Förderung durch das südliche Arizona Veterans Affairs Health Care System VA Merit Bewertung gewähren 0142 und Arizona Biomedical Research Commission erteilen 0803 zur Verfügung gestellt.

Vorbereitung Gewebe auf Folien angezeigt werden <ol><li> Ein Koloskop kann in den Dickdarm durch den Mastdarm weitergegeben werden. Ein Koloskop ist ein langer Schlauch, der Beleuchtung und eine Videokamera an der Spitze hat, die Fähigkeit, Luft in den Darm passieren, um es zu sprengen, wie ein langer Ballon zur besseren Visualisierung des Dickdarms zu ermöglichen, und hat einen Durchgang für Biopsiezangen, dass kann erstrecken sich über die Videokamera zu kneifen Sie einen 3-5 Millimeter Bereich der inneren Oberfläche &quot;Haut&quot; oder Schleimschicht des Darms, um uns eine Biopsie. Die Biopsiezange kann auch verwendet werden, um potenziell entfernen präkanzeröse Polypen im Dickdarm gefunden werden. </li><li> Wir erhalten Biopsien von normalen Kolon-Schleimhaut-Gewebe von Patienten mit der Einwilligung. Diese Patienten befanden sich einer Vorsorge-Koloskopie in einem Magen-Darm-Klinik. Unsere Biopsien wurden in Gläsern von Formalin gelegt. Nach 4 Stunden wurde das Formalin durch 70% Alkohol ersetzt. </li><li> Ähnliche Gewebeproben wurden aus dem Bereich der Doppelpunkt Resektion, bei der Operation entfernt werden, dass 1 cm und 10 cm entfernt von Darmkrebs oder Adenome mit fortgeschrittenen Neoplasien wurden. Diese Gewebeproben wurden auch in Formalin gelegt, und wenn die Gewebeproben waren groß, einige wurden in Formalin für einen längeren Zeitraum, bevor sie in 70% Alkohol gelegt gehalten. </li><li> Die Gewebeproben werden einem histologischen Labor für bearbeitet und in Paraffin-Blöcke übernommen. </li><li> Paraffin-Blöcke sind in einem Kühlschrank, damit sie leichter durch ein Mikrotom geschnitten gekühlt. </li><li> Gewebeschnitte von 4 Mikrometer Dicke aus dem Gewebe Blöcke geschnitten, mit einem Mikrotom, und schwebte auf dem Wasser. </li><li> Für den Vergleich Expression von zwei Proteinen, zum Beispiel ERCC1 und PMS2 können alternative Gewebeschnitte bis auf zwei Schlitten abgeholt werden, bis es drei Gewebeschnitte auf jedem der beiden Folien sind. Zum Beispiel können Abschnitte 1, 3 und 5 auf einer Folie beschriftet ERCC1 und den Abschnitten 2, 4 und 6 auf einer Folie beschriftet PMS2 platziert werden können platziert werden. Mit drei Gewebeschnitte immungefärbt für ein Protein auf einer einzelnen Folie ermöglichen es Ihnen, zu sehen, ob eine ungewöhnliche Färbung Muster einer Krypta ist ein Artefakt oder real ist, da Artefakte nicht in mehr als einem Gewebeschnitt auf einer Folie wiederholt werden. Colon Krypten sind etwa 60 Mikrometer im Durchmesser, so dass etwa 15 Gewebeschnitte durch eine Krypta konnte reduziert werden, die gleiche Krypta konnte auf mehreren Gewebeschnitte pro Folie angezeigt werden. </li></ol> Immunfärbung Gewebeschnitten <ol><li> Die Folien werden dann durch die immunhistochemische Markierung Verfahren gestellt. Dies ist ein 8 Stunden Prozedur, und ist ziemlich Standard. Die Teile des Verfahrens, die wir verwenden, die nicht Standard, Verwendung von Sequenza Container für die Färbung, und die Verwendung einer Lösung, um die Hintergrundfärbung genannten &quot;Sniper&quot; zu reduzieren. Die &quot;Sniper&quot;-Lösung ist als proprietäre Formel Biocare Medical, Concord CA verkauft. </li><li> Einige der Schritte von unserem Verfahren werden hier gezeigt. </li><li> Als Beispiel für PMS2 Immunhistochemie, Folien ersten deparaffinierten indem in 3 Änderungen von Xylol (3 Minuten), gefolgt von 2 Änderungen in 100% Ethanol (2 Minuten), gefolgt von 2 Änderungen in 95% Ethanol (2 Minuten, gefolgt jedes), gefolgt von 2 Änderungen von destilliertem Wasser (2 Minuten). Diese Verfahren werden im Rahmen eines chemischen Kapuze mit Unterdruck durchgeführt, so dass der Experimentator nicht den Dämpfen ausgesetzt. </li><li> Wenn Formalin wurde ursprünglich verwendet, um das Gewebe zu beheben, wurden Teile der Proteine ​​in der Gewebeprobe vernetzt. Jetzt müssen wir die Querverbindungen zu brechen, so dass ein Antikörper das Protein von Interesse erkennen kann. Die Folien sind in einer Pufferlösung, die zum Kochen in der Mikrowelle gebracht wird gestellt. Diese um 10 Minuten auf der mittleren Einstellung wird gefolgt durch Abkühlen für 20 Minuten auf Eis. Dieser Schritt muss geprüft und für verschiedene Mikrowellen eingestellt werden, bis gute Ergebnisse erzielt werden. Beachten Sie, dass für die Immunfärbung CCOI oder Ku86 wir eine Natriumcitratpuffer mit 9 mL Zitronensäure + 41ml Natriumcitrat + 450 ml H 2 O (ein Puffer mit Natrium-Ionen), die einen pH-Wert von etwa 6,0 hatte, für ERCC1 verwendeten wir einen Citratpuffer made ​​verwendet mit 2,1 g Zitronensäure + 1 Liter H 2 O + ~ 5 ml Natronlauge auf pH-Wert auf 6,1 (Puffer mit geringem Zusatz von Natrium-Ionen) zu bringen, und für PMS2 verwendeten wir eine Lösung mit 5 ml Antigen Demaskierung Lösung (von VECTOR) + 533mL gemacht H 2 O. Verschiedene Puffer werden benötigt, um Antikörper-Wechselwirkung mit bestimmten Protein-Epitope zu erhöhen. </li><li> Die Folien werden dann in 3% Wasserstoffperoxid (verdünnt in Methanol) für 20 Minuten durch einen in destilliertem Wasser spülen für 3 Minuten und wusch in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS genannt) für 5 Minuten setzen. </li><li> Folien werden dann in flachen schmalen Färbegestelle genannt Sequenza (Shandon Sequenza Immunfärbung System von Thermo Scientific) gelegt und mit PBS gespült. </li><li> Die Folien werden für ERCC1 oder PMS2 immungefärbt werden dann 10 min ausgesetztnuten Exposition einen zusätzlichen Behandlung von 3 Tropfen eine proprietäre Lösung, aus Biocare erhalten, genannt &quot;Sniper&quot;, die auf nicht-spezifische Färbung von Proteinen zu reduzieren Hintergrund wirkt. </li><li> Die Folien sind mit einem Puffer &quot;TBST&quot;, die 1 ml Tween + 100 ml 10x Tris + 900 ml destilliertem Wasser wird [wo 10x Tris beträgt 24,2 Gramm Trizma + 80 Gramm NaCl + 1.000 ml destilliertem und entionisiertem Wasser + konzentrierter HCl (ca. 15 gespült ml), um die Lösung auf pH 7,6]. </li><li> Folien werden dann dreimal mit Puffer gespült und 100 Mikroliter DAKO biotinylierten sekundären Antikörper bei 1:100 Verdünnung (in 2% Rinderserumalbumin in Puffer TBST gemacht) wird, um die Folien hinzugefügt und inkubiert für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> An dieser Stelle ist Vectastain ABC (Avidin Biotin Complex) (von Vector Laboratories) Reagenz hergestellt, mit 2,5 ml PBS, 1 Tropfen Lösung A, 1 Tropfen Lösung B, und die Lösung wird für 30 Minuten ruhen lassen. </li><li> Die Folien sind 3 mal mit TBST gespült. </li><li> Dann wurden 3 Tropfen Vectastain ABC-Reagenz zugesetzt und die Folien sind bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von Spülen 2 mal mit TBST. </li><li> Folien werden dann in DAB (Diamino-benzamid) (2,9 ml DAB + 400 Mikroliter PBS + 250 Mikroliter Wasserstoffperoxid) für ca. 5 Minuten getaucht. </li><li> Folien werden dann 2 mal mit destilliertem, deionisiertem Wasser gespült. </li><li> Gegenfärbung mit einer verdünnten Lösung von Hämatoxylin für 10 Sekunden. Slides sind gründlich in Leitungswasser durch VE-Wasser gespült. </li><li> Folien werden dann entwässert 2 Mal für 2 Minuten in 95% Ethanol, 2-mal 2 Minuten lang in 100% Ethanol und 2-mal 2 Minuten lang in Xylol. </li><li> Ein paar Tropfen Cytoseal XYL (Richard-Allan Scientific) werden dann auf die Folien hinzugefügt und ein Deckglas aufgebracht. </li><li> Immunhistochemische Auswertung der ERCC1, Ku86 und CCOI werden mit dem gleichen Protokoll wie für PMS2, wobei jedoch die PMS2 Antikörper mit Antikörpern für ERCC1, Ku86 und CCOI beschrieben in der Tabelle unten. </li></ol> Auswertung Gewebeschnitten für Krypten Mangel an Ausdruck ERCC1, PMS2, Ku86 und CCOI <ol><li> Wir werden sehen Gewebes Teile zuerst unter einem Motic (DM-BA300) Photomikroskop für die Expression von PMS2 und ERCC1 in Krypten der Darmschleimhaut. </li><li> PMS2 und ERCC1 sind beide DNA-Reparatur-Enzyme, und so sie sich befinden, wo die DNA ist, in den Kernen der Zellen der Krypten. Dies ist in Abbildung 1, wo die braune Doppelpunkt darstellt Färbung für ERCC1, tritt in den Kernen der Zellen in einer Krypta angegeben. Die normale Krypta zeigen wir zunächst in das Mikroskop wurde für ERCC1 gefärbt, und die braune Färbung zeigt den Standort der ERCC1. Wir weisen darauf hin, welche Arten von Zellen in den Krypten, wo &quot;Becherzellen&quot; so etwas wie ein Weinglas geformt sind, mit Kernen auf eine kleine Region an der Basis der Zellen am äußeren Rand der Krypta und eine Ballonfahrt aus Abschnitt gefüllt mit weißem Schleim Granulat in dem Teil der Zelle auf der Innenseite der Krypta. Die beiden anderen Arten von Zellen wirken etwas gleichermaßen in unseren gefärbten Schnitten, und sie sind die Enterozyten und enteroendokrinen Zellen und ihre Kerne sind auch an den äußeren Rand der Gruft, an der Basis der Zellen. In Biopsien von Patienten, die nie ein Kolon-Neoplasien oder in Biopsien weit entfernt von jeder Seite von Darmkrebs genommen, zeigen fast alle Kerne in allen Krypten normalen hohes Maß an Ausdruck ERCC1 wie hier gezeigt. </li><li> Zur Ausrichtung unserer Beobachtungen, Gewebeschnitte aus Biopsien von Patienten mit Kolon-Neoplasien nicht erhalten werden, für die Stufen der Expression von PMS2, ERCC1, CCOI oder Ku86 in normalen Darmschleimhaut beobachtet. Wir alle können die Krypten in einem normalen Gewebe Abschnitt zu beobachten, mit einem 40x Objektiv, als wir durch eine ganze Gewebeschnitte und weisen darauf hin, die Krypten, die interstitiellen Zellen, jede lymphoide Knötchen auf der Folie, und die Muscularis langsam gehen (falls vorhanden in der Biopsie). </li><li> Wir weisen auch darauf hin, dass es nur einige Zellen an der Basis der Krypta, die die Stammzellen sind. Diese Stammzellen erzeugen alle der rund 2.000 Zellen des gesamten Krypta. Eine Stammzelle mit einer Mutation oder einer Epimutationen kann über den ganzen Stammzellnische nehmen. Dann wird die ganze Krypta kann geändert Färbung für ein Enzym von Interesse (Krypta conversion), wie wir in dieser neuen Folie, wo wir ganze Krypten mangelhaft sehen für CCOI neben Krypten, die hohe Expression von CCOI haben zu zeigen. </li><li> Dann zeigen wir ein Bild von einem Patienten mit einem Kolonkarzinom oder ein Adenom mit fortgeschrittenen Neoplasien. Auf dieser Folie sind einige Krypten normalen hohes Maß an Ausdruck für ERCC1 und einige haben eine niedrigere Ebenen des Ausdrucks. Alle der Krypten innerhalb des Gewebes Abschnitt sind in niedriger Auflösung mit einem 10x Objektiv fotografiert und die Bilder sind gefliest, so dass das gesamte Gewebe Abschnitt in einem Bild zu sehen ist. Die Krypten werden dann gezählt. </li><li> Die Krypten mit hoher Expression des Enzyms, die typisch für Krypten in Biopsien weit herm jedem Krebs, genannt Ebene &quot;4&quot; Färbung. Andere Ebenen &quot;0&quot;, wenn es keinen Ausdruck nachweisbar, &quot;1&quot;, wenn gerade noch nachweisbare Expression ist offensichtlich, &quot;2&quot;, wenn es Ausdruck vorhanden, aber auf einem viel niedrigeren Niveau als Stufe 4, und &quot;3&quot;, wenn expression in einer Menge von weniger als 4, aber ziemlich stark. Wir dot jede Folie auf dem Bild mit niedriger Auflösung blau für 4, grün für 3, gelb für 2, orange für 1 und rot für 0. Hier zeigen wir durch einen Abschnitt aus einer Biopsie mit einem 40x Objektiv gehen. Wir dot die Krypten auf dem Bild mit niedriger Auflösung. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. A colonic Krypta zeigt eine hohe Expression von ERCC1 in den Kernen der Krypta Zellen. Alle Farben in diesem Bild waren gleichermaßen in Kontrast und Sättigung erhöht, mit Paint Shop Pro 5. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> Der alternative Gewebeschnitte auf separaten Folien ermöglichen es uns, gleichzeitig Kolonkrypten Look, mit Ausdruck von zwei unterschiedlichen Proteinen durch Immunhistochemie dargestellt. Das Bild von einer Krypta gefärbt PMS2 und derselben Gruft gefärbt ERCC1 ist auf benachbarten Mikroskope mit benachbarten Computer-Monitoren gezeigt. Dies ermöglicht es uns, festzustellen, ob es gemeinsame Mangel für zwei Proteine, oder ob die Mängel in jedem der Proteine, während jeder ist häufig, tritt unabhängig. Wir haben drei Gewebeschnitte pro Folie, so dass keine offensichtlichen Mangel an Expression eines Proteins als auf mehr als einem Abschnitt mangelhaft, und nicht aufgrund eines Artefakts überprüft werden kann. In umgebenden Gewebe Darmkrebs, wo gibt es ein Feld auslösenden Fehler, den Krebs, gibt es eine hohe Frequenz von Krypten mangelhaft für ERCC1 und PMS2. </li><li> Wir haben auch Immunhistochemie verwendet werden, um die Häufigkeit der Krypten mangelhaft für Ku86 und CCOI finden. Auf dieser Rutsche, gehen wir durch eine ganze Gewebeschnitte immungefärbt für Ku86, mit einem 40x Objektiv, und wir können sehen, dass nur wenige Krypten mangelhaft für Ku86 in diesem Gewebe vorhanden sind. </li><li> Auch auf dieser Folie, wir durch eine ganze Gewebeschnitte immungefärbt für CCOI, mit einem 40x Objektiv gehen, und wir können sehen, dass nur eine moderate Anzahl der Krypten mangelhaft für CCOI sind. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hydrophobic+bile+acids,+genomic+instability,+Darwinian+selection,+and+colon+carcinogenesis.">hydrophobic bile acids, genomic instability, Darwinian selection, and colon carcinogenesis.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 1, 19-47 (2008).</li></ol>

<ol><li> Es ist sehr wichtig bis 3 Gewebeschnitte pro Folie haben. Bubbles kann auftreten, wenn die Anwendung der Medien trägt der Antikörper, so dass einige Krypten oder Teile der Krypten möglicherweise nicht ausreichend gefärbt werden, nur weil eine Blase verhindert der Antikörper eine Reaktion mit dem Gewebeschnitt. Krypten sind etwa 60 Mikrometer im Durchmesser, und Gewebeschnitten sind 4 Mikrometer dick, so konnte es nicht weniger als 15 Gewebeschnitte werden durch die gleiche Krypta. Es ist in der Regel möglich, die gleiche Krypta zu finden, mit der Morphologie der Krypta als Leitfaden, auf mehreren Gewebeschnitte auf einen Objektträger gegeben. </li><li> In unserer aktuellen Studien, für große Gewebeproben können Färbung in einer Sequenza keine guten Antikörper Abdeckung des Gewebes. In diesen Fällen kann man lieber Hand Färbung des Gewebes, wo ein Rückgang von Medien, die den Antikörper über jede Gewebeprobe Hand gelegt zu verwenden. </li><li> Um klar zu sehen das braune Färbung zeigt die Expression des immungefärbt Protein, und die blaue Färbung zeigt Kern-DNA auf dem Computermonitor, die Motic Photomikroskop Software wird wie folgt angepasst: Gain 0, Offset 0, Enhance 0, 255, Gamma 1.00, 0, Schärfe 1, Farbkorrektur 7, R, G, B Gain 1,00 und R, G, B Helligkeit 0. Die Auflösung ist bei 1024 x 768 eingestellt, und Weißabgleich aktiviert ist. </li><li> Unsere Methode könnte verwendet werden mit jeder Proteine ​​angenommen, dass in der Progression zu Darmkrebs wichtig sein, um die Häufigkeit des Mangels zu beurteilen, oder möglicherweise Überexpression, im Feld Mängel umliegenden Darmkrebs oder Adenome mit fortgeschrittenen Neoplasien. </li><li> Feld Mängel sind ein Teil der Progression von Krebs Der Begriff &quot;Feld Kanzerisierung&quot; wurde erstmals von Slaughter et al. 1953: 1 bis ein Gebiet oder &quot;Feld&quot; des Epithels, die von weitgehend unbekannten Prozesse (zu der Zeit) wurde vorkonditioniert, so dass es zur Entstehung von Krebs begünstigen beschreiben. Die ersten Gebrauch wurde im Zusammenhang mit der oralen Krebsarten. Seitdem haben sich die Begriffe &quot;Feld Kanzerisierung&quot; und &quot;Feld Defekt&quot; in größerem Umfang zu einem im Voraus bösartiges Gewebe, in denen neue Krebserkrankungen eher entstehen zu beschreiben, und das Konzept des Feldes Kanzerisierung in der klinischen Onkologie erhalten hat zunehmende Hinweis 2 . Vor kurzem haben wir einen Überblick über die Beweise für das Feld Mängel in Magen-Darm-krebs 3. Eingeschlossen in diese Bewertung wurden die Ergebnisse von etwa einem Dutzend Studien zum Nachweis der Bereich Mängel in den Dickdarm. Feld Mängel in der Darmschleimhaut entstehen wahrscheinlich durch natürliche Selektion von mutierten Zellen oder epigenetisch veränderten Zellen unter den Stammzellen einer Krypta, so dass eine Stammzell-Nische Folge 4 überlebt. Genetische Instabilität oder ein Mutator-Phänotyp, vielleicht auf eine Verringerung der DNA Nukleotidexzisionsreparatur Reparatur oder DNA-Mismatch-Reparatur, würde diesen Prozess beschleunigen (und ein häufiger Fehler in PMS2 war zuvor im Umfeld Darmkrebs 5 berichtet). Wenn in einer normalen Population von Stammzellen in der Darmschleimhaut, erwirbt eine Zelle einen selektiven Vorteil durch eine Mutation oder einer Epimutationen, wird es dazu neigen, klonal expandieren auf Kosten der benachbarten Stammzellen. In der Darmschleimhaut, die Stammzell-Nische von ≤ 5 Zellen 6, dann treten alle (ca. 2.000) Zellen der Krypta besetzt. Eine Übernahme der Stammzell-Nische durch eine Mutante oder epigenetisch verändert Zelltyp Ergebnisse in &quot;crypt Umwandlung&quot; 7. Die Ausbreitung des mutierten Klone (umgerechnet Krypten) im Darmepithel kann meist durch Krypta Spaltung 8 auftreten. Ein Beispiel Krypta Spaltung ist in Abbildung 2 dargestellt. Auf diese Weise ein Stück abnormalen Gewebes entsteht. Innerhalb einer solchen Patch kann eine zweite solche Mutation so auftreten, dass eine bestimmte Krypta ein Vorteil erwirbt im Vergleich zu anderen Krypten innerhalb der Patch, und dieser Krypta erweitert klonal Bildung einer sekundären Patch innerhalb der Original-Patch. In diesem neuen Patch, kann der Prozess mehrere Mal wiederholt werden, vielleicht über Jahrzehnte, bis eine bösartige Stammzellen entsteht die klonal expandiert in eine Krebszelle. Ist dies der allgemeinen Prozess, durch den sporadischen Dickdarm Adenokarzinome entstehen, dann colonic Adenokarzinome der Regel sollte mit in Verbindung gebracht werden, und durch, Felder von Anomalien vorausgehen. So einen Patch von umgerechnet Krypten Man könnte erwarten, erkennbare Mängel in der Umgebung ein Adenom mit fortgeschrittenen Neoplasien oder rund um einen Darmkrebs zu haben. Von diesem Modell der pre-Tumorprogression, würde man erwarten, dass genetische oder epigenetische Veränderungen im Zusammenhang mit pre-Tumorprogression bei Gewebeproben aus den nicht-neoplastischen Kolonschleimhaut im Umland von neoplastischen Läsionen des Dickdarms, die wahrscheinlich zu Krebs Fortschritte getroffen werden finden . Insbesondere würde Defekte in der DNA-Reparatur-Enzyme, oder in Proteine, die für die Apoptose, die Progression durch die Verbesserung genomische Instabilität beitragen und nicht anders zu erwarten, um in einem defekten Bereich gefunden werden. </li><li> Auswahl für Mangel an PMS2, wenn die Zellen deficient für ERCC1 und einer DNA-schädigenden Agens Nara et al. 9 um 25 Kulturen der chinesischen Hamsters 43-3B, alle mit einer Mutation inaktiviert die DNA-Reparatur-Gen ERCC1, und behandelt die Kulturen mit einer DNA-schädigenden Agens, MNNG. Unter den überlebenden Zellen die DNA-Schäden Behandlung wurde eine einzelne Zelle aus jeder Kultur isoliert und erlaubt, einen Klon zu bilden. Alle Klone isoliert wurden, etwa 10-fach resistenter gegen das Töten von MNNG als der elterliche Stamm. Von den Klonen isoliert wurden 22 nachweislich in Mismatch-Reparatur (MMR) defekt. Fünf dieser 22 Klone wurden durch Sequenzierung getestet, und drei der fünf waren mangelhaft für PMS2. Diese Auswahl für Mängelansprüche in PMS2 war vermutlich, weil PMS2 Mangel verursacht Apoptose-Resistenz und damit die Fähigkeit, die hinzugefügt DNA-Schäden noch in Zellen, wenn ERCC1 fehlte überleben. (Normalerweise PMS2 Sinne DNA-Schäden Ebenen, und regt die Zellen zur Apoptose, wenn DNA-Schäden ist zu hoch.) So wird ein Mangel in PMS2 denn wenn ERCC1-defizienten Zellen auf DNA-Schäden ausgesetzt ausgewählt. Clones defekt in beiden ERCC1 und PMS2 wurde gezeigt, dass etwa 500 bis 1000-fach größer Mutationsrate haben, wenn sie mit UV-als Eltern-Zellen bestrahlt. </li><li> Gallensäuren oxidativen Stress verursachen, sind DNA-schädigende Mittel und sind in der Progression zu Darmkrebs wichtig Desoxycholsäure, eine Gallensäure, erhöht oxidativen Stress durch die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) von mehreren Prozessen, einschließlich dem Beschädigen der Mitochondrien 10. Es gibt den letzten Beweis dafür, dass ROS epigenetische Veränderungen 11 verursachen, und mindestens 15 Studien haben gezeigt, dass Gallensäuren, die erhöhte Konzentrationen Begleitung einer Diät mit hohem Fettanteil, verursachen DNA-Schäden 12. Wie von Bernstein et al. 12, gibt es einen positiven Zusammenhang zwischen Nahrungsfett Konsum-und Darmkrebs Inzidenz. Gallensäuren sind in den Darmtrakt in Reaktion auf Fett in der Ernährung abgesondert, und Gallensäuren dienen als Reinigungsmittel in der Fettverdauung helfen. Somit ist eine fettreiche Ernährung mit erhöhtem Galle Säuresekretion. Fecal Gallensäure-Konzentrationen sind in Populationen mit einer hohen Inzidenz von Darmkrebs erhöht, und eine übermäßige Exposition gegenüber Gallensäuren gilt als wichtiger Risikofaktor für Dickdarmkrebs 13 angesehen. Gallensäuren kann eine Ursache für das Defekte im Dickdarm werden. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. A colonic Krypta Spaltung in 3 Krypten. Abschluss Wir fanden eine hohe Frequenz von Krypten Mangel an DNA-Reparatur-Gene ERCC1 und PMS2 (PMS2 ist auch für die Apoptose erforderlich) in großen Feld Mängel umliegenden Darmkrebs. Mängel in ERCC1 und PMS2 (wegen epigenetische Veränderungen oder Mutationen) können erste Schritte in die genetische Instabilität von zentraler Bedeutung für Progression zu Darmkrebs werden.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>PMS2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ERCC1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>MS-671-P1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ku86 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotech.</td>
<td>SC-9034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CcO1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>459600</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated secondary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAKO</td>
<td>E0413</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22% BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Informagen, Inc.</td>
<td>2327</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sniper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocare Medical</td>
<td>BS966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectastain ABC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>34001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>20605</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal XYL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48212-196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

deficient pms2, ercc1, ku86, ccoi in field defects during progression to colon cancer

In der Krebsentstehung, ist das &quot;Feld Defekt&quot; klinisch wegen der hohen Bereitschaft der Überlebenden von bestimmten Krebsarten zu anderen Malignomen des gleichen Gewebetyp, oft in einem nahe gelegenen Standort zu entwickeln anerkannt. Solche Bereich Mängel bei Darmkrebs angegeben worden. Die molekularen Veränderungen, die für ein Feld Defekt im Darm sind, sollten bei hoher Frequenz nachweisbar in der histologisch normalen Gewebe rund um einen Kolon-Adenokarzinom oder Umgebung ein Adenom mit fortgeschrittenen Neoplasien (auf dem besten Weg zu einem Darmkrebs), aber bei einer niedrigen Frequenz in der Darmschleimhaut von Patienten ohne Kolon Neoplasien. Mit der Immunhistochemie wurden ganze Krypten innerhalb von 10 cm auf jeder Seite des Kolon-Adenokarzinome oder fortgeschrittenen Kolon-Neoplasien gefunden werden häufig reduziert oder fehlt völlig in Ausdruck für zwei DNA-Reparatur-Proteine, PMS2 und / oder ERCC1. PMS2 ist eine doppelte Rolle Protein, tätig in DNA-Mismatch-Reparatur sowie bei der Apoptose von Zellen mit einem Überschuss an DNA-Schäden benötigt. ERCC1 ist in der DNA-Nukleotid-Exzisionsreparatur aktiv. Die verminderte oder fehlende Expression beider ERCC1 und PMS2 würden Zellen sowohl mit erhöhter Fähigkeit zu überleben (Apoptose-Resistenz) und erhöhtes Maß an Wandlungsfähigkeit zu schaffen. Die verminderte oder fehlende Expression beider ERCC1 und PMS2 ist wahrscheinlich ein früher Schritt in der Progression zu Darmkrebs. DNA-Reparatur-Gen Ku86 (aktiv in DNA nicht-homologen Endverknüpfung) und Cytochrom-c-Oxidase Untereinheit I (beteiligt in Apoptose) hatte jeder berichtet worden, in der Expression in der Schleimhaut Gebieten in der Nähe Darmkrebs gesenkt werden. Jedoch zeigte immunhistochemischen Auswertung ihrer Ebenen des Ausdrucks nur gering bis gering Frequenzen von Krypten zu sein in ihren Ausdruck in einem Feld Defekt umgebenden Darmkrebs oder Umgebung fortgeschrittenen Dickdarm-Neoplasie mangelhaft. Wir zeigen hier, unsere Methode der Auswertung der Krypten für die Expression von ERCC1, PMS2, Ku86 und CCOI. Wir zeigen, dass Häufigkeit der gesamten Krypten mangelhaft für PMS2 und ERCC1 ist oft so groß wie 70% bis 95% in 20 cm lange Bereichen rund um einen Kolon Neoplasien, während Häufigkeit der Krypten in Ku86 Mangel hat einen Medianwert von 2% und die Häufigkeit der Krypten Mangel an CCOI hat einen Medianwert von 16% in diesen Bereichen. Der gesamte Dickdarm ist 150 cm lang (ca. 5 Meter) und hat etwa 10 Millionen Krypten in ihrer Schleimschicht. Der Defekt in PMS2 und ERCC1 rund um einen Darmkrebs so kann eine Million Krypten. Es ist von einer defekten Krypta, Darmkrebs entsteht.

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Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

Reduzierte / fehlender Expression von PMS2 und / oder ERCC1 im gesamten Krypten ist ein häufiges Ereignis innerhalb von 10 cm auf jeder Seite des Kolon-Adenokarzinome, wahrscheinlich aufgrund eines Defektes Bereich mit hoher Wandlungsfähigkeit und Progression von Krebs. Ein Mangel an Ku86 oder CCOI ist viel seltener in diesen Bereich Mängel.

Mangelhafte PMS2, ERCC1, Ku86, CCOI in Field Mängel bei der Progression zu Darmkrebs

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

deficient-pms2-ercc1-ku86-ccoi-field-defects-during-progression-to

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Aufrufe.  University of Arizona, Tucson. Reduzierte / fehlender Expression von PMS2 und / oder ERCC1 im gesamten Krypten ist ein häufiges Ereignis innerhalb von 10 cm auf jeder Seite des Kolon-Adenokarzinome, wahrscheinlich aufgrund eines Defektes Bereich mit hoher Wandlungsfähigkeit und Progression von Krebs. Ein Mangel an Ku86 oder CCOI ist viel seltener in diesen Bereich Mängel.

Serie: Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

Die Implantation von Ferumoxides Labeled humanen mesenchymalen Stammzellen in Knorpeldefekte

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Forschung

Biologie

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

Bestimmung des Beitrages der Energy Systems während des Trainings

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Kraftmessung während der Kontraktion zu Muscle Funktion in Zebrafisch-Larven bewerten

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

Der murinen Cholin-Mangel, Ethionine ergänzt (CDE) Diät-Modell einer chronischen Leberschädigung

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction defects can be assessed by tracking methylene blue dye flow within the urinary system. Methylene blue dye is injected into the renal pelvis of perinatal embryonic kidneys and dye flow is monitored from the renal pelvis of the kidney through the ureter and into the bladder lumen after applying hydrostatic pressure. Dye accumulation will be evident in the bladder lumen of the normal perinatal urinary tract, but will be constrained between the renal pelvis and the end point of an abnormal ureter, if urinary tract obstructions occur. This method facilitates the confirmation of urinary tract junction obstructions and visualization of hydronephrosis and hydroureter. This manuscript describes a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis to confirm urinary tract junction obstructions.

Methylene blue dye injection into the renal pelvis facilitates the assessment of urinary tract junction obstruction defects during mouse embryonic urinary tract development. Here, a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis is described.

Beurteilung der Harnwege Junction Obstruktion Mängel durch Methylenblau-Dye-Injektion

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction ...