Öffnen Sie nach der Bildgebung des medikamentös behandelten C.elegans die ND-Datei auf dem Image-J-Server mit dem Kolokalisierungs-Plugin und wählen Sie im Dialogfeld die Option Bilder teilen. Jede ND-Datei enthält Bildebenen, die bei drei Wellenlängen aufgenommen wurden, und sichtbares Licht. Arbeiten Sie mit Hellfeld-, Grün- und Rotbildern.
Generieren Sie Duplikate dieser Bilder, um das Originalbild unberührt zu lassen, indem Sie auf das Bild klicken und Duplikat auswählen oder die Tastenkombination Umschalt plus D verwenden.Reduzieren Sie dann den Hintergrund, indem Sie ein weiteres Bildduplikat erstellen, wie zuvor gezeigt. Subtrahieren Sie den Hintergrund mit einem Rollradius von 100 und wählen Sie die Option Hintergrund erstellen, um ein Bild mit dem Hintergrund des angegebenen Bildes zu erstellen. Gehen Sie nun zum Verarbeiten, klicken Sie auf Bildrechner und subtrahieren Sie das erste duplizierte Bild vom zweiten duplizierten Bild.
Verwenden Sie die resultierenden Bilder für die Kolokalisierungsanalyse. Um das Kolokalisierungs-Plugin zu verwenden, konvertieren Sie die Bilder des grünen und roten Kanals in acht Bit, indem Sie auf Bild klicken, Typ auswählen und dann acht Bit. Klicken Sie anschließend auf Plugins und wählen Sie Colokalisierung aus.
Um die Kolokalisation von Mitochondrien- und Lysosomensignalen zu messen, stellen Sie das Verhältnis auf 75 %, den roten Schwellenkanal auf 80,0 und den grünen Schwellenwert auf 50,0 ein. Als Ausgabe wird ein Acht-Bit-Binärbild erzeugt, das kolokalisierte Punktzahlen enthält und die drei Acht-Bit-Bilder in einem RGB-Bild kombiniert. Konzentrieren Sie sich als Nächstes auf die Puncta im Kopf-Körperwand-Muskel der Würmer, indem Sie den Bereich manuell auswählen und eine Maske erstellen, indem Sie auf Bearbeiten, Auswahl und Maske erstellen klicken, um den gewünschten Bereich auszuwählen.
Um die Partikel im Interessenbereich auszuwählen, verwenden Sie den Bildrechner, um die kolokalisierten Acht-Bit- und maskierten Bilder auszuwählen. Verwenden Sie die Operation und wählen Sie den Puncta im Interessenbereich aus, um ein Bild mit Punktzahl im Interessenbereich zu erzeugen. Um schließlich die Fläche der kolokalisierten Mitochondrien und Lysosomen zu analysieren, wählen Sie analysieren, gefolgt von der Analyse der Partikel und messen Sie die Summe der Puncta zwischen 0,1625 Quadratmikrometern und vier Quadratmikrometern.
Die konfokalen Aufnahmen der Kopf-Körper-Wandmuskulatur von Würmern zeigten eine Kolokalisation von Mitochondrien und Lysosomen. VL-850 induzierte eine robuste Mitophagie in der Kopf-, Körperwandmuskulatur des Wurms, was auf einen starken Mitophagie-Induktor hindeutet. Die Mitophagie-Potenz von VL-850 war ähnlich wie die von FCCP.
