Wir möchten Ying Yu für Apc Min / + Mäusen Genotypisierung danken. Diese Studie wurde durch Mittel aus INSERM und Zuschüsse (CA057621 und AI053194) von den National Institutes of Health.

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit Verfahren, die von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC), UCSF genehmigt durchgeführt. Alle Abbildungsexperimente waren Nichtlebens Verfahren und die Tiere unmittelbar nach dem Ende der Bildaufnahme getötet. 1. Generierung von Mäusen HINWEIS: APC Min / + Mäusen, die eine Mutation des APC-Gens auf, entwickeln spontan 50-100 Adenomen im Dünndarm. <ol><li> Quer Apc Min / +-Mäusen mit dem ACTB-ECFP Linie, die ECFP unter der Actin-Promotor exprimiert, und ferner mit dem c-fms-EGFP-Linie, die EGFP unter die c-fms-Promotor exprimiert, die myeloiden Zellen zu detektieren. Heterozygote Tiere für ACTB-ECFP und c-fms-EGFP werden verwendet, um Fluoreszenz zu erkennen. </li><li> Verwenden Mäusen bei 3-4 Monate alt sein, um Bild deutlich nachweisbar Adenome. </li></ol> 2. Herstellung von Materialien Vor der Operation HINWEIS: Die Details des Mikroskops Set-up zuvor beschriebenen 6,7 gewesen. <ol><li> Mikroskop <ol><li> Schalten Sie die Heizdecke. Schalten Sie den Argon-Laser für 488 nm-Anregung und der Festkörper 405 nm, 561 nm und 640 nm Laser. Einschalten des Mikroskops, die Spinnplattensteuereinheit, die AOTF, der Lasersteuereinheit und die Kamerasteuerung. </li><li> Öffnen Sie die Verschluss Mikroskop, das die LED rot wird. Schalten Sie den Computer und die Kamera-Software. </li></ol></li><li> Imaging Platform <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Bühne Einsatz sauber ist. Ansonsten sauber mit Wasser und Seife und dann trocknen. </li><li> Nehmen Sie zwei Deckgläser und benutzen Labor Band, um sie auf den Einsatz zu sichern. Platzieren Sie den Einsatz auf der Bühne und reinigen Sie es mit Alkoholtupfer. </li><li> Mit Labor Band, bringen Sie die Heizdecke auf der rechten Seite der Bühne. </li><li> Überprüfen Sie die Integrität der Gummimembran auf der Nase Kegel und ändern Sie es Sie ggf.y. Position und fixieren Sie die Nasenkegel für Isofluran-Narkose Lieferung an das Tier mit Hilfe Gaze und Labor-Band. </li></ol></li><li> Isofluran-Narkose-System <ol><li> Füllen Sie den Tank Isofluran. </li><li> Schalten Sie die Vakuum und passen zu 1,2 L / min. </li><li> Mit destilliertem Wasser auf den Zerstäuber und verbinden Sie den Zerstäuber auf die Isofluran-System. </li><li> Schalten Sie den Sauerstoff-Analysator und verbinden Sie es mit der Isofluran-System. Schalten Sie die Sauerstoffflasche und sicherzustellen, dass die Sauerstoff-Analysator zeigt 100%. Stellen Sie die O 2 Fluss auf 0,2 l / min. </li><li> Schalten Sie den Stickstofftank und den Fluss von 0,8 l / min einzustellen. Stellen Sie sicher, dass die Sauerstoff-Analysator zeigt 21%. </li></ol></li><li> Vorbereitung für Chirurgie Werkzeuge und Plattform <ol><li> Saubere 2 Paar Dissektion Zange und Schere mit Wasser und Seife. </li><li> Schalten Sie die heiße Perle Sterilisator und lassen Sie es erreichen 250 ° C. Sterilisieren Sie die Chirurgie-Tools für 30 sek. Lassen Sie sie abkühlen. </li><li> Legen Sie ein Labor Soaker auf dem OP-Tisch. </li><li> Verwenden Sie eine Styropor-Deckel als Operationsplattform. Decken mit einem Stück Labor Soaker. Bereiten Sie ein zweites Stück Labor Soaker, um nach der Rasur mit der Maus ändern. </li><li> Legen Sie den Nasenkegel mit der Linie der Anästhesie auf der überdachten Styropordeckel, und befestigen Sie es an der Styropor-Deckel (nicht auf dem Labor Soaker) mit Klebeband und mit zwei Nadeln auf beiden Seiten der Nasenkegel, um es an Ort und Stelle zu halten. </li><li> Montieren Sie betadine, Alkoholtupfer, sterile Gaze, Superkleber, Objektträger, Elektrorasierer, und 4 Stück Labor-Band. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Injektionen <ol><li> Unter der Haube, bereiten eine Insulinspritze (28 G x ½) mit 7 ul Lager AF647-Ly-6G konjugierten (Gr1) Antikörper (1 mg / ml) in 100 ul von 2.000 kDa Rhodamin-Dextran (4 mg / ml ) für retroorbitale Injektions. Retro-orbitale Injektion wird in Apc Min / + Mäusen zu empfehlen, da Anämie, die bei diesen Tieren entwickelt macht die Schwanzvenen difficult, um durch die Haut zu erkennen. </li><li> Vorbereiten einer zweiten Insulinspritze mit 1 mg / kg Atropin subkutan (sc) in 150 ul PBS verdünnt Injektion vor der Bilderzeugung, um die Peristaltik des Darms zu dämpfen. </li></ol> 4. Vorbereitung des Darms für Imaging <ol><li> Überprüfen, ob der Anästhesie Linie der Induktionskammer offen ist, und die Leitungen zu den Operationstisch und Mikroskop geschlossen. </li><li> Übertragen Sie das Tier auf die Anästhesie Kammer. Schließen Sie die Anästhesie Kammer und schalten Sie die Isofluran bis 4% (bei ​​21% O 2). </li><li> Wenn die Maus atmet tief und langsam (nach 5-6 min), dann in der chirurgischen Bühne, auf der Flanke und injizieren Sie die Gr1 Antikörper-Lösung und / oder Dextran-Lösung retro-orbital. </li><li> Öffnen Sie die Anästhesie Linie auf die chirurgische Plattform verknüpft. Schließen Sie die Zeile auf die Anästhesie Kammer und bewegen Sie die Maus auf dem Rücken mit der Nase in der Anästhesie Kegel. </li><li> Reduzieren Sie die IsofluranKonzentration von 4% auf 2,5%. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Maus gut durch Kneifen seine Pfotenballen und Testen der Hornhautreflex betäubt. </li><li> Fügen Augenschmier Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Sichern Sie sich die Gliedmaßen der Maus auf die chirurgische Phase durch Zugabe von Lab-Band. </li><li> Entfernen der Haare von der ventralen Oberfläche unter Verwendung eines elektrischen Rasierers. Auch entfernen die Haare von der linken Hintergliedmaße, um das Oximeter vor Akquisition positionieren. Entfernen Sie die Labor Soaker von der Operations Bühne und ersetzen durch einen sauberen, Haar Kontamination zu vermeiden. </li><li> Desinfizieren Sie die Bauchfläche mit Alkoholtupfer und betadine. </li><li> Injizieren Sie die Lösung Atropin (3,2) sc in eine Flanke der Maus. </li><li> Machen Sie eine 1 cm ventralen Mittellinie Schnitt durch die Haut und das Bauchfell mit einer Schere und einer Pinzette. Ziehen Sie vorsichtig 3-4 cm des Darmes und zur Identifizierung eines oder mehrere Tumoren zu Bild. </li><li> Nehmen Sie ein Glas MICRoscope Schieberposition und eine Schleife des Darms auf sie mit einem Tumor an der Spitze. </li><li> Fügen Sie etwas Sekundenkleber auf wenige Stellen entlang der Darm, um es auf den Objektträger zu befestigen. Warten Sie eine Minute, bis der Kleber trocknen. Verwenden Sie eine Markierung, um eine Linie auf der Folie, die auf den Tumor, um seine Lokalisierung mit dem konfokalen erleichtern ziehen. </li></ol> 5. Positionierung der Maus auf die Bühne, und Vorbereitung auf Image Acquisition <ol><li> Entfernen Labor Band von den Gliedern. </li><li> Öffnen Sie die Anästhesie Leitung an den Mikroskoptisch und schließen Sie die man auf die chirurgische Plattform. </li><li> Übertragen Sie die Maus vorsichtig auf den Mikroskoptisch mit seiner Bauchseite nach unten und die Nase in der Nase Kegel. Sichern Sie die Anästhesie Linie mit einigen Labor-Band. </li><li> Re-Positionierung der Maus und / oder die Folie, um den Darm in der Mitte von einem der Cover-schlüpfte Fenster haben. Sanft kleben die Folie mit Labor-Band. </li><li> Befestigen Sie die Oximetermeßfühler links Schenkel der Mausfolgen ihr Herz und Atemfrequenz und arterielle Sauerstoffsättigung. </li><li> Decken Sie die Maus mit der Heizdecke zu Unterkühlung zu vermeiden. </li><li> Verringern der Isoflurankonzentration von 2,5% auf 1-1,5% für die Bildgebung. </li></ol> 6. Übernahme von Images unter Verwendung von Software μManager <ol><li> Erhöhen CSUX Geschwindigkeit zu 2.500 Umdrehungen pro Minute um die Bildqualität in den Konfigurationseinstellungen zu verbessern. </li><li> Verwenden Sie das Ziel im Dropdown-Menü zu 10X 0,5 NA oder 20X 0,75 NA Fluar Linsenobjektiv zu wählen. </li><li> Wählen Sie den Laser von 405 nm Farbe Dropdown-Menü. </li><li> Klicken Sie auf Live-und stellen Sie den Fokus mit dem Mikroskop. </li><li> Klicken Auto zu maximalen und minimalen Pixelintensitäten des Anzeigebilds auf der Basis der extremen Pixelwerte in dem Bild automatisch einzustellen. Ein Histogramm des Anzeigebildes der Pixel-Intensitäten in dem Diagramm im unteren Teil des Hauptfensters dargestellt. </li><li> Stellen Sie die Kamera die Belichtung im Fenster der Systemsteuerung von PiperÄndern der Anzahl von Takten (ein Takt 33,333 ms). </li><li> Wenn das Signal ist zu hell mit der niedrigsten Exposition zu verringern Laserintensität mit dem Mikroskop Steuereinheit. </li><li> Überprüfen Sie die Signalstärke für 488 nm, 561 nm und 640 nm Laserlinien. Passen Laserintensität mit dem Laser die eigene Steuereinheit (488 nm und 561 nm) oder dem Mikroskop Steuereinheit. </li><li> Im Multi-D Aufnahmefenster, überprüfen Sie die Zeitpunkte Feld und geben in der Anzahl der Zeitpunkte und der gewünschten Zeitintervall. </li><li> Überprüfen Sie die Z-Stapel Fenster wählen &quot;relative Z&quot; definieren und Z-Start Z-End relativ zur aktuellen Position. HINWEIS: 10X oder 20X Ziel, mit Z-Ebenen 3, 8 um oder 4 um jeweils beginnen auseinander. </li><li> Überprüfen Sie die Multiple-Positionen (XY) Feld zur Abbildung mehrere Standorte, klicken Sie dann auf Positionsliste bearbeiten, markieren Sie 4 bis 6 verschiedenen Positionen. </li><li> Überprüfen Sie die Kanäle Box und fügen Kanäle aus und wählen Sie Neue Laser Zeilen aus dem Dropdown-Menü und type Exposition für jeden Kanal (in Vielfachen von 33,333 ms). </li><li> Überprüfen Sie Bilder speichern im Fenster &quot;Multi D Erwerb&quot;. </li><li> Wählen Sie einen Ordner und alle aufgenommenen Bilder werden automatisch in diesem Ordner mit dem Namen Präfix gegeben gespeichert werden. HINWEIS: Jede kontinuierliche Erfassung wird in einem separaten Unterordner als einzelne TIFF-Dateien für jede Z-Schnitt in jeder Farbe zu jedem Zeitpunkt gespeichert werden. </li><li> Speichern Sie alle Einstellungen durch Klicken auf Einstellungen speichern in der Multi D Aufnahmefenster. </li><li> Klicken Sie erwerben in der Multi-dimensionale Aufnahmefenster zum Start der Erfassung. </li><li> Wenn das Oximeter-Sonde nicht verwendet wird oder nicht mehr funktioniert gut (wenn der Impuls nicht stabil ist oder schwer zu erkennen), überprüfen die Effizienz der Anästhesie alle 15 Minuten während des Sicherungsvorgangs durch Kneifen der Fußballen und die Kontrolle der Hornhautreflex. Passen Sie die Narkose, wenn die Maus reagiert auf diese Reize. </li><li> Nach der Übernahme, einschläfern die Maus durch die Erhöhung der Isofluran concentRation bis 5%. Wenn keine Atembewegungen erkennbar sind, entfernen Sie die Maus von der Bühne und führen Sie einen Genickbruch. </li></ol> 7. Analyse der Bilder mithilfe von Software Imaris <ol><li> Konvertierung von Dateien (Ergänzende 1A) .ims <ol><li> Öffnen Sie die Kamera-Software, klicken Sie auf Datei und anschließend Batch Converter. </li><li> Klicken Sie auf Dateien hinzufügen, und wählen Sie die erste Datei von der ersten Position. Wiederholen Sie für jede Position. </li><li> Für jede Datei hochgeladen, klicken Sie auf Einstellungen, und überprüfen Sie, dass die Einstellungen &quot;t&quot; für Time, &quot;c&quot; für die Kanäle und &quot;z&quot; für Z-Stapel werden in dieser Reihenfolge. </li><li> Außer in den gewünschten Ordner. Durchsuchen und erstellen Sie eine neue Datei als umgewandelt. </li><li> Klicken Sie auf Set für alle und starten. </li></ol></li><li> Anpassungen (Ergänzende Abbildung 1B) <ol><li> Gehen Sie in die spezifischen Konvertierte Ordner und öffnen Sie die erste Datei. </li><li> Im Display-Einstellung Fensters die HintergrundSignalabschaltung durch Änderung der Mindestzahl für jeden Kanal, wenn nötig. </li><li> Falls erforderlich, die Signalintensität anpassen, indem Sie die maximale Anzahl (je niedriger die Max Zahl, desto höher die Intensität des Signals). HINWEIS: Anpassungen der Signalintensität / Kontrast ermöglichen den Höhepunkt einer Zellverhalten oder einem Fach, um ein schöneres Visualisierung haben. Es ist nicht das Ergebnis selbst zu ändern. </li><li> Klicken Sie auf Bearbeiten und Image-Eigenschaften. </li><li> Ändern der x, y und z-Werte (für einen 10X-Objektiv, x und y = 0,712, z = 8 um, für eine 20x-Objektiv: x und y = 0,36, z = 4 um). </li><li> Klicken Sie auf Alle Equidistant zu Zeitpunkten anzupassen. Fügen Sie das Startdatum und die Startzeit der Akquisition. Fügen Sie das Enddatum und die Endzeit der Akquisition (Ergänzende 1C). </li><li> Klicken Sie auf Play-Taste, um den Film zu sehen. </li><li> Klicken Sie auf Bearbeiten und Löschen Zeitpunkten, um unscharfe Bilder zu löschen. </li><li> Zwei separate Akquisitionen toge beitretenther zu einem Film, gehen Sie zum letzten Zeitpunkt des ersten Films und klicken Sie auf Bearbeiten&gt; In Zeitpunkten, um die zweite Datei hinzufügen. </li></ol></li><li> Speichern als Film (Ergänzende 1D) <ol><li> Klicken Sie auf Aufnahme, wählen Sie die MOV-Erweiterung und ein Kompressionsfaktor von 0. </li><li> Klicken Sie auf Speichern. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In diesem Beitrag wird ein detailliertes Protokoll für die drehende Scheibe konfokale Bildgebung von myeloiden Zelldynamik im Darmtumoren für mehrere Stunden in einem lebenden Tier, von der Serosa-Seite des Darm abgebildet beschrieben. Um Entzündungen zu verhindern und eine optimale physiologische Bedingungen, Bildgebung des Darms hat auf die intakte Organ erfolgen. Allerdings ist aus der Abbildungs ​​Serosaseite Darm herausfordernd, da das Licht durch verschiedene Gewebeschichten, wi...

Überwältigenden Beweis zeigt nun, daß der Tumor-Mikroumgebung, die aus heterogenen Zellpopulationen, einschließlich Fibroblasten, Endothelzellen, Immun-und Entzündungszellen, extrazelluläre Matrix und lösliche Faktoren spielt eine entscheidende Rolle bei der Initiierung und Progression von soliden Tumoren, indem sie zu fast Kennzeichen von Krebs 1. Tatsächlich, während der Tumorprogression gibt es konstante dynamische Wechselwirkungen zwischen transformierten Krebszellen und Stromazellen, die eine Mikro günstig Malignität 2 erzeugen entwickeln. Zu den Immunzellen, die das Tumor-Mikroumgebung zu infiltrieren sind myeloischen Zellen die am häufigsten vorkommende 3. Bestehend aus Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM), myeloische abgeleitete Suppressorzellen (MDSC), dendritische Zellen (DC) und Neutrophilen (PMN), werden Knochenmarkzellen aus Knochenmark gewonnen und fortschreitend zu infiltrieren Tumoren, Freisetzung von Zytokinen, Wachstumsfaktoren und Proteasen, fördern könnenTumorwachstum und zu verbreiten 4. Das Übersprechen zwischen den Krebszellen und myeloischen Zellen ist komplex, sondern dynamisch. Somit ist das Verständnis der Natur der Wechselwirkungen entscheidend für die Bestimmung, warum diese Zellen fördern Krebsentwicklung statt, die an einer Anti-Tumor-Immunantwort, und kann dazu beitragen, neue Ziele zu kontrollieren finden. Direkte Beobachtung durch Intravitalmikroskopie liefert Informationen über Zelldynamik in den Geweben von lebenden Mäusen 5. Ein Vierfarben-, Mehrbereich, Mikrolinsen-Spinnplatte konfokales System wurde entwickelt, um Stromazellen in Brusttumoren 6 zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht die langfristige, kontinuierliche Bildgebung und umfasst mehrere Vorteile, wie (a) schnelle Bilderfassung, um Bewegungsartefakte zu minimieren, (b) langfristige Anästhesie, (c) vier Farberfassung auf verschiedenen Zelltypen zu folgen, (d) Fluoreszenzmarkierung verschiedener Tumorkomponenten, und (e) Beobachtung verschiedener Tumormikroumgebung witHin die gleiche Maus Maus Maus Variabilität 7-9 zu vermeiden. Mit dieser Technik wurden verschiedene Zellverhalten in dem Brusttumor-Virus (MMTV)-Promotor angetrieben Polyoma mittleren T-Onkogen (PyMT) Modell, das schrittweise von Tumorgenese zeigt gemeldet. Regulatorische T-Lymphozyten (Treg, von der Foxp3 EGFP-Transgens sichtbar) wandern bevorzugt in der Nähe der Blutgefäße in der Erwägung, DC (CD11c-DTR-EGFP), Karzinom-assoziierte Fibroblasten (Fsp1 + / + -EGFP) und myeloischen Zellen (c-fms -EGFP) weisen höhere Beweglichkeit in der Tumorperipherie als innerhalb der Tumormasse. Im Zustand der akuten systemischen Hypoxie, wanderten Zellen anders: Tregs stoppen Migration im Gegensatz zu myeloischen Zellen, die sich zu bewegen 6 fort. Zusätzlich wird in der gleichen Mausmodell wurde gezeigt, dass Doxorubicin Empfindlichkeitsänderungen mit Tumorstadium wird Arzneimittelverteilung Arzneimittelantwort und Doxorubicin bezogenenBehandlung führt zu CCR2-abhängigen Rekrutierung von myeloischen Zellen zu Tumoren. So können Live-Bildgebung auch verwendet, um Einblicke in die Arzneimittelreaktionen in situ und die Biologie der Chemoresistenz 10,11 zu gewinnen. Adenomatöse Polyposis coli (APC)-Gen-Mutationen treten häufig in menschlichen kolorektalen Adenomen und Karzinomen 12 und Mutation eines einzelnen Kopie des Gens Ergebnisse von APC im familiären adenomatösen Polyposis (FAP), die ein extrem hohes Risiko für Darmkrebs 13 verleiht. Der Maus-Stamm Apc Min / + trägt eine Trunkierungsmutation an Codon 850 des APC-Gens und entwickelt spontan mehreren intestinalen Adenomen ganzen Dünndarm 14-16. Langfristige intravitalen Bildgebung des Darms ist schwierig, weil der Invasivität des Verfahrens, da das Öffnen der Bauchhöhle, die für den Zugriff auf den Darm. Kurzfristige Live-Bildgebung studies wurden zuvor an gesunden Darm 17,18 veröffentlicht, aber die langfristige direkte Beobachtung von Darmtumoren wurde nicht berichtet. Ein chirurgisches Verfahren wurde entwickelt und verfeinert, um Tumore über die serösen Oberfläche des Darms sichtbar zu machen, mit der sich drehenden Scheibe Intravitalmikroskopie System vorher auf Bild Brusttumoren 6,10 verwendet. In diesem Beitrag wird ein Protokoll beschrieben, das eine um das Verhalten von myeloischen Zellen in den Tumoren im Dünndarm unter Verwendung von Apc Min / +-Mäusen folgen können.

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	<tbody>
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			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td>2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ACTB-ECFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:141px;">3773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">cfms-EGFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td align="right">18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">D7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:107px;">Butler Animal Health Supply</td>
			<td style="width:141px;">29450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxygen</td>
			<td style="width:107px;">UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1X PBS</td>
			<td style="width:107px;">UCSF cell culture facility</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Saline Buffer</td>
			<td style="width:107px;">UCSF cell culture facility</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647</td>
			<td style="width:107px;">UCSF Monoclonal antibody core</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Atropine</td>
			<td style="width:107px;">LARC UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Use at 1mg/Kg mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alcohol wipes</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:141px;">326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">28G1/2 insulin syringe</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:141px;">329465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Remium cover glass</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">12-548-5M</td>
			<td>24x50-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost plus microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">12-550-15</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Krazy glue</td>
			<td style="width:107px;">Office Max</td>
			<td align="right">7111555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Betadine</td>
			<td style="width:107px;">LARC UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heat blanket</td>
			<td style="width:107px;">Gaymar Industries</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hot bead sterilizer</td>
			<td style="width:107px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">18000-45</td>
			<td>Turn ON 30min before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cotton tipped apllicators 6-inch</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:141px;">72310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anesthesia system</td>
			<td style="width:107px;">Summit Anesthesia Support</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:107px;">Carl Zeiss Inc</td>
			<td style="width:141px;">Zeiss Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">stage insert</td>
			<td style="width:107px;">Applied Sientific Instrumentation</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse Ox oximeter, software and sensors</td>
			<td style="width:107px;">Starr Life Sciences</td>
			<td style="width:141px;">MouseOx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nebulizer</td>
			<td style="width:107px;">Summit Anesthesia Support</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaris</td>
			<td style="width:107px;">Bitplane</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mManager</td>
			<td style="width:107px;">Vale lab, UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Open-source software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ICCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:141px;">XR-Mega-10EX S-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spinning disk confocal sacan-head</td>
			<td style="width:107px;">Yokogawa Corporation</td>
			<td style="width:141px;">CSU-10b</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy

Myeloide Zellen sind die am häufigsten vorkommenden Immunzellen in Tumoren und haben gezeigt, dass Tumorprogression zu fördern. Moderne bildgebende Verfahren ermöglichen Intravital die Beobachtung von lebenden Zellverhalten im Inneren der Orgel, sondern kann eine Herausforderung in einigen Arten von Krebs durch Orgel und Tumor Zugänglichkeit sein wie Darm. Die direkte Beobachtung von Darmtumoren wurde bisher nicht berichtet worden. Eine hier beschriebene chirurgische Verfahren ermöglicht die direkte Beobachtung der myeloischen Zelldynamik in den Darmtumoren in lebenden Mäusen mit Hilfe transgener Mäuse fluoreszierenden Reporter und injizierbare Tracer oder Antikörper. Zu diesem Zweck wird ein Vier-Farben-, Multi-Region, Mikrolinsen-Spinning-Disk konfokalen Mikroskop, die langfristige, kontinuierliche Bildgebung mit schneller Bildaufnahme ermöglicht wurde verwendet. Apc Min / + Mäusen, die mehrere Adenome im Dünndarm zu entwickeln sind gekreuzt mit c-fms-EGFP Mäuse myeloischen Zellen visualisieren und mit ACTB-ECFP Mäuseauf intestinalen Epithelzellen der Krypten zu visualisieren. Verfahren zur Markierung von verschiedenen Tumorkomponenten, wie Blutgefäße und Neutrophilen, und das Verfahren zum Positionieren des Tumors für die Bildgebung durch die Serosa-Oberfläche werden ebenfalls beschrieben. Zeitraffer-Filme von mehreren Stunden von bildgebenden zusammengestellt ermöglichen die Analyse von myeloischen Zellverhalten in situ in der Darmmikroumgebung.

Durch die Verwendung von Spinnplatten konfokale Mikroskopie, nicht tumorale und Tumorgewebe im Dünndarm von Apc Min / +; ACTB-ECFP, c-fms-ECFP Mäuse aus der Serosa-Oberfläche dargestellt werden. Nach der Abbildung ist der Kamera-Software zur Analyse und Anpassung der Akquisition (Ergänzende Abbildung 1). Nach intravenöser (iv) Injektion von fluoreszierenden 2.000 kDa Dextran-Rhodamin und Ly-6G 647 konjugierte Antikörper, Blutgefäße und PMN kann detektiert werden <str...

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Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

9.6K Aufrufe.  INSERM U661, Functional Genomic Institute. By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model. 

Serie: Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in research laboratories, as well as for molecular diagnosis, because of its sensitivity, specificity, and convenience. However, in most cases, the quantitative PCR (qPCR) assay generally used to detect virus infection has relied on the purification of viral nucleic acid prior to the PCR step. In this study, the fluorescence-based reverse transcription qPCR (RT-qPCR) assay is developed through the combination of a processing buffer and a one-step RT-PCR reagent so that the whole process, from the harvest of the culture supernatant of virus-infected cells until real-time detection, can be performed without viral RNA purification. The established protocol enables the quantification of a wide range of RNA concentrations of dengue virus (DENV) within 90 min. In addition, the adaptability of the direct RT-qPCR assay to the evaluation of an antiviral agent is demonstrated by an in vitro experiment using a previously reported DENV inhibitor, mycophenolic acid (MPA). Moreover, other RNA viruses, including yellow fever virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV), and measles virus (MeV), can be quantified by direct RT-qPCR with the same protocol. Therefore, the direct RT-qPCR assay described in this report is useful for monitoring RNA virus replication in a simple and rapid manner, which will be further developed into a promising platform for a high-throughput screening study and clinical diagnosis.

Real-time quantitative polymerase chain reaction analysis combined with reverse transcription (RT-qPCR) has been widely used to measure the level of RNA virus infections. Here we present a direct RT-qPCR assay, which does not require an RNA purification step, developed for the quantification of several RNA viruses, including dengue virus.