Diese Arbeit wurde vom Australian Research Council Grants DP0986937 unterstützt.

Auswahl geeigneter Kontrolle Hefestämme Der Test beruht auf der Experimentator visuell Auswertung der Ansammlung von roten Fluoreszenz in der Hefe Vakuole. Als solcher ist der Test subjektiv und beruht auf der Auswahl der geeigneten Steuerung Stämme und Wachstumsbedingungen. Ein Wildtyp-Steuerung wird verwendet, um das Niveau der Autophagie in der Regel erwartet, zeigen. Als Negativ-Kontrolle eine Belastung null für die Expression eines der Kern-Autophagie-Genen (zB ATG3) ist geeignet, solche Stämme können nicht liefern Material (z. B. Mitochondrien, Zellkern), die Vakuole 1. Transformation von Hefezellen mit Plasmid-DNA Hefezellen können leicht gemacht werden kompetent für die Transformation durch Behandeln mit LiAcetate. Kommerzielle Kits können erworben (zB EasyComp, Invitrogen) und veröffentlicht werden Protokolle zur Verfügung 13. In diesem Protokoll verwenden wir Wildtypstamms BY4741 (MAT ein his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), und einige Mitglieder eine umfassende Bibliothek von Deletionsmutante Stämme (zB Δ atg3) daraus abgeleitet, die jeweils fehlenden Ausdruck einer anderen nicht-essentiellen Gen. Die Löschung Belastung Bibliothek stellt ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von Autophagie mit Rosella-Sonden. Der Reporter in diesem Protokoll eingesetzt wird mt-Rosella für Mitochondrien (Abb. 2A), gefolgt von pAS1NB codiert: mt-Rosella 12. Die folgenden Schritte sind auf die Verwendung von Zellen basiert kompetent gemacht mit dem EasyComp Transformation Kit und gefroren bei -80 ° C für die bequeme Nutzung. <ol><li> Äquilibrieren Lösung III (EasyComp Transformation Kit) auf Raumtemperatur 30 Minuten vor der Zugabe von Hefe-Zellen. </li><li> Add 2-2,5 ul (~ 100 ng / ul) von Plasmid-DNA, die der Reporter (pAS1NB: mt-Rosella) in ein steriles 1,7 ml-Snap-cap Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Add 5 ul der frisch aufgetauten Suspension kompetenter Hefezellen und mischen durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Dann werden 50 ul Lösung III (EasyComp Transformation Kit) und Vortex mischen. 1,5) Inkubieren der Transformation Reaktionen für 1 Stunde bei 28-30 ° C unter heftigem Rühren alle 15 Minuten mit einem Vortex-Mixer oder manuell durch flicking das Rohr mit dem Finger. </li><li> Sorgfältig Übertragung der Transformation Mischung zu einem einzigen YMM Agar Wachstum Platte mit Histidin ergänzt, Methionin und Uracil, und sanft verteilen die Zellen auf der ganzen Oberfläche des Agar mit einer sterilen Glas-Spreader. Hefezellen sind in diesem Stadium fragile und schonende Handhabung kann die Ausbeute an Transformanten zu erhöhen. </li><li> Inkubieren Wachstum Platten für 2 bis 4 Tage bei 28-30 ° C oder bis Kolonien erscheinen etwa 2-3 mm im Durchmesser. </li></ol> 2. Bestätigen Ausdruck Rosella in Hefezellen Bevor wir auf detaillierte Experimente die korrekte Lokalisation und effiziente Expression von Rosella sollten bestätigt werden. <ol><li> Mit sterilen Zahnstochern wählen für jeden Stamm 5 Einzelzimmer Kolonien aus der Transformation Platte und die Zellen in 50 ul sterilem Wasser in separate sterile 1,7 ml-Snap-cap Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Platz 10 ul jeder Zellsuspension auf separaten gekennzeichnet Objektträger aus Glas (76 x 26 mm) und die Abdeckung der Zellsuspension mit einem quadratischen Deckglas (22 x 22 mm). </li><li> Unmittelbar untersuchen die Zellen für die Fluoreszenz-Emission mit einem Fluoreszenzmikroskop (zB Olympus FluoView FV500). Suchen Sie nach starken grünen und roten Fluoreszenz und Kennzeichnung typische mitochondriale Lokalisation (Abb. 2B und 2C). </li><li> Der Rest jeder Kolonie für die Fluoreszenz-in auf diese Weise geprüft werden sollte auf eine frische YMM Wachstum Platte geimpft werden. </li><li> Die Platten bei 28-30 ° C für 2 Tage, bis Kolonie sind etwa 2-3 mm im Durchmesser. </li></ol> 3. Das Wachstum der Zellen und die Induktion von Autophagie Autophagie kann induziert durch eine Reihe von verschiedenen experimentellen Bedingungen, einschließlich des Beginns der stationären Phase, Veränderung der C-Quelle, die Verwaltung von Rapamycin oder Stickstoff Verhungern werden. Wir verwenden routinemäßig Stickstoff Hunger als die Methode mitophagy induzieren. <ol><li> Impfen einer einzigen Kolonie in 10 ml Wachstumsmedium mit Ethanol und den entsprechenden auxotrophen ergänzt. </li><li> Inkubieren Hefekulturen bei 28-30 ° C mit Orbital Schütteln (200 rpm) für ca. 48 Stunden. Die Zellen sollten in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase werden. </li><li> Pellet-Zellen von doppelter 1ml Proben der Kultur in sterile 1,7 ml-Snap-Cap-Kunststoff-Röhrchen durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig und den Überstand verwerfen, ohne das Zellpellet. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml sterilem destilliertem Wasser durch Resuspension, gefolgt von Zentrifugation, um restliches m entferntedium. </li><li> Nach dem dritten Waschen die Zellen in 100 ml Wachstumsmedium oder Stickstoff-Hunger Medium. </li><li> Re-impfen die resuspendierten Zellen in 10 ml frischem Nährmedium oder 10 ml Stickstoff-Hunger Medium. Inkubieren mit Orbital Schütteln für 6-12 Stunden zur Induktion von mitophagy ermöglichen. Nach Hungertod vorzubereiten Zellen für die Anzeige mittels Fluoreszenzmikroskopie. </li></ol> Hinweis: Die Beschriftung der Vakuole mit CMAC-Arg Bei der ersten Gründung des Tests ist es sinnvoll, unter dem Fluoreszenzmikroskop Lieferung von Rosella, die Vakuole zu bestätigen. Obwohl die Hefe Vakuole ist eine große Organellen, deren Lage oft einfach durch Verweis auf Durchlichtbilder, in einigen Stämmen der Hefe und unter bestimmten Wachstumsbedingungen der Vakuole werden fragmentiert und schwer zu orten ermittelt werden kann. Die Vakuole kann leicht beschriftet werden mit einem Cumarin-basierte Vakuole Farbstoff wie CMAC-Arg (7-Amino-4-chloromethylcoumarin, L-Arginin-Amid). Die Wirkung von Proteasen vacuolar auf den Farbstoff Ergebnisse in hellblauen Fluoreszenz-Markierung der Vakuole. Die blaue Emission kann leicht aus den roten und grünen Emissionen von Rosella 11 unterschieden werden. Die Markierung mit CMAC-Arg muss nicht routinemäßig durchgeführt werden, aber es ist für diejenigen, die nicht vertraut sind mit dem Standort und Aussehen der Vakuole in Hefe empfohlen. 4. Labeling der Vakuole mit CMAC-Arg <ol><li> Fügen Sie die CMAC-Arg (100 mM Endkonzentration) auf die wachsende oder Stickstoff unterversorgten Zellen vor der Aufnahme. Die CMAC-Arg Lösung kann im Voraus zubereitet werden, sondern als die Lösung ist lichtempfindlich es braucht, um vor Lichteinwirkung geschützt werden. </li><li> Inkubation bei 28-30 ° C mit Orbital Schütteln (200 rpm) für 30 Minuten. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal mit sterilem destilliertem Wasser durch Resuspension, gefolgt von Zentrifugation, um restliches Medium und überschüssiges CMAC-Arg Farbstoff zu entfernen. </li><li> Montieren Sie die Zellen für die Bildgebung, wie unten beschrieben. </li></ol> 5. Montage leben Hefezellen für die konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) <ol><li> Melt 2 mg Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in separate 1 ml Aliquots Wachstum mittel-und Stickstoff-Hunger Medium durch Inkubation bei 70 ° C. Die geschmolzene Agarose bei 70 ° C gehalten </li><li> Gently Pellet die Zellen in 1 ml Aliquots jeder Zellkultur durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 2 Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie die Überstände. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml sterilem destilliertem Wasser durch Resuspension und Zentrifugation wie in Schritt 5.2. </li><li> Resuspendieren gewaschenen Zellen in 100 ul sterilem destilliertem Wasser. </li><li> Um die Zellen vor Ort 20 ul geschmolzene Agarose auf eine markierte Objektträger (76 x 26 mm) montieren. </li><li> Unmittelbar vor Ort 10 ul der gewaschenen Zellsuspension auf die Agarose Bett. </li><li> Decken Sie die Agarose Bett mit einem Deckglas (22 x 22 mm). Die Zellen werden über die Agarose Oberfläche unter dem Deckglas verteilen. </li><li> Um zu verhindern, Dehydration und die Bewegung des Deckglases während der Bildgebung sorgfältig die Ränder des Deckglases mit einem dünnen Film von Nagellack. </li><li> Wenn der Nagellack trocken ist (10 min) der Folie ist bereit, durch Fluoreszenzmikroskopie Beware Blick: Nagellack kann Schäden an Mikroskop Ziele führen. </li><li> Cells montiert mit Hilfe dieser Technik können bis zu 1 Stunde beobachtet werden nach der Montage. </li></ol> 6. Visualizing Autophagie mit CLSM Die Höhe der Autophagie in einer Population von Zellen wird routinemäßig durch die Bestimmung der Anzahl der Zellen zeigt rot vacuolar Fluoreszenz vor und nach der Induktion von Autophagie beurteilt. Idealerweise wird die Progression der Autophagie wird an ausgewählten Zeitpunkten nach Induktion von Autophagie (Abb. 3) überwacht. Dies geschieht am besten durch die Visualisierung durch das Mikroskop Binokular durchgeführt. Es ist wichtig, dass die korrekte Kontrollen eingesetzt werden (zB Δ atg3 Mutante) und dass das Mikroskop Einstellungen bleiben unverändert zwischen Beobachtung verschiedener Proben (z. B. Einsatz von Neutralfilter, Filter-Auswahl). Hefezellen sind relativ klein, die eine gute Qualität Fluoreszenzmikroskop (zB Olympus FluoView FV500) mit Anregung / Emission-Filter für die separate Darstellung von GFP und / oder pHluorin (grüne Fluoreszenzemission) (FITC-Filter) und DsRed.T3 (rot ausgestattet Fluoreszenzemission) (TRITC-Filter). <ol><li> Mit einem 60x Wasser objektive Sicht nicht verhungert Wildtyp-Zellen mit abwechselnd die FITC und TRITC-Filter. Wildtyp-Zellen sollte eine typische zelluläre Verteilung von Mitochondrien an der Peripherie der Zellen, die beide rote und grüne Fluoreszenz ausstellen. Beachten Sie, dass diese Verteilung der Mitochondrien abhängig von der Pinh istole Einstellung des konfokalen Mikroskops. Wir verwenden in der Regel eine niedrigere Pinhole Wert von 125 um, die nur erlaubt den Mitochondrien als eine Reihe von Punkten an der Peripherie der Zelle (Abb. 2C), so dass die Vakuole nicht verdeckt ist 12 lokalisiert beobachtet werden. Wenn eine hohe Pinhole Wert (200 um) verwendet, ist dies erlaubt den typischen filamentösen mitochondriale Netzwerk der ganzen Zelle verteilt (und die darin auftretenden Veränderungen) zu beachten 11. Keine andere Strukturen in der Zelle sollte fluoreszenzmarkierten werden. </li><li> Sequenziell Blick Zellen für jede der folgenden Zeitpunkten Transfer zum Hungertod Medium. Visualisieren Sie abwechselnd mit den grünen und roten Sperrfilter. Auf der 6 h Hunger Zeitpunkt rote Fluoreszenz, aber keine entsprechende grüne Emission sollte in der Vakuole erkennbar. Vakuoläre Lokalisierung kann separat bestätigt werden mit CMAC-Arg (Abb. 2C). Blick ~ 200 Zellen und die Anzahl, die nur rote Fluoreszenz in der Vakuole (dh vacuolar Aufnahme von Mitochondrien) zu zeigen. </li><li> Graf vacuolar Akkumulation zu allen Zeitpunkten beobachten&gt; 200 Zellen und dann Plot Prozentsatz an Zellen, welche vacuolar Akkumulation. </li><li> Untersuchen Autophagie-negative Kontrolle Zellen, die mt-Rosella vor Hunger und nach 6 h Hunger. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Hier zeigen wir typische Ergebnisse, die mit mt-Rosella, in Wildtyp und Mutante Δatg3 Zellen exprimiert. Unter Wachstumsbedingungen mit Ethanol als Kohlenstoffquelle, weisen sowohl Wildtyp und Δatg3 mutierten Zellen eine zelluläre Verteilung der Fluoreszenz (rot und grün), die typisch von Mitochondrien in Hefezellen. Rote und grüne Fluoreszenzemission ist nicht in der Vakuole (Abb. 2B und 2C) nachgewiesen. Wenn Stickstoff Hunger für 6 h und einer darüber hinaus dann, zusätzlich zu roten und grünen Fluoreszenz entspricht Mitochondrien, Wildtyp-Zellen zeigen auch die Ansammlung von roten, nicht aber grüne Fluoreszenz in den Vakuolen Lumen (Abb. 2B;. Abb. 3) . Doch in Δatg3 mutierten Zellen weder rot noch grün Fluoreszenz reichert sich in der vacuolar Lumen (Abb. 2C;. Abb. 3). <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Top, Schema der Organellen und Kompartimente in einer Hefezelle. Unten, eine Vakuole-zentrierte Sicht einer Hefezelle vorgestellt Angabe autophagischen Abbau von verschiedenen Organellen und Kompartimente. Einige der Unterschiede zwischen den verschiedenen Organellen-spezifische Arten von Autophagie (zB mitophagy, nucleophagy) gehören die Spezifität (Fracht Auswahl) der verschlungen Inhalt, verschiedene intrazelluläre Bedürfnisse und extrazelluläre Signale (z. B. Hunger, Beschädigung), spezifische Signale, ATG Gene und Zeitabhängigkeit. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2a.jpg" alt="Abbildung 2a" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2b.jpg" alt="Abbildung 2b" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2c.jpg" alt="Abbildung 2c" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2d.jpg" alt="Abbildung 2d" /> Abbildung 2. (A) Schematische Darstellung des mt-Rosella. Die mitochondriale Leitsequenz (in diesem Fall von Citrat-Synthase) wird verwendet, um die Rosella Biosensor auf der mitochondrialen Matrix Ziel. Anregungs-und Emissionsmaxima für beide rot fluoreszierendes Protein (DsRed.T3) und grün fluoreszierende Protein (pHluorin) angegeben sind. Bei hohen pH-Wert (pH ~ mitochondrialen 8,2) der Biosensor fluoresziert sowohl rot und grün, aber bei niedrigen pH-Wert (pH ~ vacuolar 5,5) fluoresziert nur rot. (B) Schematische Darstellung der erwarteten Ergebnisse in Wildtyp-und Δ atg3 mutierte Zellen, die mt-Rosella. (C) Die tatsächlichen Ergebnisse von CLSM für Wildtyp-Zellen unter wachsenden und Stickstoff Hunger Bedingungen erhalten. Von links nach rechts:. DIC (Unterschied in Kontrast), RFP (DsRed.T3) Fluoreszenzemission, GFP (pHluorin) Fluoreszenzemission, CMAC-Arg-Fluoreszenz und verschmelzen Bild (D) Die tatsächlichen Ergebnisse von Fluoreszenz-Mikroskopie für Datg3 mutierten Zellen erhalten unter wachsenden und Stickstoff Hunger Bedingungen. Von links nach rechts: DIC (Differenz in Kontrast), RFP (DsRed.T3) Fluoreszenzemission, GFP (pHluorin) Fluoreszenzemission, CMAC-Arg-Fluoreszenz und verschmelzen Bild. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Der Anteil der Wildtyp-und Δ atg3 mutierte Zellen, die mt-Rosella gewachsen und unter Stickstoff Hunger, zeigt rote Fluoreszenz in der Vakuole über einen zeitlichen Verlauf von 48 Stunden. Der Prozentsatz an Zellen, welche Anhäufung von roten Fluoreszenz in der Vakuole wurde bei 0, 6, 12, 24 und 48 Stunden nach Beginn der Stickstoff Hunger aufgezeichnet.

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In der repräsentativen Bilder in Abb. vorgestellt. 2B und 2C ist deutlich zu erkennen sein, dass die Verwendung von Organellen-spezifische fluoreszierende Reporter-und Fluoreszenzmikroskopie Beweis für mitochondriale Lokalisation / Verteilung in der Wachstums-und Stickstoff unterversorgten Zellen bietet, und ermöglicht mitophagy visualisiert werden. Es ist zu betonen, dass diese Methode nicht zu folgen mitophagy eingeschränkt werden. Autophagy von anderen zellulären Komponenten oder Organellen (z. B. Ribosomen, Lipidtropfen, Peroxisomen, endoplasmatisches Retikulum und Zellkern) lassen sich mit geeigneten Kennzeichnung überwacht werden. Details der Rosella Biosensor zu konstruieren, Zellkultur-Bedingungen und typische Ergebnisse für Umsatz des Kerns (nucleophagy) wurden 11,12 berichtet, welche die breitere Anwendung der Methode. Verwenden von Organell-spezifischen fluoreszierenden Reporter für die Überwachung der Autophagie erfordert mehrere Überlegungen von Konstrukt-Design im Auge behalten werden. Dazu gehören: (1) Auswahl und Fusion mit dem entsprechenden Targeting-Signal zu Organellen-spezifisches Targeting zu erreichen, (2) Auswahl eines geeigneten fluoreszierenden Proteins (s), (3) starke Fluoreszenzemission, (4) richtig Organelle Lokalisierung und / oder Verteilung in der Zelle. Sobald der Organellen-spezifische Reporter wurde erfolgreich in der gewählten Hefewirt ausgedrückt Stamm eine zweite Gruppe von Überlegungen werden: (1) das Wachstum der Hefe Bedingungen, (2) Zelle Probenvorbereitung, (3) Bildparameter wie es wichtig ist, dass die gewählten Parameter für CLSM (zB Laser-Intensität, Scan-Rate und den Modus, Pinhole-Wert, Zoom-Wert, Ziele eingesetzt oder Belichtung für CCD-Kamera) sind über ein Experiment, dass Vergleiche zwischen Steuerung (wachsende Zellen) und ausgehungert Proben gemacht werden beibehalten; ( 3) Autophagie Induktion und erfolgreiche Umsetzung der Reporter in die Vakuole. Insgesamt ist diese Fluoreszenz-Mikroskopie-Methode einfach, relativ schnell und hat mögliche Anwendung für das Hochdurchsatz-Screening nach neuen Medikamenten, oder zu verbessern hemmen Autophagie, und auch für Gene, oder regeln modulieren Autophagie.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes / Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Saccharomyces cerevisiae EasyComp Transformation Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K5050-01 </td></tr><tr><td> Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat </td><td> BD Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Low Agarose </td><td> Progen Biosciences </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Objektträger (76 x 26 mm) </td><td> Menzel-Gläser </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop-Deckgläser (22 x 22 mm) </td><td> Menzel-Gläser </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> Die konfokale Laser Scanning Mikroskop FluoView FV500 </td><td> Olymp </td><td></td></tr><tr><td> CMAC-Arg </td><td> Moleular Probes-Invitrogen </td><td> Y-7531 </td></tr></tbody></table> Alle angegebenen Konzentrationen sind w / v, sofern nicht anders angegeben. Hefe-Minimalmedium (YMM): 0,67% Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, 2% Glucose, 1,5% Agar (nur hinzugefügt, wenn Herstellung fester Medien) und alle erforderlichen auxotrophen Ergänzungen (0,01%)]. Saccharomyces Salze (SS): (NH 4) 2 S0 4, 0,12%; KH 2 PO 4, 0,10%; MGC1 2 .6 H2O, 0,07%; NaC1, 0,05%; CaCl2, 0,01%; FeC1 3, 0,0005%. Nährmedium: SS und 2% Ethanol (v / v) und entsprechenden auxotrophen ergänzt. Stickstoff-Hunger-Medium: 0,17% Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat (Difco), 2% Ethanol (v / v).

a fluorescence microscopy assay for monitoring mitophagy in the yeast saccharomyces cerevisiae

Autophagie ist für einen Umsatz von zellulären Komponenten wichtig unter einer Reihe von verschiedenen Bedingungen. Es dient ein wesentlicher homöostatische Funktion sowie ein Mechanismus der Qualitätskontrolle, die Ziel und kann selektiv abgebaut Zellmaterial einschließlich organelles1-4. Zum Beispiel, beschädigt oder redundant Mitochondrien (Abb. 1), nicht durch Autophagie, können eine Bedrohung für die zelluläre Homöostase und das Überleben der Zelle darstellen entsorgt. In der Hefe kann Saccharomyces cerevisiae, Nährstoffmangel (z. B. Stickstoff Hunger) oder Schäden selektive Umsatz der Mitochondrien durch Autophagie in einem Prozess bezeichnet mitophagy 5-9 zu fördern. Wir beschreiben eine einfache Fluoreszenzmikroskopie Ansatz zur Autophagie zu beurteilen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit beschränken wir unsere Beschreibung hier, um zu zeigen, wie der Ansatz verwendet werden, um mitophagy in Hefezellen zu überwachen. Der Test verwendet eine fluoreszierende Reporter, Rosella, die ein Dual-Emissions-Biosensor mit einer relativ stabilen pH-rot fluoreszierendes Protein in Verbindung mit einem pH-sensitive grün fluoreszierenden Proteins ist. Der Betrieb dieser Reporter verlässt sich auf Unterschiede in der pH-Wert zwischen der Vakuole (pH ~ 5,0-5,5) und Mitochondrien (pH ~ 8,2) in lebenden Zellen. Unter Wachstumsbedingungen weisen Wildtyp-Zellen sowohl rote und grüne Fluoreszenz in einer Weise charakteristisch für die Mitochondrien verteilt. Fluoreszenzemission ist nicht mit der Vakuole verbunden. Wenn Stickstoff Hunger, eine Bedingung, die mitophagy induziert neben roten und grünen Fluoreszenz-Markierung der Mitochondrien unterzogen, weisen Zellen der Anhäufung von roten, nicht aber grüne Fluoreszenz, in den sauren vacuolar Lumen, die die Lieferung von Mitochondrien, die Vakuole. Scoring-Zellen mit roten, aber nicht grün fluoreszierenden Vakuolen kann als ein Maß für mitophagic Aktivität in Zellen 5,10-12 verwendet werden.

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A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Ein robustes Konzept für die Lieferung von Organellen in den sauren Lumen der Hefe Vakuole für den Abbau und Recycling-Monitor beschrieben. Die Methode beruht auf der spezifischen Markierung von Zielorganellen mit einem genetisch kodierten Dual-Emissions-Fluoreszenz-pH-Biosensor und Visualisierung von einzelnen Zellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

25.3K Aufrufe.  Monash University. Ein robustes Konzept für die Lieferung von Organellen in den sauren Lumen der Hefe Vakuole für den Abbau und Recycling-Monitor beschrieben. Die Methode beruht auf der spezifischen Markierung von Zielorganellen mit einem genetisch kodierten Dual-Emissions-Fluoreszenz-pH-Biosensor und Visualisierung von einzelnen Zellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie.

Serie: A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Forschung

Biologie

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).