Name: non-invasive assessment of the efficacy of new therapeutics for intestinal pathologies using serial endoscopic imaging of live mice
Uploaded: 2015-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice at JoVE.com

We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.

Die Walter und Eliza Hall-Institut für medizinische Forschung Tierethikkommission genehmigt jeder der in diesen Protokollen beschriebenen Verfahren. 1. Vorbereitung der experimentellen Mäuse <ol><li> Verfassen experimentellen Kohorten von mindestens 4 Geschlecht abgestimmt 6-8 Wochen alte C57BL / 6 Mäuse (M. musculus), die gezüchtet und in der gleichen spezifischen pathogenfreien (SPF) Tierhaltung / Zimmer untergebracht sind und mit autoklaviertem Nahrung und Wasser versorgt. Die Verwendung von weiblichen Mäusen wird co-Gehäuse von Mäusen aus verschiedenen Linien, Grenz Box-Nummern zu ermöglichen und zu reduzieren Käfig zu Käfig Variation. </li><li> Stellen Sie sicher, dass Mäuse, sind mindestens 6 Wochen alt sein, um die Endoskopie zur Verwendung des 3,0 mm Durchmesser Endoskopie Mantel zu ermöglichen. </li><li> Verwenden Sie Mäusen des gleichen genetischen Hintergrund und, wo möglich, aus den Käfigen auf dem gleichen Rack Variationen mit der Darmflora zu reduzieren gespeichert. Variationen in Mikroflora zwischen Tieranlagen sollte in Betracht whe genommen werdenn Bestimmung der geeigneten Kontrollmäusen und Genotypen für jedes Experiment 22. </li><li> Mark Mäusen durch Ohr / toe Ausschnitte, Tattoos, oder ähnlich wie für eine einfache Identifizierung ermöglichen. </li><li> Wiegen Mäusen am Tag 0, zum Ausgangs experimentellen Gewichte bestimmen. </li><li> Führen Endoskopie (siehe Abschnitt 5) von Mäusen am Tag 0 zum Ausgangswert Kolon Phänotypen aufzuzeichnen. </li></ol> 2. Präklinische Studie in einer Epithelschädigung und akute Colitis Modell <ol><li> Es wird eine Lösung des therapeutischen Mittels zu testen. Für Therapeutika durch orale Gabe (po) geliefert werden, werden die Lösungen auf ein Maximalvolumen von 100 ul. Für Therapeutika durch intraperitoneale (ip) Injektion verabreicht, werden die Lösungen zu einem maximalen Volumen von 200 ul. HINWEIS: Wiederholter ip oder po Verabreichung des Arzneimittels über längere Zeit kann zu veränderten Mausverhalten führen. Wechselt die IP-Injektionsstelle auf längere Beschwerden zu vermeiden. Für po Applikation bieten die Mäuse mit autoLlaved Sonnenblumenkerne als &quot;behandeln&quot; die negativen Zusammenhang mit der Magensonde Verfahren zu minimieren. </li><li> Am Tag 1 verwalten die therapeutische von Interesse (in Schritt 2.1 vorbereitet) und eine geeignete Fahrzeugsteuerungen. In dem Beispiel vorgesehen (6A), 5 ug des rekombinanten humanen (rh) iInterleukin (IL) -11-Protein wurde in 200 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und ip </li><li> Bestimmen Sie den Zeitpunkt und die Häufigkeit der Verwaltungen, die in Abhängigkeit von der pharmakokinetischen Profils des therapeutischen Reagenz, das getestet wird aufgebaut sein wird. Abbildung 1 entnommen prophylaktische Behandlung mit zweimal täglich ip Injektionen im Laufe des Experiments. </li><li> Überwachen Sie, einschließlich Stuhlkonsistenz und das Vorhandensein von Blut, und wiegen jede Maus täglich. An den Tagen nach der Behandlung mit einem Gewicht sollte mit der Verabreichung des therapeutischen Arzneimittels übereinstimmen, um Stress für die Mäuse durch wiederholte Handhabung zu minimieren. </li&gt; <li> An Tag 3 wurden vorbereitet 2,5% (2,5 g / 100 ml) DSS-Lösung im Trinkwasser routinemßig den Mäusen durch die Tiereinrichtung vorgesehen. Etwa 5 ml / Maus / Tag von DSS-Lösung wird für das Experiment erforderlich ist. Der Verbrauch des DSS Wasser kann sich ändern, wenn die Umgebungstemperatur der Tieranlage schwankt. HINWEIS: DSS ist ein Reizmittel und sollten gemäß dem MSDS Anweisungen behandelt werden. </li><li> Für Frisch DSS an die Mäuse ad libitum in Reinwasserflaschen für 5 aufeinander folgenden Tagen. Am Abend des 5. Tag bieten normales Trinkwasser neben püriert Futterpellets und Proteinergänzung in kleinen Petrischalen (100 g Futterpellets / 10 g Protein-Shake / 10 ml Wasser) zur Verfügung gestellt. Dies verhindert das Austrocknen und hilft bei der Minimierung der schweren Gewichtsverlust. </li><li> Euthanize Mäuse durch CO 2 Rausch und sammelt Gewebe die anschließende histologische Untersuchung am Morgen des Tages 8, oder wenn die Mäuse auftreten ≥15% Gewichtsverlust von mehr als drei Consecutive Tage, je nachdem, was zuerst eintritt. HINWEIS: Stellen Sie die DSS-Dosis zwischen 1-4% (w / v) in Abhängigkeit von der Mikroflora der Tierhaltung und der Charge des DSS. Führen Sie Routinechargenprüfung, um die geeignete Dosierung und DSS umgehen Charge zu Charge Schwankungen zu etablieren. Die geeignete Dosierung hängt von Gewichtsverlust (von nicht mehr als 15% des ursprünglichen Gewichts) bezogen und bestätigt ulcerosa Histopathologie. </li></ol> 3. Präklinische Testversion in eine chronische Kolitis oder Colitis-assoziierten Cancer <ol><li> Für die chronische Kolitis Modell beginnen mit Schritt 3.7. </li><li> Für die Colitis-assoziierten Krebs (CAC) Modell, an Tag 1, injizieren jede Maus mit 10 mg / kg (w / w) Azoxymethan (AOM, 250 ul, ip). HINWEIS: AOM ist krebserregend und sollten gemäß dem MSDS Anweisungen behandelt werden. </li><li> Stammlösungen von AOM als 10 mg / ml-Aliquoten hergestellt und bei -20ºC gelagert. Am Tag der Injektion wird die AOM-Stammlösung aufgetaut und auf 1 mg / m verdünntenl in PBS. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen des AOM Stammlösung sollte vermieden werden. </li><li> Der AOM Dosis von 8-12 mg / kg eingestellt werden. Routine Chargenprüfung ist erforderlich, um die geeignete Dosierung AOM, um die Toxizität für Mäuse aufgrund von Charge zu Charge Variation umgehen herzustellen. </li><li> Während der Tage 1-7 folgende AOM Verwaltung Gewichte stabil sein wird und aus diesem Grund Gewichtsüberwachung kann bei Tage 1-7 weggelassen werden, um mit den Tieren, die zytotoxische Metabolite in ihrem Kot ausscheiden wird vermieden. </li><li> Am 7. Tag alle Betten geändert werden muss nach einer zytotoxischen Verfahren. Sobald der Betten Änderung abgeschlossen ist, werden die Tiere nicht mehr benötigen zytotoxische Behandlungsprozeduren, da sie nicht mehr sein Ausscheiden zytotoxische Metaboliten. </li><li> Am 8. Tag, bereiten 2,5% (2,5 g / 100 ml) DSS-Lösung (wie in Schritt 2.5 beschrieben) und bieten den Mäusen ad libitum. </li><li> Wiegen Mäuse täglich während des gesamten Experiments und auf Zeichen von Krankheit, einschließlich gekräuselten fur, gebeugt, Blut im Stuhl und reduzierte Bewegung. </li><li> Am Tag 13, nehmen Sie die DSS-Lösung und stellen die Mäuse mit normalem Trinkwasser bis Tag 28. Tage 8-28 bilden eine &quot;Zyklus&quot; der chronische Kolitis / CAC-Protokoll. </li><li> An den Tagen 13 bis 28, wenn die Mäuse normales Trinkwasser gegeben, stellen die Mäuse mit gestampften Futterpellets und eine Proteinergänzung in kleinen Petrischalen (100 g Futterpellets / 10 g Protein-Shake / 10 ml Wasser) zur Verfügung gestellt. Dies verhindert das Austrocknen und hilft bei der Minimierung der schweren Gewichtsverlust. HINWEIS: Die Proteinergänzungen in Maische nicht zur Verfügung gestellt werden, wenn die Mäuse erhalten DSS haltigen Trinkwasser, um die Konsistenz in DSS Verbrauch zu gewährleisten. </li><li> An Tag 20 führen die zweite endoskopische Untersuchung, einzelne Maus Gesundheit zu überwachen (siehe Abschnitt 5). </li><li> An Tag 29 Wiederholung der DSS-Zyklus (Zyklus 2: 2,5% (w / v) DSS während der Tage 29 bis 33 und normales Trinkwasser während der Tage 34 bis 50 zur Verfügung gestellt). </li><li> An Tag 40 führen die third endoskopische Untersuchung, einzelne Maus Gesundheit zu überwachen und festzustellen, Tumorlast (siehe Abschnitt 5). </li><li> Wenn keine Tumore sichtbar sind durch Endoskopie an Tag 40, beginnt eine dritte DSS Zyklus an den Tagen 50-72 (Zyklus 3: 2,5% (w / v) DSS während der Tage 50-55 und normales Trinkwasser während der Tage 56-72 gestellt). Im Allgemeinen sind Tumoren bis zum Tag 40 sichtbar und daher in den dritten Zyklus DSS kann entfallen. </li><li> Sobald Tumoren werden durch endoskopische Untersuchung sichtbar, weisen Sie jeder Maus eine endoskopische Tumor Score (siehe Abschnitt 5) und weisen Sie einzelnen Mäusen zu Kohorten mit ähnlichen Ausgangstumorbelastungen. </li><li> An Tag 42 (oder bei Tumoren sind sichtbar), die Verwaltung der therapeutischen Verbindung oder relevante Fahrzeugsteuerung (siehe Abschnitt 2.2). Das Timing der Dosierung wird abhängig von der Pharmakokinetik der therapeutisch. Ein Beispiel für einen Eingriff Behandlung ip injiziert dreimal wöchentlich in Mäusen mit etablierten Tumoren vorgesehen ist (Figur 2). </li><li> Führen Sie endoscopic Prüfungen einmal wöchentlich über die Dauer der therapeutischen Behandlung zu überwachen Tumorlast. Im Allgemeinen ist von 4 Wochen nach einer therapeutischen Behandlung ausreichend, um ein objektives Ansprechen auf die Behandlung zu beobachten. Nach Beendigung der Behandlung wird eine Gruppe von Mäusen kann auch durch Endoskopie zur Tumorrückfall beobachtet werden. </li><li> Euthanize Mäuse durch CO 2 Rausch und sammeln Gewebe für biochemische und / oder histologische Analyse am Morgen des Tag 72 oder, wenn Mäuse erleben ≥15% Gewichtsverlust von mehr als drei aufeinander folgenden Tagen, je nachdem, was zuerst eintritt. </li></ol> 4. Präklinische Testversion in eine sporadische Darmkrebs-Modell <ol><li> Am Tag 1 injizieren jede Maus ip mit 10 mg / kg AOM (siehe Schritt 3.2). Der AOM Dosis von 8-12 mg / kg eingestellt werden. Routine Chargenprüfung ist erforderlich, um die geeignete Dosierung AOM, um die Toxizität für Mäuse aufgrund von Charge zu Charge Variation umgehen herzustellen. </li><li> Ist die Einspritzung am ersten Tag jeder Wochefür die folgenden 5 Wochen (Abbildung 3). Die Mäuse sollten entsprechend zytotoxischen Sicherheitsverfahren für den gesamten 6 Wochen behandelt. </li><li> Wiegen Sie jede Maus am Tag der AOM Injektion, dass Ängste auf die Mäuse durch wiederholte Handhabung zu minimieren. HINWEIS: AOM ist krebserregend und sollten gemäß dem MSDS Anweisungen behandelt werden. </li><li> Alle Tiere sollten nach zytotoxischen Sicherheitsverfahren für die 6 Wochen AOM ip Injektionen für dieses Protokoll erforderlich behandelt werden. </li><li> Während der Woche 8 endoskopische Untersuchung für neue Tumoren (siehe Abschnitt 5) zu überwachen. Die endoskopische Untersuchung durchgeführt werden sollte alle zwei Wochen, bis Tumore sichtbar werden. Im Allgemeinen beginnen Wildtyp C57BL / 6 Tieren Tumore um ca. 40 Wochen nach der ersten Verabreichung von AOM zu entwickeln. </li><li> Sobald Tumoren werden durch endoskopische Untersuchung sichtbar, eine endoskopische Tumor Punktzahl weisen Sie jeder Maus (siehe Abschnitt 5) und weisen Sie einzelnen Mäusen zu einer Kohorte mit ähnlichen<html> Tumorbelastung vor dem Beginn der therapeutischen Behandlung. </li><li> Während der Woche 40 (oder bei Tumoren sind erste sichtbare), zur Verwaltung der therapeutischen Verbindung oder die entsprechende Fahrzeugsteuerung. </li><li> Das Timing der Dosierung wird abhängig von der Pharmakokinetik der therapeutisch sein (siehe Schritt 2.1). Ein Beispiel für einen Eingriff Behandlung ip injiziert 3mal wöchentlich in Mäusen mit etablierten Tumoren vorgesehen ist (Figur 3). </li><li> Endoskopische Untersuchung wöchentlich für die Dauer der therapeutischen Behandlung Perioden Tumorbelastung zu überwachen. Im Allgemeinen ist von 4 Wochen nach einer therapeutischen Behandlung ausreichend für eine objektive Ansprechen auf die Behandlung. Nach Absetzen der Behandlung, eine Gruppe von Mäusen können auch durch Endoskopie zur Tumorrückfall überwacht werden. </li><li> Euthanize Mäuse durch CO 2 Rausch und sammeln Gewebe für biochemische und / oder histologische Analyse des Dickdarms und Tumore in Woche 45, oder nach 4 Wochen der Therapie. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 5. Endoskopische Untersuchungen <ol><li> Die Endoskopiegeräte sollten nach Standardverfahren 16 zusammengebaut werden. </li><li> Sterilisieren und Reinigen der Endoskopsonde mit 70% Ethanol oder einem antibakteriellen Gleitmittel. </li><li> Videos können mit einem Laptop oder Desktop-Computer und Standard-Media-Software, wie iMovie aufgezeichnet werden. Ein Standard-Computer-Monitor, anstatt ein Monitor medizinischer Qualität, ist ausreichend, um den Darm während der Endoskopieverfahren (Figur 4) zu visualisieren. </li><li> Anesthetize Gruppen von 5-6 Mäusen gleichzeitig in einer Kammer mit 3% Isofluran in 100% O 2 bei einer Rate von 0,2-0,4 l / min. Nachdem die Mäuse anästhesiert, die vom Zehenklemm bestätigt wird; die Isofluran Ebenen sollten auf 0,5-2% für die Wartung geändert werden. </li><li> Entfernen Sie eine individuelle Maus aus der Kammer, und legen Sie sie Bauchseite nach oben mit dem Kopf in einem Nasenkegel gesichert. Vollnarkose sollte überwacht werden, und die Hinterbeine sollte so eingestellt werden, dass sie shinter der Maus tretched. </li><li> Legen Sie einen Tierarzt Salbe auf die Augen der Mäuse bis zur Trockenheit zu verhindern. </li><li> Halten Sie den Schwanz der Maus, wo es die untere Wirbelsäule trifft zu zeigen deutlich den Anus. Legen Sie die starren Endoskophülle in ein Becherglas mit Wasser und stellen Sie den Luftstrom um die Freilassung einer kleinen Luftblase in einer Zeit zu ermöglichen. </li><li> Der Luftstrom wird der Doppelpunkt erlauben, sich aufzublasen. Wenn der Luftstrom zu stark ist, wird Luft in den Magen der Maus gepumpt werden. Keine zusätzliche Schmierung erforderlich. </li><li> Die starre Endoskophülle in den Mastdarm vorsichtig. Im allgemeinen kann das Endoskop bis zu 3 cm, an welchem ​​Punkt der Doppelpunkt in Mäusen Kurven und nicht zugänglich ist starren Endoskops eingeführt werden kann. </li><li> Eine häufige Schwierigkeit während der Endoskopie Verfahren ist Sperrung des Zugangs zu dem Lumen des Kolons durch Fäkalien. Vermeiden Sie dies, indem sanft massiert dem Bauch der Mäuse vor dem Eingriff, um Stuhlgang zu fördern, oder vorsichtig manövrieren des Endoskops um die Fecal Sache während des Verfahrens. Peristaltik kann auch auftreten, während der das Endoskop sollte in Position gehalten werden, bis das Colon Muskulatur relaxiert. </li><li> Initiieren Videoaufzeichnung in jedem Stadium des Endoskopieverfahren. Disease Scoring können von einem erfahrenen Assistenten während des Verfahrens aufgezeichnet werden, oder zu einem späteren Zeitpunkt aus den Videodateien. </li><li> Nach der endoskopischen Untersuchung, geben die Mäuse in ihren Käfig und während der Erholung aus der Narkose zu überwachen. Tiere sind in der Regel wach und mobil innerhalb von 2 Minuten nach der Entnahme aus dem Isofluran verabreicht Nasenkegel. </li><li> Stellen Sie sicher, dass diese Verfahren werden von einem erfahrenen Wissenschaftler durchgeführt. Jedes Endoskopie Verfahren dauert etwa 2 Minuten pro Maus zu nehmen. </li></ol> 6. Krankheits Scoring <ol><li> Um ulcerosa überwachen, Score Videos zur Murine Endoskopische Index von Colitis Severity (MEICS) 16, die Veränderungen in der (i) dokumentiert die Dicke der Darmwand durch Transparenz gekennzeichnet, (Ii) Stuhlkonsistenz, (iii) Blutgefäß Integrität und Präsenz, (iv) Geschwüre und Bereiche der Regeneration, die in ein kompakter Form zu präsentieren, (v) Blutungen durch Fibrinablagerungen (5a) angezeigt. </li><li> Um Tumorlast zu überwachen, Score Videos für Tumorinzidenz und Größe. Die Tumorgröße wird durch den Durchmesser der Darmlumen durch den Tumor 16 (Figur 5b) besetzt bestimmt. Es ist üblich, beide ulcerosa und Tumor-Scoring-Parameter für eine einzelne Maus. Mit Endoskopie, einzelne Tumoren und die Gesundheit der Darmschleimhaut kann über längere Zeit beobachtet werden, was ein Auslesen für den Erfolg neuer Therapeutika bei einem Tier. </li><li> (Optional) Standbilder können von den Videos zur Erzeugung von repräsentativen Zahlen (Abbildung 6) extrahiert werden. </li></ol>

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T., Merlin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sodium+sulfate+inhibits+the+activities+of+both+polymerase+and+reverse+transcriptase:+lithium+chloride+purification,+a+rapid+and+efficient+technique+to+purify+RNA.">Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA.</a> BMC Res Notes. 6, 350 (2013).</li><li>Kerr, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sodium+sulfate+inhibition+of+real-time+polymerase+chain+reaction+amplification:+a+poly-A+purification+solution.">Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution.</a> Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die drei Protokolle, die beschriebenen Gliederung Methoden der zuverlässigen und reproduzierbaren Induktion von Dickdarmerkrankung Pathologie in Mäusen. Wenn mit routinemäßigen endoskopischen Überwachung und die Interventionsstrategien hier skizzierten kombiniert, werden diese Protokolle bieten leistungsstarke präklinischen Einblick in die Wirksamkeit von Therapeutika. Unsere Labors routinemäßig alle diese Protokolle, um den Erfolg neuer Therapeutika 10,23,24 überwachen. Es gibt eine Reihe von Überlegungen bei der Auswahl eines vorklinischen Tiermodell, um neue Therapeutika zu testen. Dazu zählen Relevanz des Modells auf die menschliche Krankheit, und der Beitrag der Tumor-Mikroumgebung auf die vorgeschlagene Maßnahme des therapeutischen Ziels. Hier bieten wir Ihnen drei Protokolle für die therapeutische Intervention in etablierten Darmkrankheitsmodellen. Diese Modelle sind reproduzierbar und die Lieferung von Reagenzien für Krankheiten induzieren einfach zu verwalten. Wichtig ist, dass die Modelle von großer Bedeutungmehrere Facetten und Phasen der Colitis Beginn, und der Tumor Initiierung und Progression. Forscher sollen, ist das genetische Hintergrund der Mausstämme verwendet bei der Konstruktion Experimente wie die Anfälligkeit für Krankheiten von DSS und / oder AOM induzierte kann beträchtlich variieren 25 erfolgen. Zusätzlich können verschiedene Mikrobengemeinschaften haben unterschiedliche Stoffwechselleistungen im Zusammenhang mit der AOM, die durch Bakterien metabolisiert wird. Wir warnen davor, verschiedenen Kohorten von Mäusen, die in verschiedene Tierhaltung (einschließlich kommerzielle Anbieter) in einem einzigen Experiment geboren wurden. Ähnlich kann die verschiedenen Mikroflora in Mäuse von verschiedenen Einrichtungen verwendet hervorrufen anderen Host antwortet DSS-induzierte Epithelbarriere Schaden 11. Darüber hinaus sollte die geeignete Analyse der Gewebe (zum Beispiel RNA-Reinigung) ebenfalls berücksichtigt werden, da die Fähigkeit DSS reverse Transkriptase werden in den Folge molekulare Analyse 26,27 auswirken hemmen. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Maus Endoskopie ist eine Schneide-Technik zu Beginn der Erkrankung und Progression in einer individuellen Maus wiederholt zu überwachen. Die Möglichkeit, Videos aufzunehmen und zu extrahieren Standbilder ermöglicht eine einfache Überwachung mehrerer Krankheitsparameter und Tumoren. Neben der Verbesserung des Tierschutzes, reduziert endoskopische Überwachung auch die Notwendigkeit für mehrere Kohorten von Versuchsmäusen, die traditionell wurden zu verschiedenen Zeitpunkten getötet, um den Krankheitsverlauf zu verfolgen. Die MEICS Punktesystem ist kein Ersatz für eine histopathologische Analyse, sondern bietet ein alternatives Mittel für die Tiergesundheit und die Schädigung der Schleimhaut in lebenden Mäusen zu überwachen. Maus-Endoskopie ist eine spezialisierte Labortechnik, und alle Verfahren sollten von geschultem Personal durchgeführt, um geeignete Manipulation und Handhabung der Mäuse zu gewährleisten, sowie gleichbleibende Qualität in der für Krankheit Scoring verwendeten Bilder zur Verfügung zu stellen. In den Händen von qualifiziertem Personal, wir haben festgestellt, dass die Endoskopie induziert keine oder nur geringe Schäden an der tumors, die intratumorale Blutungen verursachen würde. Für die therapeutische Protokolle ausgeführt, betrachten wir Endoskopie sehr vorteilhaft, da sie einen Weg, um den anfänglichen Tumorlast zu bestimmen, und erlaubt uns, Gruppe Kohorten von Tieren mit ähnlichen Tumorbelastungen vor der Verabreichung eines therapeutischen Medikaments. Sequential Überwachung der Mäuse ermöglicht es Forschern, um die Wirksamkeit neuer Therapien frühzeitig festzustellen, mit der Möglichkeit der Beendigung erfolglosen Versuchen in einer angemessenen Zeitspanne. Als unser Verständnis von entzündlichen Darmerkrankungen und Darmkrebs Voraus, neue Ziele für die Therapie zu identifizieren. Geeigneten Tiermodellen wird ein integraler Bestandteil dafür, dass die vielversprechendsten neuen Therapien zur klinischen Studien bewegt werden.

Das kolorektale Karzinom (CRC) ist die 4. häufigste Ursache von malignen Erkrankungen weltweit 1. Trotz der erheblichen Fortschritte in unserem Verständnis der familiären Basis dieser Krankheiten dienen, trägt genetische Veranlagung nur ~ 20% der Fälle 2 CRC. Der Rest sind zahlreichen extrinsische und Umgebungsfaktoren, einschließlich chronische Entzündung zurückzuführen. Beim Menschen ist die Verbindung zwischen einer chronischen Entzündung und Darmkrebs evident bei Colitis ulcerosa (UC) der Patienten, die ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von Colitis assoziierte Darmkrebs (CAC) aufweisen, abhängig von der Dauer, des Ausmaßes und der Schwere der entzündlichen Erkrankung 3 -5. Dementsprechend sind neue Therapien in Entwicklung, um die Immunantwort und das zugehörige Herstellungs von Wachstumsfaktoren durch die entzündliche Tumor-Mikro 6-8 steuern. Es besteht ein zunehmender Bedarf an geeigneten präklinischen Tiermodellen, um die therapeutische Wirksamkeit zu charakterisierendiese Medikamente gegen die Entwicklung und das Fortschreiten der Krankheit. Mausmodelle haben eindeutig gezeigt, dass der Entzündungsmikro trägt zur CRC Progression, auch in Abwesenheit von offener Entzündung 9,10. Diese Modelle umfassen die Verwendung des Polysaccharid Dextransulfat-Natrium (DSS), in das Trinkwasser der Mäuse bereitgestellt, epitheliale Verletzungen und akuten und chronischen entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) 11,12 modellieren. Obwohl der Mechanismus, durch den DSS induziert Schleimhautschädigung und Colitis ist nicht vollständig verstanden, legen einige Studien nahe, dass DSS hemmt Zell reverse Transkriptase und Ribonuclease-Aktivitäten in den Zellen, oder die Bildung von Nano-Lipid-Komplexe, die mit der Kolon-Membran führt zu Schäden epithelialen verschmelzen 13,14. Änderungen an der Standard-DSS-Modell wurden auch wichtige Einblicke in die vorgesehenen Mechanismen, durch die Kolonepithelzellen halten Gewebshomöostase und OrdnungsmäßigkeitEnde Schleimhautimmunreaktion 15. Intraperitoneale Verabreichung von Azoxymethan (AOM) allein oder in Kombination mit DSS, ein Modell für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen somatische Mutationen in der epithelialen Schleimhaut und der inflammatorischen und stromale Mikroumgebung 16,17. AOM ist ein Metabolit des Karzinogen 1,2-Dimethylhydrazin (DMH), die nicht direkt in DNA-Mutationen führen. Stattdessen ist AOM hydrolysiert durch das Cytochrom-Isoform CYP2E1 in die Leber, wo MAM wird mit Glukuronsäure konjugiert und dann an den Darm durch Gallensekreten 18 transportiert methylazoxymethanol (MAM). Es wird vermutet, dass die bakterielle β-Glucuronidase trägt zum Abbau von MAM was zu DNA-Alkylierung und die Akkumulation von Mutationen in Epithelzellen 19. Meist AOM-induzierten Kolontumoren beherbergen Missense-Mutationen im Gen für β-Catenin, wodurch das Protein resistent gegen proteasomalen degradatiauf, die aberrante Aktivierung des Wnt-Signalwegs 20 zur Folge hat. Wenn die Aktivität des AOM ist mit der Schleimhautschädigung durch DSS ausgelöst kombiniert, die darauf folgende Wundheilungsreaktion erzeugt eine Mikroumgebung, die für das Wachstum und die Expansion der mutagenisierten Epithel ist. In einer Variation dieses Modells können wiederholte Gabe AOM allein über einen Zeitraum von mehreren Wochen modelliert werden sporadischen kolorektalen Krebs, in der Abwesenheit von DSS-induzierten Colitis 10,17. Diese beiden Modelle bieten kostenlose experimentellen Einstellungen CAC und sporadischen CRC bzw. studieren, die beide mit einem pro-inflammatorischen Tumor-Mikroumgebung 10 assoziiert. Die Verwendung von Serien Endoskopie bei Mäusen wurde von Becker und Kollegen 21 Pionierarbeit und ermöglicht Längs Überwachung von Colitis und Tumorprogression. Hier bieten wir Ihnen drei präklinischen Protokolle basierend auf DSS-induzierte Schädigung der Schleimhaut und / oder AOM-vermittelte tumor Induktion reproduzierbar induziert spezifische Darmerkrankungen. Das erste Protokoll beschreibt induziert akute Schädigung der Schleimhaut in Reaktion auf DSS Verwaltung, viele der histopathologischen Merkmalen mit CED assoziiert zu entlocken. Das zweite Protokoll wird an drei aufeinanderfolgenden Zyklen von DSS Verwaltung basierend auf die Fackeln Entzündungs ​​üblicherweise in IBD-Patienten beobachtet imitieren und kann in Verbindung mit AOM-induzierten Mutationen durchgeführt werden. Die endgültige Protokoll basiert auf AOM-induzierten epithelialen sporadische Mutationen basiert. Für jedes dieser Protokolle, die wir auf die entsprechenden Standardverfahren zu erweitern, um prophylaktische und therapeutische Interventionsmethoden, die wir entwickelt haben, um die Wirksamkeit von neuen Arzneimitteln zu überwachen sind.

<table><tbody><tr><td>Dextran sulfate sodium (MW 36,000-50,000)</td><td>MP Biochemicals</td><td>160110</td><td>Requires batch testing.</td></tr><tr><td>Azoxymethane</td><td>Sigma</td><td>A5486-100MG</td><td>Requires batch testing.</td></tr><tr><td>Vanilla protein shake</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Available from hospital pharmacies.</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>PPC</td><td>M60303</td><td>This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key.</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Standard lab reagent.</td></tr><tr><td>Coloview miniendoscopic system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endovision Tricam</td><td>Karl Storz</td><td>20212001-020</td><td></td></tr><tr><td>Xenon 175 light source with anti-fog pump</td><td>Karl Storz</td><td>20134001</td><td></td></tr><tr><td>HOPKINS straight Forward Telescope</td><td>Karl Storz</td><td>64301AA</td><td></td></tr><tr><td>Endoscopic sheath (total diameter 3 mm)</td><td>Kalr Stroz</td><td>61029C</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optic light cable</td><td>Kalr Stroz</td><td>69495ND</td><td></td></tr><tr><td>Computer and media player software</td><td>Apple</td><td></td><td>iMovie</td></tr><tr><td>Scale</td><td>Any</td><td></td><td>Any scale suitable for weighing mice.</td></tr></tbody></table>

non-invasive assessment of the efficacy of new therapeutics for intestinal pathologies using serial endoscopic imaging of live mice

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

Gewichtsverlust wird als Standard-Parameter verwendet werden, um für die Krankheit mit Colitis, die routinemäßig verwendet wird, um die allgemeine Gesundheit der Mäuse Monitor verbunden überwachen. Tiere in der Regel ihr Gewicht zu halten, während DSS haltiges Wasser verabreicht wird und nur Gewicht verlieren beginnen, wenn sie in den normalen Trinkwasser zurück. Akzeptabel Gewichtsverlust Parameter sollten gemäß dem Tierethikkommission der Institution etabliert werden. Um die Dehydrierung bei längerem Durchfall zu vermeiden, sollte die routinemäßige Bestimmung der Maische (Futterpellets püriert und mit Trinkwasser) mit einem Protein-Shake zusätzlich zu den normalen Trinkwasser ergänzt. Als Alternative Anästhesie Ketamin / Xylazin oder ähnliche Mittel verwendet werden können, ist, wenn Isofluran Ausrüstung nicht verfügbar ist. Durch die starre Beschaffenheit des Endoskops nur diese Vorgehensweise ermöglicht eine Visualisierung der distalste 3 cm des Mausdickdarm. Neuere Endoskope mit<html> zusätzliche Funktionen (einschließlich Flexibilität und Fluoreszenz) sind je nach den Bedürfnissen des Experiments. Da jedoch die nachteiligen Wirkungen von DSS sind überwiegend dem distalen Colon von Mäusen, mit in der Mitte Kolon beobachtet milder Pathologie beschränkt, das starre Endoskop nicht Überwachung der Schleimhaut Gesundheit der einzelnen Mäusen hemmen. Obwohl wir ein Protokoll für die prophylaktische Behandlung von akuten DSS-induzierter Kolitis zu beschreiben, kann dieses Protokoll einfach geändert werden, um Interventionen Behandlungsstrategien zu testen. Die Wirksamkeit eines Medikaments zur Epithelschädigung und Colitis lindern kann in Längsrichtung in einzelne Mäuse beobachtet und auf Basis der beschriebenen Scoring Parameter (Abbildung 5) quantifiziert werden. Dies ist gegenüber herkömmlichen experimentellen Designs, das Culling von Mäusen zu bestimmten Zeitpunkten während des Versuchsprotokoll erfordern, vorteilhaft und ermöglicht nicht die Charakterisierung der Erkrankung als Antwort auf eine Behandlung mit der Zeit. <html> t &quot;&gt; Klinische Studien am Menschen haben eine beträchtliche Variabilität in verschiedenen Tumoren wie bei einem individuellen Patienten auf Behandlungen ansprechen hervorgehoben. Die Verfahren, die hier beschrieben werden, sind ein Mittel, um die Gesamttumorlast sowie das Ansprechen auf die Behandlung einzelner Tumorverlauf zu überwachen eines Experiments. Es ist wichtig zu beachten, dass die Interventions Protokolle, die für die Krebsmodellen umrissen sind, nicht berücksichtigt die Effekte einer Therapie auf Tumorinitiation zu nehmen. Die prophylaktische Protokolle, mit der Behandlung vorgesehen vor, wenn die Tumore endoskopisch sichtbar werden, sind erforderlich, um diese Informationen zu erhalten. Die hier beschriebenen Protokolle liefern Informationen über die therapeutische Wirkung auf die auf das Fortschreiten (gemessen durch die Tumorgröße) der einzelnen Tumoren. Tumorregression kann auch durch eine Reduzierung der Anzahl der sichtbaren Tumore anzugeben. g &quot;/&gt; Abb. 1: Die Überwachung der Wirksamkeit einer prophylaktischen Behandlung Therapie in einem Modell der akuten Darmschäden Das experimentelle Protokoll (a) erfordert 8 Tage von Anfang bis Ende. Therapeutics werden von Tag 1 für prophylaktische Behandlungen verabreicht (b). DSS im Trinkwasser (c) von Tag 3 des Versuchsprotokoll bereitgestellt. Endoskopie durchgeführt wird (d), um das Fortschreiten der Krankheit bei den Tieren zu überwachen. Empfohlener Zeitpunkten umfassen Tag 0 (unbehandelt) und Tag 2 (Health Monitoring), Tag 5 und 8 (zu Krankheitslast bestimmen). Das Experiment wird beendet (e) am Morgen des 8. Tag: In einer Wildtyp-Maus (f) das Fortschreiten der Krankheit mit der Zeit zunimmt. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: Überwachung der Wirksamkeit der Intervention Therapie in einem Modell of ulcerosa-assoziierten Krebs. Das experimentelle Protokoll (a) ist 72 Tage vom Beginn bis zum Abschluss. Therapeutics (b) an Mäuse mit etablierten Tumoren von Tag 46 für eine Intervention Behandlungen verabreicht. AOM (c) wird am Tag 1 injiziert, und DSS im Trinkwasser über einen Zeitraum von drei Zyklen des experimentellen Protokolls bereitgestellt, beginnend am 8. Tag Endoskopie (d) durchgeführt wird, um das Fortschreiten der Krankheit bei den Tieren zu überwachen. Empfohlener Zeitpunkten umfassen Tag 0 (unbehandelt), Tag 20 (Gesundheitsüberwachung) und Tag 40 (nach Gruppen Tiere nach Tumorlast). Endoskopie wird wöchentlich im Laufe der therapeutischen Behandlung durchgeführt, um Krankheitsverläufe zu überwachen. Das Experiment (e) am Morgen des 72. Tag beendet In einer Wildtyp-Maus (f) Tumorbelastung steigt von Tag 40 ab. <img alt="Figur 3"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.383 / 52383fig3highres.jpg&quot; /&gt; Abb. 3: Die Überwachung der Wirksamkeit der Intervention Therapie in einem Modell der spontanen Darmkrebs Das experimentelle Protokoll (a) benötigt&gt; 50 Wochen von Anfang bis Ende. Therapeutics (b) an Mäuse mit etablierten Tumoren Interventions Behandlungen verabreicht. AOM (c) wird am Tag 1 über den Verlauf der experimentellen Protokoll injiziert und danach wöchentlich für 6 aufeinanderfolgenden Einspritzungen. Endoskopie (d) durchgeführt wird, um das Fortschreiten der Krankheit bei den Tieren zu überwachen. Empfohlener Zeitpunkten umfassen Tag 0 (unbehandelt) und Woche 8 (Tumorüberwachung) und alle zwei Wochen gibt es nach (auf Tumorlast zu schaffen). Endoskopie wird wöchentlich im Laufe der Behandlung, um therapeutische Ergebnisse zu überwachen geführt. Das Experiment (e) in Woche 50 beendet in einer Wildtyp-Maus (f) Tumorbelastung steigt von Woche 40 ab. </<html> p&gt; <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig4highres.jpg" width="650" /> Abb. 4: Geräteaufbau Der Versuchsaufbau (a) für das endoskopische Gerät, mit einzelnen Geräte angezeigt. Das starre Endoskop (b), wobei die einzelnen Bestandteile angegeben. Balken = 2,5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52383/52383fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig5highres.jpg" width="650" /> Abb. 5: Scoring Krankheitsparameter durch Endoskopie ist eine Grundriss (a) des Murine Endoskopische Index von Colitis Severity (MEICS). Ein Überblick (b) der einzelnen Tumor Scoring-Parameter.es / ftp_upload / 52.383 / 52383fig5highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig6highres.jpg" width="650" /> Abbildung 6: Vertreter therapeutischen Behandlungen Vertreter Gewichtsverlust, endoskopische Bilder und Spielstände für:. (A) Akute DSS-induzierten Schäden der Schleimhaut (b) Tumoren, die im Anschluss an die AOM / DSS-Protokoll entwickelt, (c) Tumoren, die im Anschluss an die sequentielle entwickelt.. AOM-Protokoll. N = 3 Mäuse pro Gruppe. * P &lt;0,05, *** p &lt;0,001 (Student-T-Test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52383/52383fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

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Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Nicht-invasive Beurteilung der Wirksamkeit neuer Therapeutika für Darmpathologien Verwenden der seriellen endoskopische Bildgebung von lebenden Mäusen

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

non-invasive-assessment-efficacy-new-therapeutics-for-intestinal

Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K Aufrufe.  The Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research. We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Serie: Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell proliferation and increased nutrient absorption, are critical in recovery, yet poorly understood. Understanding the molecular mechanism behind the adaptive responses is crucial to facilitate the identification of nutrients or drugs to enhance adaptation. Different approaches and models have been described throughout the literature, but a detailed descriptive way to essentially perform the procedures is needed to obtain reproducible data. Here, we describe a method to estimate important endpoints and proliferative markers of small intestinal injury and compensatory hyperproliferation using a model of chemotherapy-induced mucositis in mice. We demonstrate the detection of proliferating cells using a cell cycle specific marker, as well as using small intestinal weight, crypt depth, and villus height as endpoints. Some of the critical steps within the described method are the removal and weighing of the small intestine and the rather complex software system suggested for the measurement of this technique. These methods have the advantages that they are not time-consuming, and that they are cost-effective and easy to carry out and measure.

Here, we present a protocol to establish important endpoints and proliferative markers of small intestinal injury and compensatory hyperproliferation using a model of chemotherapy-induced mucositis. We demonstrate the detection of proliferating cells using a cell cycle specific marker and using small intestinal weight, crypt depth, and villus height as endpoints.

Wichtige Endpunkte und proliferative Marker zur Beurteilung von kleinen Darmverletzungen und Anpassung mit einem Mausmodell der Chemotherapie-induzierten Mukositis

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Forschung

Krebsforschung

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the complex cellular and molecular of intestinal pathology. Although the tunica mucosa is often the organ of interest in many inflammatory diseases, recent works demonstrated that the muscularis externa (ME) is also a highly immunocompetent organ that harbours a dense network of resident immunocytes.1,2 These works were performed within the standardized model of intestinal manipulation (IM) that leads to inflammation of the bowel wall, mainly limited to the ME. Clinically this inflammation leads to prolonged intestinal dysmotility, known as postoperative ileus (POI) which is a frequent and unavoidable complication after abdominal surgery.3 The inflammation is characterized by liberation of proinflammatory mediators such as IL-64 or IL-1&beta; or inhibitory neurotransmitters like nitric oxide (NO).5 Subsequently, tremendous numbers of immunocytes extravasate into the ME, dominated by polymorphonuclear neutrophils (PMN) and monocytes and finally maintain POI.2 Lasting for days, this intestinal paralysis leads to an increased risk of aspiration, bacterial translocation and infectious complications up to sepsis and multi organ failure and causes a high economic burden.6
In this manuscript we demonstrate the standardized model of IM and in vivo assessment of gastrointestinal transit (GIT) and colonic transit. Furthermore we demonstrate a method for separation of the ME from the tunica mucosa followed by immunological analysis, which is crucial to distinguish between the inflammatory responses in these both highly immunoactive bowel wall compartments. All analyses are easily transferable to any other research models, affecting gastrointestinal function.

Postoperative ileus (POI) is a complication of abdominal surgery leading to increased morbidity and a prolonged hospital stay. Because prophylactic or therapeutic strategies are lacking intensified research is necessary. Therefore we established a standardized and feasible mouse model to investigate the pathophysiology of POI and to study potential therapeutic options.

Functional Assessment of Darmmotilität und Darmwand Entzündung in Nagetiere: Analysen in einem standardisierten Modell der intestinalen Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Medizin

Flexible Colonoscopy in Mice to Evaluate the Severity of Colitis and Colorectal Tumors Using a Validated Endoscopic Scoring System

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental endoscopy has been highly useful for studies that require repeated assessments in a single laboratory animal, such as those evaluating mechanisms of chronic inflammatory bowel disease and the progression of colorectal cancer. However, the methods used across studies are highly variable. At least three endoscopic scoring systems have been published for murine colitis and published protocols for the assessment of colorectal tumors fail to address the presence of concomitant colonic inflammation. This study develops and validates a reproducible endoscopic scoring system that integrates evaluation of both inflammation and tumors simultaneously. This novel scoring system has three major components: 1) assessment of the extent and severity of colorectal inflammation (based on perianal findings, transparency of the wall, mucosal bleeding, and focal lesions), 2) quantitative recording of tumor lesions (grid map and bar graph), and 3) numerical sorting of clinical cases by their pathological and research relevance based on decimal units with assigned categories of observed lesions and endoscopic complications (decimal identifiers). The video and manuscript presented herein were prepared, following IACUC-approved protocols, to allow investigators to score their own experimental mice using a well-validated and highly reproducible endoscopic methodology, with the system option to differentiate distal from proximal endoscopic colitis (D-PECS).

Over the past few years, new generation endoscopes have emerged as important diagnostic research aids for evaluating murine colitis and colorectal tumors. We present herein a detailed protocol for endoscopic assessment of inflammation and colorectal tumors in mice, as well as a novel scoring system that uses decimal identifiers to document the endoscopic severity of colitis and colorectal tumors.

Flexible Koloskopie in der Maus, um die Schwere der Colitis und kolorektalen Tumoren auswerten mit einem validierten Endoskopische Scoring System

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Immunologie und Infektion

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murine Endoskopie für<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodale Bildgebung der Krebsentstehung und Bewertung der Darm Wundheilung und Entzündung

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Neurowissenschaften

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT) face and is frequently associated with a poor clinical outcome. While, for instance, GvHD manifestations of the skin are usually responsive to established immune-suppressive therapies and are, hence, not taking a fatal course, the presence and the intensity of intestinal GvHD, especially of the mid-to-lower parts of the gut, strongly influence the outcome and overall survival of patients with acute GvHD. Therapeutic options are essentially limited to the classic immune-suppressive agents yielding only moderate disease-mitigating effects. Hence, detailed knowledge about the tissue-resident immune cascade, changes in the intestinal microbiota, and the stromal response prior, upon, and after intestinal GvHD onset are urgently needed to understand the events and mechanisms underlying its pathogenesis and to develop innovative therapeutic options. Murine models of GvHD are frequently employed to identify and functionally assess molecules and pathways putatively driving intestinal GvHD. However, means to specifically monitor and evaluate intestinal inflammation over time are essentially lacking since established scores to assess and grade acute GvHD are routinely comprised of various parameters which rather reflect&#160;systemic GvHD manifestations. The detailed evaluation of intestinal GvHD has been restricted to studies using euthanized mice, thereby essentially excluding longitudinal (i.e., kinetic) analyses of the colonic compartment under a given experimental condition (e.g., antibody-mediated blockade of a proinflammatory cytokine) in live mice (i.e., in vivo). The mini-endoscopic in situ assessment of the distal colon of allo-HCT-treated mice described here allows a) a detailed macroscopic evaluation of different aspects of intestinal inflammation and b) the option to collect tissue samples for downstream analyses at various time points over the course of the observation period. Overall, the mini-endoscopic approach provides a major advance in preclinical noninvasive monitoring and assessment of intestinal GvHD.

Here, we present a protocol that describes allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and allows repetitive mini-endoscopic evaluations of the distal colon in situ for the presence, characteristics, and severity of colonic inflammation within live mice suffering from intestinal graft-versus-host disease.

Induktion der intestinalen Graft - Versus - Host-Seuche und seiner Mini-endoskopische Beurteilung in Live Mäuse

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

Intravitale Bildgebung von intraepitheliale Lymphozyten im murinen Dünndarm

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. Therefore, the intestinal mucosa of anesthetized mice is topically stained with unspecific staining (acriflavine) and a fluorescent tracer (rhodamine-B dextran), mounted on a saline solution-rinsed plate and directly imaged using a confocal microscope. This technique can complement other non-invasive techniques to identify leakage of intestinal permeability, such as transmucosal passage of orally administered tracers. Besides this, the approach presented here allows the direct observation of cell shedding events at real-time. In combination with appropriate fluorescent reporter mice, this approach is suitable for shedding light into cellular and molecular mechanisms controlling intestinal epithelial cell extrusion, as well as to other biological processes. In the last decades, interesting studies using intravital microscopy have contributed to knowledge on endothelial permeability, immune cell gut homing, immune-epithelial communication and invasion of luminal components, among others. Together, the protocol presented here would not only help increase the understanding of mechanisms controlling epithelial cell extrusion, but could also be the basis for the developmental of other approaches to be used as instruments to visualize other highly dynamic cellular process, even in other tissues. Among technical limitations, optical properties of the specific tissue, as well as the selected imaging technology and microscope configuration, would in turn, determine the imaging working distance, and resolution of acquired images.

Taking advantage of intravital microscopy, the method presented here enables real-time visualization of intestinal epithelial cell shedding in living animals. Therefore, topically stained intestinal mucosa (acriflavine and rhodamineB-dextran) of anesthetized mice is imaged up to single-cell resolution using confocal microscopy.

Ein intravitaler, auf Mikroskopie basierender Ansatz zur Bewertung der Darmdurchlässigkeit und der Epithelzellvergießen-Performance

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

Performing Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice and Evaluating Subsequent Tissue Changes

Understanding the tissue and cellular changes that occur in the acute injury response as well as during the wound healing process is of paramount importance when studying diseases of the gastrointestinal (GI) tract. The murine colonic pinch biopsy model is a useful tool to define these processes. Additionally, the interplay between gut luminal content (e.g., microbes) and the colon can be studied. However, wound induction and the ability to track wound closure over time in a reliable manner can be challenging. Moreover, tissue preparation and orientation must be carried out in a standardized way to optimally interrogate histologic and molecular changes. Here, we present a detailed method describing biopsy-induced injury and the monitoring of wound closure through repeat colonoscopies. An approach is described that ensures consistent and reproducible measurements of wound size, the ability to collect the wound bed for molecular analyses as well as visualize the wound bed upon sectioning of tissues. The ability to successfully carry out these techniques allows for studies of the acute injury response, wound healing and luminal-host interactions within the colon.

Here, we provide a detailed description of the procedure to induce colonoscopic-guided pinch biopsies in mice and track wound closure in real time. Additionally, methods for the preparation of tissues for histological, immunohistochemical and molecular analyses of the wound bed are provided.

Nicht-invasive Beurteilung der Wirksamkeit neuer Therapeutika für Darmpathologien Verwenden der seriellen endoskopische Bildgebung von lebenden Mäusen

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