Nachdem Sie die mit Medikamenten behandelten Hep-3B-Zellen abgebildet haben, öffnen Sie die konfokalen Bilder in Bild J mit dem Kolokalisations-Plugin. Öffnen Sie die ND-Datei auf dem Image-J-Server und wählen Sie im Dialogfeld die Option "Kanäle teilen". Arbeiten Sie mit grünen und roten Bildern.
Generieren Sie Duplikate dieser Bilder, um das Originalbild unberührt zu lassen, indem Sie auf das Bild klicken und Duplikat auswählen oder die Tastenkombination Umschalt plus verwenden, um den Hintergrund D.To verkleinern, ein weiteres Bildduplikat zu erzeugen, den Hintergrund mit einem Rollradius von 100 zu subtrahieren und die Option Hintergrund erstellen auswählen, um ein Bild mit dem angegebenen Bildhintergrund zu generieren. Gehen Sie dann zu Prozess. Klicken Sie auf Bildrechner und subtrahieren Sie das erste duplizierte Bild vom zweiten duplizierten Bild.
Verwenden Sie die resultierenden Bilder für die Kolokalisierungsanalyse. Um das Kolokalisierungs-Plugin zu verwenden, konvertieren Sie die Bilder des grünen und roten Kanals in 8 Bit, indem Sie auf Bild klicken, Typ auswählen und dann 8 Bit eingeben. Klicken Sie anschließend auf Plugins und wählen Sie Colokalisierung aus.
Um die Kolokalisation von Mitochondrien- und Lysosomensignalen zu messen, stellen Sie das Verhältnis auf 75 %, den roten Schwellenkanal auf 80,0 und den grünen Schwellenwert auf 50,0 ein. Es wird ein 8-Bit-Binärbild erzeugt, das kolokalisierte Puncta enthält und die drei 8-Bit-Bilder in einem RGB-Bild kombiniert. Konvertieren Sie diese Bilder in 8-Bit-Bilder.
Um den Interessenbereich der Zellen zu erhalten, generieren Sie ein Bild, das den Bereich der Zellen hervorhebt, indem Sie das Bild eines kolokalisierten Punkts auswählen. Um den gesamten Zellenbereich auszuwählen, wählen Sie das resultierende Bild mit kolokalisierten Punkten aus und klicken Sie auf Bild, passen Sie den Schwellenwert an und legen Sie den Schwellenwert fest, um sicherzustellen, dass der gesamte Zellenbereich hervorgehoben ist. Um den Bereich der Zelle zu analysieren, wählen Sie "Analysieren" aus, klicken Sie auf "Partikel analysieren", und messen Sie alle Partikel im Bild von null bis unendlich, die Standardeinstellung für "Partikel analysieren".
Um den Bereich der kolokalisierten Mitochondrien und Lysosomen zu analysieren, wählen Sie das kolokalisierte 8-Bit-Bild aus. Wählen Sie dann "Analysieren" aus. Klicken Sie auf Partikel analysieren, und messen Sie die Summe von Puncta zwischen 0,1625 Quadratmikrometern und vier Quadratmikrometern.
Teilen Sie die Fläche der kolokalisierten Mitochondrien und Lysosomen durch die Gesamtzellfläche, um die kolokalisierte Punktzahl zu messen. Die konfokalen Bilder von Hep-3B-Zellen zeigten eine Kolokalisation von Mitochondrien und Lysosomen. VL 850 und FCCP induzierten eine signifikante Mitophagie in den Hep-3B-Zellen.
