Nehmen Sie zunächst die synchronisierten jungen erwachsenen C.Elegans-Hermaphroditen in einem Mikrozentrifugenröhrchen ein. Fügen Sie dem Wurmpellet 200 Mikroliter M9-Puffer hinzu, der Poloxamer 188, Pluronic F127 und zwei Mikroliter des Färbekit-Reagenzes enthält. Decken Sie die Röhrchen mit Alufolie ab, um die Farbstoffe vor Licht zu schützen.
Lassen Sie die Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei 20 U/min rotieren. Dann schleudern Sie die Würmer eine Minute lang bei 500 G. Entfernen Sie danach die Färbelösung, ohne das Wurmpellet zu stören.
Waschen Sie die Würmer dreimal mit M9-Puffer und geben Sie sie in eine gesäte NGM-Agarplatte, die die entsprechende Behandlung enthält. Waschen Sie die Würmer von den Platten in frische Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter M9-Puffer. Danach fixieren Sie die Würmer 30 Minuten lang mit 1%Formaldehyd auf Eis.
Und waschen Sie die Würmer dreimal mit einem Milliliter M9-Puffer, um Formaldehydreste zu entfernen. Saugen Sie nach dem Pelletieren der Würmer die maximale Menge Überstand an und halten Sie das Pellet in 10 Mikrolitern M9 intakt. Um 2,5 % Agarose herzustellen, wiegen Sie als nächstes 0,125 Gramm Agarose in ein 10-Milliliter-Reagenzglas aus Borosilikatglas. Fügen Sie fünf Milliliter M9-Puffer hinzu und lösen Sie die Agarose auf, indem Sie das Rohr vorsichtig mit einem Bunsenbrenner erhitzen.
Übertragen Sie die geschmolzene Agarose in ein Trockenbad bei 75 Grad Celsius. Geben Sie 100 Mikroliter der geschmolzenen Agarose mit einer Ein-Milliliter-Spitze auf ein Deck-Glosser-Mikroskop-Deckglas. Legen Sie sofort eine weitere Folie senkrecht auf den Agarosetropfen und bilden Sie eine Kreuzform.
Trennen Sie die Objektträger nach zwei Minuten vorsichtig, indem Sie das obere Deckglas drücken und das Agarosepad auf dem unteren Deckobjektträger belassen. Übertragen Sie die Würmer mit einer Pasteur-Glaspipette auf das Agarosepad. Verwenden Sie einen Docht aus einem Labortuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
Decken Sie dann die Würmer mit einem kleineren Deckglas ab und tragen Sie transparenten Nagellack auf den Rand auf, um ein Verdunsten zu verhindern. Legen Sie den Objektträger in eine dunkle Box, um ihn vor Licht zu schützen. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um die Würmer innerhalb von 24 Stunden bei den entsprechenden Wellenlängen mit einem Objektiv mit 60-facher Vergrößerung abzubilden.
Öffnen Sie als Nächstes die Bildbearbeitungssoftware und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den grauen Bereich. Wählen Sie im angezeigten Popup-Fenster die Option Akquisition aus. Ti2 Vollpolster.
ND-Erfassungs- und Lookup-Tabellen. Wählen Sie unter Ti2 Full Pad 60 Mal aus und stellen Sie den Mikroskop-Feinfokusknopf ein, um die Würmer in den Fokus zu bringen. Wählen Sie dann Spinning Disc und wählen Sie die Option 16 Bit ohne Binning.
Stellen Sie für jeden Fluoreszenzfilter die Belichtungszeit auf 500 Millisekunden und für das Hellfeld auf 20 Millisekunden ein. Sobald diese Parameter festgelegt sind, wählen Sie Jetzt ausführen und warten Sie, bis das Ausgabebild als ND2-Datei generiert wurde.
