Diese Methode ermöglicht es, durch einen nicht-invasiven Ansatz Patienten mit kolorektaler neoplastischer Läsion zu erkennen. Insbesondere erlaubt dieser Test in Verbindung mit Tests, die derzeit im Darmkrebs-Screening-Programm verwendet werden, das Vorhandensein von Krebs oder ein höheres Risiko für abnormale Läsionen besser vorherzusagen. Um dieses Protokoll zu beginnen, zentrifugieren Sie ein Aliquot jeder positiven Kontrolle, Standard-DNAs und Spike-in-DNA, in einem trockenen Format für 10 Sekunden auf einer Mini-Zentrifuge.
Setzen Sie die Positivkontrolle mit 750 Mikroliter Wasser aus. Setzen Sie die Spike-in-DNA, die als exogene interne Kontrolle verwendet wird, um das Vorhandensein von Inhibitoren zu testen, mit 100 Mikroliter Wasser aus. Für die Standardkurve den Trockenen mit 100 Mikroliter Wasser wieder aufhängen und vier 1:5 Verdünnungen ab der Stammlösung vornehmen.
Dann die Reagenzien 15 Sekunden lang vorsichtig wirbeln und 10 Sekunden lang in einer Minizentrifuge zentrieren. Für eine vollständige Resuspension die flüssigen Reagenzien vor der Verwendung 30 Minuten bei Raumtemperatur lagern. Um die 1x Spike-in-DNA-Kontrolle vorzubereiten, mischen Sie fünf Mikroliter FL-DNA-Spike mit 45 Mikroliter sterilem Wasser.
Mischen Sie für die Proben 75 Mikroliter jeder Probe mit 50 Mikrolitern 1x Spike-in-DNA, was ein Gesamtvolumen von 125 Mikrolitern ergibt. Öffnen Sie zunächst die qPCR-Betriebssoftware. Um die Platte einzurichten, legen Sie den Brunnentyp für alle acht Positionen in Spalte 1 als Standard fest.
Stellen Sie den Brunnentyp für die Brunnen A2 und B2 als NTC ein. Legen Sie den Brunnentyp für die positiven Steuerelemente C2 und D2 auf Unbekannt fest. Und setzen Sie den Brunnentyp für alle anderen Positionen als Unbekannt.
Wählen Sie alle 96 Positionen aus. Fügen Sie die Farbstoffe FAM und HEX hinzu und klicken Sie auf Sync Plate. Legen Sie dann das Thermalprofil wie angegeben fest.
Bereiten Sie die gewünschte Anzahl von 8-Well-Streifen vor, die vollständige lyophilisierte Amplifikationsmischungen enthalten, mit spezifischen Primern und Sonden, die auf die menschliche DNA und die interne Kontrolle abzielen. Um den Inhalt auf den Boden der Rohre zu bringen, zentrifugieren Sie die Streifen für 10 Sekunden. Entfernen Sie vorsichtig die Dichtungen von den Streifen, um sicherzustellen, dass sie kein Pellet verlieren.
Dann 25 Mikroliter Wasser in die negativen Kontrollbrunnen geben. 25 Mikroliter Proben-DNA zur Probe bohrungen Brunnen und 25 Mikroliter Positivkontroll-DNA in die Positivkontrollbrunnen. Fügen Sie für die Standardkurve 25 Mikroliter der Standard-1, 2, 3 und 4 in jedem dedizierten Brunnen hinzu.
Verwenden Sie 8-Streifen flache optische Kappen, um alle Streifen und Wirbel für ein paar Sekunden vorsichtig zu schließen. Zentrifugieren Sie die Streifen 10 Sekunden lang, laden Sie sie in das Instrument und starten Sie den Lauf. Wählen Sie am Ende des Laufs für FAM FL-DNA A und HEX IC die Spalten A, C, E und G aus. Für FAM FL-DNA B und HEX IC wählen Sie Spalten, B, D, F und H. Für die Standardmengen Ausgangsmenge 10 Nanogramm pro Reaktion für A1- und B1-Bohrungen, zwei Nanogramm pro Reaktion für C1 und D1, Punkt vier Nanogramm pro Reaktion für E1 und F1 und Punkt Null acht Nanogramm pro Reaktion für G1 und H1. Legen Sie dann für FAM- und HEX-Kanäle Threshold Fluoreszenzwerte auf 150 fest.
Klicken Sie im Feld Ergebnistabelle auf Spaltenoptionen, dann auf Alle auswählen und dann auf Okay, um die Ergebnisse in beiden Kanälen mit ihren jeweiligen Cq- und Delta-R-Lastwerten zu erhalten, die von der Echtzeit-qPCR-Instrumentensoftware bereitgestellt werden. Delta R entspricht zuletzt dem fluoreszenzwert, der auf den letzten Amplifikationszyklus normalisiert wurde. Klicken Sie im Feld Ergebnistabelle mit der rechten Maustaste auf die Tabelle, um das Kontextmenü zu öffnen.
Klicken Sie auf An Excel senden, um die Rohdaten zu exportieren. Und laden Sie dann die Excel-Datei auf die dedizierte Analysesoftware hoch, um die FL-DNA-Menge automatisch zu berechnen. Aus der Kombination von iFOBT- und FL-DNA-Werten wird für jeden Patienten das Darmkrebsrisiko geschätzt.
Fluoreszenzkurven einer geeigneten positiven Probe zeigen das Probensignal auf dem HEX-Kanal, der internen Steuerung, innerhalb des akzeptablen Bereichs. Das positive Signal liegt über der Schwelle auf dem FAM-Kanal, die die Verstärkung von Zielgenen anzeigt. Fluoreszenzkurven einer geeigneten negativen Probe zeigen das Probensignal innerhalb des akzeptablen Bereichs auf dem HEX-Kanal an.
Das negative Steuersignal liegt unterhalb des Schwellenwerts auf dem FAM-Kanal. Andererseits zeigen Kurven einer nicht geeigneten Probe das Sample-Signal, das nicht innerhalb des akzeptablen Bereichs auf dem HEX-Kanal liegt. Höchstwahrscheinlich aufgrund einer möglichen Hemmung.
Daher muss diese Probe wiederholt werden, beginnend mit der Extraktion. Die Ausgabetabelle der Softwareanalyse zeigt Daten für Mix A und Mix B in Bezug auf die FL-DNA-Konzentration für Reaktionskontrollen, klinische Proben und Ergebnisse der Qualitätskontrolle. Beispiel Nummer vier hat keine Ergebnisse, da die Qualitätskontrolle nicht bestanden wurde.
Sie muss wiederholt und neu analysiert werden. Bitte seien Sie vorsichtig, wenn Sie die DNA für Spike-in-Kontrolle auf die Standardkurve resuspended. Und bei der Verteilung verschiedener DNAs auf 8-Well-Streifen sowie während der molekularen Detektion im Abschnitt der Ergebnisanalyse.
Diese Methode muss in Kombination mit dem iFOBT-Test durchgeführt werden, um eine bessere Bewertung der chromektierten neoplastischen Läsionen zu ermöglichen, sie muss mit derselben Fäkalienprobe durchgeführt werden.
