzeichen für höhere Risiken für Infektionen. Um ihre Aufgaben zu erfüllen, haben Neutrophilen auch in der Lage, effektiv aus dem Blut, wo sie die meisten ihr Leben damit verbringen zu bewegen, in die Gewebe, in denen Infektionen auftreten. Folglich können Mängel in der Fähigkeit von Neutrophilen zu migrieren, die Risiken für Infektionen erhöhen, auch wenn Neutrophilen im entsprechenden Zahlen im Blut vorhanden sind. , Mess-Migration von Neutrophilen Fähigkeit in der Klinik ist jedoch eine anspruchsvolle Aufgabe, die zeitaufwendig ist, erfordert große Mengen an Blut, und Fachwissen. Um diese Einschränkungen zu adressieren, haben wir eine robuste mikrofluidischen Assays für die Migration von Neutrophilen, die einen einzigen Tropfen Blut benötigt unverarbeitete, Umständeentlüftet die Notwendigkeit Neutrophilen Trennung und ist leicht auf einem einfachen Mikroskop quantifiziert. In diesem Assay wandern Neutrophile direkt von den Blutstropfen durch kleine Kanäle in Richtung der Quelle des chemoattraktiven. Um die körnige Strömung der roten Blutkörperchen durch die gleichen Kanäle zu verhindern, setzten wir mechanische Filter mit Winkelstellt, dass selektiv den Vormarsch der roten Blutzellen zu blockieren. Wir validiert den Assay durch den Vergleich die Migration von Neutrophilen aus Bluttropfen aus dem Finger stechen und venösen Blut gesammelt. Wir verglichen auch diese Vollblut (WB) Quellen mit Migration von Neutrophilen aus Proben von gereinigten Neutrophilen und gefunden konstante Geschwindigkeit und Richtungs zwischen den drei Quellen. Das mikrofluidische Plattform wird die Untersuchung der menschlichen Migration von Neutrophilen in der Klinik und der Forschung Einstellung aktivieren, um unser Verständnis der Neutrophilen-Funktionen in Gesundheit und Krankheit.

Das Vollblut (WB), Neutrophilen-Chemotaxis-Assay wurde durch Messen der Akkumulation von Neutrophilen zu einer fMLP Gradienten (Movie S1) validiert. Die Ergebnisse bestätigen, dass Erythrozyten werden durch die Filtration Kamm gefangen, während Neutrophilen (blau) sind in der Lage, sich aktiv aus Vollblut (3A-und Film-S1) zu migrieren. Die stabile lineare chemoattractant Gradienten (grün) von dem Vollblut mikrofluidischen Vorrichtung gebildet wurde mit FITC-markiertem Dextran <strong...

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Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Dieses Protokoll Details einen Test entwickelt, um menschliche Neutrophilen-Chemotaxis von einem Tropfen Vollblut mit robusten Reproduzierbarkeit messen. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit der Trennung von Neutrophilen und nur wenige Minuten von Assay Vorbereitungszeit erfordert. Die Mikrofluidik-Chip ermöglicht die wiederholte Messung der Neutrophilen-Chemotaxis über die Zeit bei Säuglingen oder Kleinsäuger, wo Probenvolumen ist begrenzt.

Mikrofluidik-Plattform zur Messung der Neutrophilen-Chemotaxis von Rohboden Vollblut

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

microfluidic-platform-for-measuring-neutrophil-chemotaxis-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital.  Dieses Protokoll Details einen Test entwickelt, um menschliche Neutrophilen-Chemotaxis von einem Tropfen Vollblut mit robusten Reproduzierbarkeit messen. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit der Trennung von Neutrophilen und nur wenige Minuten von Assay Vorbereitungszeit erfordert. Die Mikrofluidik-Chip ermöglicht die wiederholte Messung der Neutrophilen-Chemotaxis über die Zeit bei Säuglingen oder Kleinsäuger, wo Probenvolumen ist begrenzt. 

Serie: Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Forschung

Biotechnik

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Die Multi-Organ Chip - Ein Mikrofluidik-Plattform für langfristige Multi-Gewebe Cokultur

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white blood cells and platelets that are suspended in blood plasma. Due to the abundance of the RBCs (40% to 45% of the blood volume), their behavior dictates the rheological behavior of blood especially in the microcirculation. At very low shear rates, RBCs are seen to assemble and form entities called aggregates, which causes the non-Newtonian behavior of blood. It is important to understand the conditions of the aggregates formation to comprehend the blood rheology in microcirculation. The protocol described here details the experimental procedure to determine quantitatively the RBC aggregates in microcirculation under constant shear rate, based on image processing. For this purpose, RBC-suspensions are tested and analyzed in 120 x 60 &#181;m poly-dimethyl-siloxane (PDMS) microchannels. The RBC-suspensions are entrained using a second fluid in order to obtain a linear velocity profile within the blood layer and thus achieve a wide range of constant shear rates. The shear rate is determined using a micro Particle Image Velocimetry (&#181;PIV) system, while RBC aggregates are visualized using a high speed camera. The videos captured of the RBC aggregates are analyzed using image processing techniques in order to determine the aggregate sizes based on the images intensities.

The protocol described details an experimental procedure to quantify Red Blood Cell (RBC) aggregates under a controlled and constant shear rate, based on image processing techniques. The goal of this protocol is to relate RBC aggregate sizes to the corresponding shear rate in a controlled microfluidic environment.

Controlled Environment Mikrofluidik für dynamische Untersuchung der Aggregation roter Blutzellen

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

Bildgebung der Wurzelhaare Morphologie der Arabidopsis Sämlinge in einer zweischichtigen mikrofluidischen Plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...