Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health (ES07408 und EB00208) unterstützt.

1. ECIS / Taxis Vorbereitung der Elektrode <ol><li> Die Goldoberfläche der ECIS / Taxis Elektrodenanordnung (bestehend aus 8 Kammern pro Folie) wird zuerst durch die Vorbehandlung mit sterilem 10 mM Cystein in entionisiertem Wasser (dH 2 O) 15 min bei Raumtemperatur unter sterilen Bedingungen stabilisiert. </li><li> Saugen Sie die Cystein-Lösung von jeder Elektrode Kammer, spülen Sie 3-mal mit sterilem dH 2 O, und ersetzen mit 250 ul Vollmedium (RPMI 1640, 10% FBS, 25 mM HEPES-Puffer). </li><li> Verbinden Sie die Elektroden-Array zu Array Instrument Pins auf Inhaber zu kontaktieren, um Elektrode Prüfung durchzuführen. </li><li> Chambers, die richtig angeschlossen sind, werden in grün auf dem Bildschirm hervorgehoben werden. Wenn die Kammern in rot hervorgehoben werden, sind sie nicht verbunden ist und die Elektrode in der Anordnung Halterung neu positioniert werden, um Kontakte für alle Kammern zu schaffen. </li><li> Nachdem alle Kammern verbunden sind, auf dem &quot;Check&quot;-Button in der Software-Controller zur Abschreckungabzubauen des anfänglichen Widerstands und Kapazitätswerte für jede Kammer. Die Widerstandswerte sollten zwischen 1600 und 2000 Ohm sein, und Kapazitätswerte sollte zwischen 5 und 6 Nanofarad für eine 8-Kammer-Array sein. Wenn eine Kammer ist nicht akzeptabel innerhalb dieser Parameter sollte die einzelne Kammer nicht verwendet werden, um Daten zu sammeln. </li><li> Trennen Sie die Elektrode aus Array Halter, um die einzelnen Kammern Agarose vorzubereiten. Aspirieren Medium aus den Kammern und waschen jeder Kammer 3 mal mit sterilem dH 2 O. </li></ol> 2. Vorbereiten Agarose Chambers <ol><li> In einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen aus Polypropylen, fügen Maßnahme 0,03 g Seakem GTG Agarose und 1 ml steriler PBS. Ersetzen Tubenkappe locker, und schmelzen die Agarose in Autoklaven für 2 min Flüssigkeit Zyklus (Schmelzen in einer Mikrowelle ist nicht für diesen Assay wirksam). Diese kurze Zeit nicht schmelzen wird das konische Rohr. Für weniger anspruchsvolle Zellen, die keine Serum für Kultur, (zB Dictyostelium discoideum) 0,5%Agarose kann im entsprechenden Medium hergestellt werden und in der Mikrowelle geschmolzen. Der Autoklav wird, die für Zellen, die Serum erforderlich, da dies denaturiert, wenn in der Mikrowelle geschmolzen werden. </li><li> 5 ml vollständigem RPMI-Medium in einem Wasserbad erwärmt (55 ° -60 ° C) direkt an der heißen Agarose, bis zu einer Endkonzentration von 0,5% Agarose und Pipette nach oben und unten vorsichtig mischen. </li><li> Jeweils 300 pl geschmolzener Agarose Medium in jede Kammer, ersetzen Sie die ECIS / Taxis Array Deckel und lassen Sie Gel bei Raumtemperatur. </li><li> Pipettieren verbleibenden Agarose in die Kappe von 15 ml Tube zu Agarose Gelieren zu beurteilen. Dieses überschüssige Agarose wird auch in Teil 4 verwendet werden: Schneiden Brunnen in Agarose. </li></ol> 3. Der Bau und die Schärfung der Kanüle Nun Cutting Tool <ol><li> Schärfen zwei 14 Gauge Kanüle stumpfes Ende, mit einem 5/64 &quot;-Bit. Drehen der Spitze des Bohrers in jedem Kanülenöffnung mit einer langsamen Geschwindigkeit bohren, dass bestimmte der Bohrer schneidet gesamten Innenkante jeder Kanüle opkung auf eine scharfe Schneidkante (Abbildung 4A) zu bilden. </li><li> Bohren Sie zwei Löcher, durch ein &quot;x 2&quot; x ¼ &quot;Plexiglas (4B-D) mit einem 5/64&quot; Bit in einer Bohrmaschine. Legen Sie jede geschärft 14-Gauge-Kanüle so dass es einen gleichen Abstand durch jede Plexiglas Loch ragt. </li></ol> 4. Schneiden Wells in Agarose <ol><li> Sterilisieren Sie die 14-Gauge-Kanüle durch leichtes flammenden die Tipps. Vor dem Schneiden Vertiefungen in der Kammer ECIS, ermöglichen die Kanülen auf Raumtemperatur abkühlen, oder Kühlen des Kanülen durch Berühren des Agarose in der Kappe des 15 ml-Röhrchen. Wenn die Temperatur der Kanüle zu hoch ist, wird die Agarose zu schmelzen als die Kammer Vertiefungen geschnitten werden, wodurch die Vertiefungen verformt und beschädigt. </li><li> Richten Sie die Kanüle Paar oberhalb der beiden Gold-Punkte rund um die Ziel-Elektrode in jeder Kammer (Abbildung 2c und 5). Legen Sie die Kanüle senkrecht, ohne horizontale Bewegung, Anhalten auf sanfte Berührung zwischen der Kanüle unddie Elektrodenoberfläche. Entfernen Sie vorsichtig die Kanüle wieder ohne horizontale Bewegung. Platzierung von zusätzlichen Bohrungen für den Widerstand gegen Gradienten ist auch eine Umgestaltung der Kanüle jig möglich. </li><li> Vorsichtig absaugen der Agarose-Stecker von der Kanüle verließ, mit einem sterilen 9 &quot;Pasteurpipette, verbunden mit geringen Unterdruck, mit einem Staubsauger zu fangen Agarose Abfall. </li><li> Dann werden 300 ul vollständigem RPMI Medium auf die Oberfläche jeder Kammer bei 37 ° C, 2 min, um die Agarose zu sättigen, und dann sanft Absaugen der Medien von der Oberfläche und den Vertiefungen ohne die Agarose. </li></ol> 5. Das Laden des Wells <ol><li> Jedes der gut ist fähig, ein Volumen von 7 pl. Um ein gut in jeder Kammer werden 7 ul Zellen Suspension. Für Jurkat T-Zellen, verwenden Sie 2 x 10 7 Zellen / ml. Diese Zellen werden bis 7 ul 200 ng / ml SDF-1α nicht vollständig RPMI verdünnt, die Serum fehlt reagieren. Nur mit kompletter Medien allein als eine negative control. </li><li> Nachdem die Brunnen geladen werden, sehen jede Kammer des Arrays mit einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, daß alle Vertiefungen geschnitten wurden und richtig ausgefüllt. Die Zellen sollten in innerhalb der Grenzen des Brunnens Grenze. Wenn sie in beiden Brunnen zu sehen sind, oder sind darüber hinaus auch Grenzstreuen Zelle, dann eine Lücke unter dem Agarose gebildet. Beachten Sie die falsch eingerichtet Brunnen, da die Daten nicht zuverlässig von den Kammern zu interpretieren. </li></ol> 6. Data Collection <ol><li> Legen Sie die Elektrode in der Anordnung Halter und wieder anschließen, die Gold-Pads auf der Elektroden-Array auf die federbelastete Pogostiften des Inhabers und klicken Sie auf &quot;Setup&quot;. Die Brunnen, die richtig angeschlossen sind, werden grün markiert werden. Wenn die Vertiefungen rot sind, sind sie nicht miteinander verbunden und die Elektrode in der Anordnung Halter positioniert werden. </li><li> Wählen Sie &quot;8WE1&quot; (8 und 1 Elektrode) aus dem Dropdown-Menü in der Software-Bedienfeld, um die Array-Konfiguration angeben. </li><li> Wählen Sie &quot;Check&quot; in der Software control-Panel, um die anfängliche Widerstand und Kapazität für jeden gut zu bestimmen. Die Widerstandswerte sollte zwischen 1600 und 2000 Ohm betragen, während die Kapazitätswerte zwischen 5 und 6 Nanofarad sein sollte. </li><li> Wählen Sie mehrere Frequenzen, um Widerstand bei mehreren Frequenzen zu messen. Es gibt eine Auswahl von Customizing-Frequenzen, oder mit einem Satz von empfohlenen Frequenzen. Die Standard-Einstellungen mit mehreren Frequenzen Erwerb erfassen Daten mit 11 voreingestellten Frequenzen (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 und 64.000 Hz) bei einer Rate von 8 Wells / min. Das Zeitintervall zwischen den Messungen können auch angepasst werden. Sammeln von Daten mit mehreren Frequenzen erlaubt die Analyse der Kapazität, Impedanz und Widerstand. Sammeln Widerstandswerte bei 4.000 Hz reicht meist für Säugetierzellen Chemotaxisstudien, aber die zusätzlichen Frequenzen können Informationen in anderen Zusammenhängen 12,13 liefern. </li><li> Insgesamt Experiment Dauer eingestellt werden, auf der rechtenPanel, oder das Experiment kann manuell gestoppt werden, indem Sie auf &quot;Fertigstellen&quot;, um Zellen Widerstand auf, die von der Ankunft an der Elektrode sind produziert haben. Die Zeit, die für die Zelle auf der Elektrode ankommt, ist abhängig von dem Zelltyp verwendet. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Start&quot; um die Datenerfassung zu starten. </li></ol> 7. Data Management <ol><li> Obwohl die Daten nach Excel exportiert werden können, ist die ECIS 1600R-Software, die das System ECISθ begleitet die effizienteste Methode, um ECIS / Taxis Daten zu analysieren. </li><li> Die Software-Daten-Analyse-Tool-Bar enthält die Radio-Buttons Z, R und C. Diese bestimmen, ob Impedanz, Widerstand, Kapazität oder jeweils auf der vertikalen Achse gegen die x-Achse (verstrichene Zeit) aufgetragen ist. </li><li> ECIS / Taxis Daten erfolgt am effektivsten als Widerstand im Laufe der Zeit bei 4.000 Hz angezeigt. Raschen Schwankungen im Widerstand oder microtransients (1), belegen zelluläre Bewegung über die Elektrode. Kompilieren, or Binning die Datenpunkte, so dass nicht alle Punkte grafisch dargestellt werden, ist nicht für die ECIS / Taxis zu empfehlen, da wird es durchschnittlich microtransients aus den Daten. </li><li> Nachdem die Grafik wurde mit dem Software ECIS1600R gemacht worden, kann er durch Auswahl von &quot;Export Graph&quot; aus dem Menü Datei gespeichert und als. Tif oder. Jpg-Datei exportiert werden. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Zelluläre Chemotaxis wird durch eine Erhöhung des Widerstands bei 4.000 Hz angegeben. Die Ankunft der Zellen von der Zielelektrode wird auch durch das Auftreten des raschen Schwankungen im Widerstand als microtransients oder Bewegungsanalyse nach Opp et beschrieben angegeben. al., 2009 (1) 14. Ein negatives Ergebnis wird durch konsequente angegeben, oder eine leichte Abnahme im Widerstand bei 4000 Hz, in Rot in 1 zu sehen. Das Fehlen von microtransients ist auch ein Zeichen von fehlender Bewegung der Zellen auf der Elektrode. Die Zunahme des Widerstandes ist direkt proportionalproportional zur Anzahl der Zellen, die die Elektrode 10 zu überqueren. Die Zugabe des monoklonalen Antikörpers spezifisch für eine chemische Lockstoffe oder Toxine bekannt, mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren zu blockieren stören können Chemotaxis 11. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg" /> Abbildung 1. Chemotaxis von humanen Jurkat T-Zellen in Reaktion auf SDF1α. Humane Jurkat T-Zellen (2.0x10 6 Zellen / ml) wurden in einem Gradienten von SDF-1α ausgesetzt (Ausgangskonzentration 100 ng / ml) oder RPMI 1640 als negative Kontrolle. Die normierte Widerstand bei 4000 Hz wurde graphisch dargestellt. Humane Jurkat T-Zellen bewegt in Reaktion auf SDF-1α, wie durch die Zunahme des Widerstandes und microtransients nachgewiesen, während keine Bewegung mit der Exposition gegenüber RPMI 1640 zu sehen war. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg" /> Abbildung 2. Draufsicht auf einen ECIS / Taxis Elektrode without Agarose. Jeder ECIS / Taxis Elektrode besteht aus 8 einzelnen Kammern bestehen. Jede Kammer teilt eine große Elektrode (a), und enthält einen einzelnen Zielelektrode (b). Jede Kammer hat auch 2 Gold Kreise (c), die als Leitfaden verwendet werden, wenn das Schneiden der Brunnen in der Agarose mit der Kanülen. Die Gold-Quadrate (d) sind die Kontaktflächen, die zu den Pogo-Stifte verbinden, um den Wechselstrom an die Elektrode angewendet. Die einzelnen Ziel-Elektroden sind jeweils in der Schaltung mit größeren Gegenelektrode (e). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg" /> Abbildung 3. Zwei Vertiefungen werden in jede Agarose-gefüllte Kammer geschnitten. Wenn die chemische Lockstoffe einem zugegeben und es einen Gradienten in der Agarose zu schaffen, mit der höchsten Konzentration der chemoattract am nächsten zu der Lockstoff auch diffundiert. Die Zellen reisen unter der Agarose zu höheren Konzentrationen von Lockstoff und übergehen kann die Ziel-Elektrode. Alsdie Zellen kreuzen die Zielelektrode, wird eine Erhöhung des Widerstands der ECIS 1600R Software aufgezeichnet. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg" /> Abbildung 4. Insertion von zwei 14-Gauge-Kanüle in Plexiglas. A) A 5/64 &quot;Bohrer wird verwendet, um die Kanülenspitze zu schärfen. B) Zwei Löcher müssen in Plexiglas gebohrt werden, um das 14-Gauge-Kanüle nach dem Schuss Layout unterzubringen. C) Verwenden Sie eine Bohrmaschine, um die Löcher zu gewährleisten sind senkrecht zum pleixglass Oberfläche. D) zwei geschliffenen Kanülen werden über ¼ &quot;Plexiglas, 2 mm voneinander entfernt (gemessen vom inneren Kanten) eingefügt. Diese Kanülen geschärft werden vorsichtig in Agarose eingesetzt, um die Brunnen zu schneiden. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg" /> Abbildung 5. Ausrichten von Kanülen mit goldenen Punkten in ECIS / Taxis Kammer. Zum Brunnen ausfallen, muss das geschärfte Kanülenmit den flankierenden Goldpunkten das Ziel Elektrode an der Unterseite des ECIS / Taxis Kammer ausgerichtet werden. Die Kanülen sollten vertikal eingesetzt werden, ohne horizontale Bewegung, und entfernt in der gleichen Weise.

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Ein Knecht David und Michael A Lynes haben eine erteilte Patent für die ECIS / Taxis-Technologie, die wie von der University of Connecticut zu Applied Biophysics, Inc. lizenziert worden

Neuartige Merkmale des ECIS / Taxis Assay in seiner Fähigkeit, die Sammlung von Daten in Echtzeit zu automatisieren, wenn die Zellen für chemische Lockstoffe reagieren. Während die banalsten Anwendung dieser Technologie ist es, zelluläre Antworten auf individuelle chemotaktischen Gradienten zu messen, oder an Steigungen von Mischungen von Chemotaxis Agonisten und-Antagonisten umfasst, ist die ECIS / Taxis Ansatz auch zugänglich für Abweichungen von diesen Konfigurationen, die sehr hilfreich sein in der EU noch Beu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> Angewandte Biophysik </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS Elektroden-Array </td><td> Angewandte Biophysik </td><td> 8W Chemotaxis </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG Agarose </td><td> BioWhittaker Molecular Applications </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone fötalem Rinderserum </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1670049 </td><td> Penicillin 5000 IU / ml; Streptomycin 5 mg / ml </td></tr><tr><td> HEPES-Puffer </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1688449 </td><td> 1M-Lösung, die Zellkultur </td></tr><tr><td> 14 Gauge Kanüle aus Edelstahl (2) 4 Zoll </td><td> Allgemeine Labor Supply </td><td> 5-8365-1 </td><td> Blunt Punkt </td></tr></tbody></table>

measurement of cellular chemotaxis with ecis/taxis

Zelluläre Bewegung in Reaktion auf externe Stimuli ist von grundlegender Bedeutung für viele zelluläre Prozesse einschließlich Wundheilung, Entzündung und der Reaktion auf eine Infektion. Eine übliche Methode zur Chemotaxis messen, ist die Boyden-Kammer, in die Zellen und für chemische Lockstoffe durch eine poröse Membran getrennt sind. Wenn Zellen durch die Membran in Richtung der Lockstoff migrieren, sie an der Unterseite der Membran, oder fallen in die darunter liegenden Media zu halten, und anschließend gefärbt und visuell gezählt 1. Bei diesem Verfahren werden die Zellen in einem steilen Gradienten und vorübergehend für chemische Lockstoffe, die vermutlich eine schlechte Darstellung von Gradienten in Geweben 2 fanden sein ausgesetzt ist. Ein weiterer Assay-System, das unter Agarose-Chemotaxis-Assay, 3, 4 Maßnahmen Zellbewegung über ein festes Substrat in einem dünnen flüssigen Film, der unter dem Agarose-Schicht bildet. Die Steigung, die in der Agarose entwickelt ist flach und wird gedacht, um eine App seinlich und sinnvoll Darstellung von natürlich vorkommenden Steigungen. Chemotaxis kann durch mikroskopische Abbildung der Strecke ausgewertet werden. Sowohl der Boyden-Kammer Assay und der unter-Agarose-Assay werden meist als Endpunkt-Assays konfiguriert. Die automatisierte ECIS / Taxis System kombiniert die unter-Agarose-Ansatz mit Elektro-Zell-Substrat-Impedanzabtastung (ECIS) 5, 6. In diesem Assay werden Ziel-Elektroden in jeder von 8 Kammern. Eine große Gegenelektrode fließt durch jeden der 8 Kammern (2). Jede Kammer ist mit Agarose gefüllt und zwei kleine Vertiefungen sind die Senkung der Agarose auf beiden Seiten der Zielelektrode. Eine Vertiefung wird mit dem Test-Zellpopulation gefüllt, während die andere enthält die Quellen des Diffundierens chemoattraktive (Abbildung 3). Der Strom durch das System geleitet werden verwendet, um die Änderung des Widerstands, die als Zellen über die Zielelektrode übergeben tritt zu bestimmen. Die Zellen auf dem Ziel electrode um den Widerstand des Systems 6. Darüber hinaus vertreten schnellen Schwankungen im Widerstand Änderungen bei den Wechselwirkungen von Zellen mit der Elektrodenoberfläche und deuten auf anhaltende zelluläre Form ändert. Die ECIS / Taxis kann messen Bewegung des Zellpopulation in Echtzeit über längere Zeit, sondern auch empfindlich genug, um die Ankunft einer einzelnen Zelle in der Target-Elektrode zu erfassen. Dictyostelium discoidium ist bekannt, dass in der Gegenwart eines Folat-Gradienten 7, 8 und die chemotaktische Reaktion lässt sich durch ECIS / Taxis 9 gemessen werden migrieren. Leukozyten Chemotaxis, als Reaktion auf SDF1α und Chemotaxis-Antagonisten können auch mit ECIS / Taxis 10, 11 gemessen. Ein Beispiel für die Leukozyten Reaktion auf SDF1α ist in 1 gezeigt.

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Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Die ECIS / Taxis-System ist ein automatisiertes Echtzeit-Assay misst die zelluläre Chemotaxis. In diesem Assay verschieben Zellen unter einer Schicht aus Agarose auf ein Ziel Elektrode ankommt. Zelluläre Bewegung wird durch das Einsetzen des Widerstands in Wechselstrom 0 gemessen.

Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

measurement-of-cellular-chemotaxis-with-ecistaxis

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Aufrufe.  University of Connecticut. Die ECIS / Taxis-System ist ein automatisiertes Echtzeit-Assay misst die zelluläre Chemotaxis. In diesem Assay verschieben Zellen unter einer Schicht aus Agarose auf ein Ziel Elektrode ankommt. Zelluläre Bewegung wird durch das Einsetzen des Widerstands in Wechselstrom 0 gemessen.

Serie: Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Studium der bakteriellen Chemotaxis Mit Mikrofluidik - Interview

Forschung

Biologie

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung mit Groove Patterns für ein Studium Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades. Today, such pipettes are made from glass capillaries using a programmable puller. Such instruments heat the capillary using either a metal filament or a laser and draw out the glass using gravity, a motor or both. Pipettes for patch-clamp recording are formed using only heat and gravity, while sharp electrodes for intracellular recording use a combination of heat, gravity, and a motor. The procedure used to make intracellular recording pipettes is similar to that used to make injection needles for a variety of applications, including cRNA injection into Xenopus oocytes. In general, capillary glass &lt;1.2 mm in diameter is used to make pipettes for patch clamp recording, while narrower glass is used for intracellular recording (outer diameter = 1.0 mm). For each tool, the puller is programmed slightly differently. This video shows how to make both kinds of recording pipettes using pre-established puller programs.

This video shows how to use a programmable puller to make patch pipettes and sharp electrodes for electrophysiology. The same procedure can be used to make a variety of glass tools, including injection needles.

Machen Patch-Pipetten und Sharp Elektroden mit einem programmierbaren Puller

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades.  Today, such pipettes are made from glass capillaries ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Imaging Exocytose in Retinal bipolaren Zellen mit TIRF-Mikroskopie

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Quantifizierung von bakteriellen Chemotaxis in Stable Konzentrationsgradienten

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Messung der Lebensdauer in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Imaging G Protein-gekoppelten Rezeptor-vermittelte Chemotaxis und seine Signalereignisse in Neutrophilen-like HL60-Zellen

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...