Die Autoren bedanken sich bei Dr. David Tirrell (Caltech) für die freundliche Gabe des Plasmid pQE9 AC 10 ATRP 12, Dr. Tom Muir (Princeton University) für seine freundliche Gabe des Plasmid-KanR IntRBS-NpuNC CFN-11 bestätigen, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japan) für die freundliche Gabe des Plasmid-pET30 CUTA-Tip1 10, und Dr. D. Jay Keasling (UC Berkley) für die freundliche Gabe des Plasmid pJD757 13 . Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Science Foundation KARRIERE, US Air Force YIPS und Norman Hackman Advanced Research Program.

1. Plasmid-Bau HINWEIS: Alle Gene wurden unter Standard-PCR-Reaktionen mit Phusion High-Fidelity DNA Polymerase pro Angaben des Herstellers amplifiziert. Primer für die Klonierung verwendet wurden zuvor 9 beschrieben. Alle Konstrukte sind in Tabelle 1 aufgeführt. <ol><li> Um CUTA-NpuN (N, Tabelle 1) zu generieren: <ol><li> PCR verstärken CUTA und NpuN Gene von Plasmiden pET30-CUTA-Tip1 10 und KanR-IntRBS-NpuNC CFN-11, jeweils mit den entsprechenden Primer. </li><li> Verdauen diese Fragmente mit den geeigneten Restriktionsenzymen und sequentiell diese Fragmente in den Vektor pET26b zwischen dem T7-Promotor und ein C-terminales Tag 6xHistidine N (2A) zu erzeugen, einzufügen. </li></ol></li><li> Um NpuC-S-CUTA (C, Tabelle 1) zu generieren: <ol><li> PCR Amplify NpuC, CUTA-und S-Fragmentierungt [AG 3 (PEG)] 10 von Plasmid-KanR IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-CUTA Tip1-10 und AC 10 pQE9 ATRP 12, jeweils mit den entsprechenden Primer. </li><li> Digest diese Fragmente mit den entsprechenden Restriktionsenzymen und nacheinander diese Fragmente in den Vektor pET26b zwischen T7-Promotor und einem C-terminalen 6xHistidine zu erzeugen C (2B) einfügen. </li></ol></li><li> : Um NpuC-S-SH 3-Liga CUTA (C-SH3-lig, Tabelle 1) zu erzeugen <ol><li> PCR Amplify CUTA Verwendung von Primern, die eine SH3 lig (PPPALPPKRRR) und einen flexiblen Linker (GGGGS) 2-Fragment, SH 3-Liga CUTA generieren. </li><li> Ersetzen Sie die CUTA Gen aus C mit Fragment SH3-Liga CUTA. </li></ol></li><li> Um SH3-GFP (Tabelle 1) zu generieren: <ol><li> Erhöhen der SH3-Gen aus dem Plasmid pJD757 13 unter Verwendung dergeeigneten Primer. </li><li> Fuse Dieses Fragment auf das GFP-Gen und legen Sie sie in das pET26b Vektor zwischen dem T7-Promotor (2C) und eine C-terminale 6xHistidine-Tag. </li></ol></li></ol> 2. Protein Expression <ol><li> Transformation 50 ul chemisch kompetente Escherichia coli BL21 (DE3) mit dem entsprechenden Expressionsplasmid. </li><li> Nach der Transformation dieser Zellen seriell verdünnt, und diese Platte auf Luria-Bertani (LB) / Agar-Platten, die 50 ug / ml Kanamycin. </li><li> Inkubieren Platten, die transformierten Zellen bei 37 ° C für ~ 15 Stunden. </li><li> Nach der Inkubation, wählen Sie eine Platte, die 50 bis 100 Kolonien enthält und resuspendieren alle Kolonien in 5 ml LB-Brühe. </li><li> Übertragungs Suspension auf 1 l LB-Medium mit Kanamycin (50 ug / ml) wachsen und Zellen bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 UpM. Überwachung der Absorption bei 600 nm (OD 600). Kultur wachsen, bis OD 600 ~ 0,8. <ol><li> Für C und C-SH3-Liga induzieren Proteinexpression durch Zugabe von Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu der Kultur (1 mM Endkonzentration) und Inkubieren der Kultur bei 37 ° C für 4 Stunden unter Schütteln bei 250 UpM. </li><li> Für N-und SH3-GFP, kühlen die Kultur auf ~ 18 ° C durch Eintauchen des Kulturkolben in einem Eiswasserbad für ~ 5 min. Induzieren Proteinexpression durch Zugabe von IPTG zur Kultur (1 mM Endkonzentration) und Inkubieren der Kultur bei 18 ° C für 14-18 Stunden unter Schütteln bei 250 UpM. </li></ol></li><li> Nach Proteinexpression Zentrifugation der Kultur bei 6000 × g für 20 min bei 4 ° C, um das Pellet zu sammeln. Speicher Zellpellet bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 3. Protein Purification <ol><li> Reinigung von N (denaturierende Bedingungen) <ol><li> Resuspendieren Zellpellets in Puffer A (Tabelle 2) bei 10 ml / g nasses Pellet. </li><li> Immerse die Pellet-Suspension in einem Eis-Wasser-Bad und stören die Zellen durch Ultraschallbehandlung (Amp 10, wobei 1 sec Puls und 6 sec Pause für 1 min). </li><li> Zentrifugieren des Lysats bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen. Das Pellet in Puffer DA (enthaltend 8 M Harnstoff) und Zentrifugieren der Suspension bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Die überstehende, durch eine 5 ml Ni-Nitrilotriessigsäure (NTA)-Säule zuvor mit Puffer äquilibriert DA. </li><li> Mit 30 ml Puffer DA mit 45 mM Imidazol-Waschkolonne ergänzt. Eluiere gereinigtes Protein mit 20 ml Puffer DA mit 150 mM Imidazol ergänzt. </li><li> Verringerung der Harnstoffkonzentration in der Proteinprobe auf &lt;1 mM durch eines der folgenden Verfahren in 3.1.7.1 oder 3.1.7.2 angegeben: <ol><li> Dialysieren Protein in DPBS-Puffer (Tabelle 2) bei 4 ° C über Nacht unter Verwendung von Hülsen mit &lt;20 kDa Cutoff. </li><li> Zentrifuge gereinigtes Protein in einem 30 &amp; #160; kDa Ultrafiltrations Spin-Säule bei 2.800 × g, 4 ° C, bis das Volumen weniger als 1 ml beträgt. In 14 ml DPBS-Puffer auf die Säule, um die Proteinprobe zu verdünnen. Wiederholen Sie die Zentrifugation / Verdünnungsstufen drei weitere Male. </li></ol></li><li> Nach dem Pufferaustausch, fügen Dithiothreitol (DTT), um das gereinigte Protein (final 2 mM) und konzentriert Protein auf ~ 100 mg / ml durch Zentrifugation durch ein 30 kDa Ultrafiltrations Spin-Säule bei 2.800 × g, 4 ° C </li><li> Aliquot des konzentrierten Protein und bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Reinigung von C-und C-SH3 lig (native Zustand) <ol><li> Resuspendieren Zellpellets in Puffer B (pH 6,0) (Tabelle 2) mit 1x-Protease-Inhibitor-Cocktail, ergänzt mit 10 ml / g nasses Pellet. Verwenden sauren Puffer proteolytischen Abbau des Zielproteins zu minimieren. </li><li> Stören Zellsuspension durch Beschallung wie in 3.1.2 beschrieben. Zentrifugieren Sie die lysaß bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C und halten Sie den Überstand. </li><li> Übergeben Sie die lösliche Lysat durch eine 5-ml-Ni-NTA-Säule zuvor mit Puffer B äquilibriert </li><li> Waschsäule mit Puffer B, ergänzt mit 45 mM Imidazol, eluiert und das Zielprotein in 20 ml Puffer B mit 150 mM Imidazol ergänzt. </li><li> Für C, weiter mit Schritt 3.2.6. Für C-SH3-lig, führen Sie eine zusätzliche Ionenaustausch-Reinigungsschritt teilweise abgebauten Protein zu entfernen wie in den Schritten gegeben 3.2.5.1 bis 3.2.5.3 <ol><li> Reduzieren NaCl-Konzentration in C-SH3-lig auf &lt;1 mM nach dem in 3.1.7 beschriebenen Verfahren. </li><li> Laden des Zielproteins auf eine 5 ml Anionenaustauscher-Agarose-Perlen Matrixspalte vorher mit Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) äquilibriert. </li><li> Eluat Zielproteins von der Säule, indem eine Steigung von einer Lösung, die 10 mM Tris-HCl pH 8,0 Buffer zu einer Lösung, die den gleichen Puffer mit 1 M NaCl ergänzt. Proben zu entnehmen, während Protein-Elution und Pool-Proben mit der höchsten Reinheit, basierend auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). </li></ol></li><li> Puffer des gereinigten Protein austauschen in DPBS-Puffer, wie in 3.1.7 beschrieben. </li><li> Hinzufügen DTT zu dem gereinigten Protein (Endkonzentration 2 mM) und konzentriere das Protein auf ~ 100 mg / ml unter Verwendung einer 30 kDa Ultrafiltrations Spin-Säule wie in 3.1.8 beschrieben. Aliquot und speichern konzentrierte Protein bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Reinigung von SH3-GFP <ol><li> Resuspendieren Zellpellets unter Verwendung von Puffer A auf 10 ml / g nasses Pellet. </li><li> Stören Pellet-Suspension durch Beschallung wie in 3.1.2 beschrieben. </li><li> Zentrifugieren des Lysats bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C und Sammeln des Überstands. </li><li> Führen Sie den Überstand (lösliche Lysat) durch eine 5-ml-Ni-NTA-Säule zuvor mit ins GleichgewichtPuffer A. </li><li> Waschen Säule mit 30 ml Puffer A, ergänzt mit 45 mM Imidazol. Eluens Protein unter Verwendung von 20 ml Puffer A, ergänzt mit 150 mM Imidazol. </li><li> Pufferaustausch des gereinigten Proteins in DPBS-Puffer mit einem ähnlichen Ansatz wie in 3.1.7 beschrieben, und das Protein zu konzentrieren, um ~ 150 mg / ml unter Verwendung einer 30 kDa Ultrafiltrations Spin-Säule wie in 3.1.8 beschrieben. </li><li> Aliquot und speichern gereinigte Protein bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Proben, die CUTA <ol><li> Verdünnen jedes gereinigte Protein in doppelt destilliertem Wasser, um die Konzentration von NaCl auf ca. 1 mm zu reduzieren. An dieser NaCl-Konzentration, führen die meisten der CUTA Trimer Proteine ​​als Monomere auf den SDS-PAGE-Gelen. </li><li> Mischungsproben mit 2x SDS-Probenpuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% Glycerin, 10% w / v SDS, 0,1% w / v Bromphenol blau, 2% β-Mercaptoethanol) bei 95 ° C inkubiert, für 5 min. </li><li> Laden Sie das samsätze auf ein 12% SDS-PAGE-Gel. Durchführung der Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 200 V für ~ 50 min. </li><li> Beachten Protein in den Gelen durch Färbung mit Coomassie Brilliant Blue R250 nach den Standardprotokollen (Abbildung 1C). </li></ol></li></ol> 4. Hydrogelierung HINWEIS: Die Probe Hydrogele in dieser Studie beruhen 1,6 mM jedes Hydrogel Baustein sofern nicht anders angegeben. Diese Proteinkonzentration ergibt ein weiches und stabiles Hydrogel. VORSICHT: Natriumazid (NaN 3) mit dem Hydrogel in einer Endkonzentration von 0,5% w / v zugegeben, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern. NaN 3 ist hochgiftig und muss mit äußerster Sorgfalt behandelt, wie im Sicherheitsdatenblatt angegeben werden. <ol><li> Berechne das Volumen für jede der konzentrierten Proteine ​​benötigt, um eine Endkonzentration von 1,6 mM in einem 100 &amp;mgr; l-Probe Hydrogel zu erreichen. Zum Beispiel: Konzentration von N:100 mg / ml Molekulargewicht von N: 26,3 kDa (siehe Tabelle 1) Wunsch Volumen: 100 ul Wunsch Konzentration: 1,6 mM <img alt="" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" width="600" /></li><li> Um eine 100 &amp;mgr; l-Hydrogel (1,6 mm) zu machen, mischen C (x &amp;mgr; l, entsprechend 4.1 berechnete Volumen) mit 5% NaN 3 (10 &amp;mgr; l), entsprechend 100 mM DTT (5 &amp;mgr; l) und N (y &amp;mgr; l Volumen berechnet 4.1) in einem 2 ml-Glasfläschchen. </li><li> Hinzufügen DPBS-Puffer ((85 - x - y) ul) in das Fläschchen, um ein Endvolumen von 100 &amp;mgr; l zu erreichen, und alle Komponenten über eine Wirbelbewegung mit einer Pipettenspitze von Hand zu mischen. Anmerkung: Die Lösung sehr viskos beim Mischen. </li><li> Zentrifugieren der Mischung für 2 min bei 8.000 × g, um die Luftblasen zu entfernen. </li><li> Inkubieren der Mischung bei RaumTemperatur über Nacht, damit der Intein-trans-Spleißen Reaktion zum Abschluss zu erreichen. Bestätigen Hydrogelbildung durch Drehen Rohr auf den Kopf. Die Proteine ​​nicht fließen, wenn ein Hydrogel gebildet wird. </li><li> Schätzen Sie die Intein-trans-Spleißen Ausbeute, indem Proben (0,5 ul jeweils) vor dem Schritt nach Schritt 4.2 und 4.5 auf einem SDS-PAGE-Gel gesammelt, wie in 3.4 (Abbildung 1C) beschrieben. </li></ol> 5. Immobilisierung von GFP über Docking Protein (DP) und Peptid-Docking Station (DSP) Wechselwirkung <ol><li> Um eine 50 ul GFP-funktionalisierten Hydrogel (1,2 mm), kombinieren C-SH3 lig (x ul, nach 4.1 berechnet) und SH3-GFP (y ul, nach 4.1 berechnet) bei molaren Verhältnis von 1:1 in einem 1,7 ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> In 5% NaN 3 (5 ul), 100 mM DTT (2,5 ul), (42.5 - x - &lt;em&gt; y) ul DPBS auf die gleiche Röhre. Add N (y ul, entsprechend 4,1 berechnet) zu einem 1:1-Molverhältnis von N-und C-SH3-Liga erzielen. Die Probe durch mit einer Pipettenspitze von einem Wirbelbewegung. </li><li> Zentrifugieren des Gemisches bei 8000 × g für 2 min und Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur über Nacht im Dunkeln. Ein Hydrogel Verkapselung SH3-GFP Formen während der Inkubation. </li></ol> 6. Die Verwendung von 1,6 mM Hydrogel als Gerüst für die Immobilisierung enzymatischen Reaktion in einem organischen Lösungsmittel <ol><li> Verwenden Sie die HRP als Modell-Enzym. Bereiten Sie eine Stammlösung von HRP (28 mg / ml oder 0,63 mM) in DPBS. </li><li> , Um eine 30 &amp;mgr; l-Hydrogel (1,6 mM) Einschließen HRP, kombinieren C (x ul, entsprechend 4,1 berechnet) mit HRP (2 &amp;mgr; l), 5% NaN 3 (3 &amp;mgr; l) und DTT (1,5 ul 100 mM) in einen 1,7 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> In N (y &lt;/ Em&gt; ul, nach 4.1 berechnet) und DPBS (23,5 - x - y) ul. Mischen Sie mit einer Pipettenspitze mit einer Wirbelbewegung. </li><li> Zentrifugieren des Gemisches bei 8000 × g für 2 min und bei Raumtemperatur über Nacht. ACHTUNG: die für die folgenden Aktivitätstest verwendet Regenten sind hochgiftig. Verwenden Sie spezifische Sicherheitsempfehlungen durch die entsprechenden Sicherheitsdatenblätter. </li><li> Für die enzymatische Reaktion, tauchen das Hydrogel in 1 ml Reaktionscocktail, der N, N-Dimethyl-p-Phenylendiamin (5,8 mM), Phenol (5,8 mM) und tert-Butylhydroperoxid (2,9 mM) in n-Heptan 14. Manuelles stören das Gel mit einer Pipettenspitze, um die Kontaktfläche des Hydrogels und das Lösungsmittel zu erhöhen. </li><li> Erkennen HRP Produkt, ein Indophenol-Farbstoff, durch Messung der optischen Extinktion der Proben zu verschiedenen Zeiten bei 546 nm in einem Plattenlesegerät (Fig. 5) aufgenommen. </li> &lt;/ Ol&gt;

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Keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

In dieser Arbeit haben wir gezeigt, die Synthese eines hochstabilen Intein-vermittelten Protein-Hydrogel. Die Verwendung eines getrennten Inteins ermöglicht das Hydrogel bedingt in Antwort auf das Mischen von zwei Flüssigphasen-Komponenten gebildet werden. Insbesondere die Splitinteins kovalent verbindet zwei Flüssigphasen-Bausteine ​​über eine Transspleißreaktion, wodurch ein Polypeptid Einheit durch Vernetzung von Einheiten, die wiederum selbst montiert in ein Hydrogel flankiert. Das Mischen induzier...

Hydrogele ganz aus Proteinen tragen das Potenzial, die so unterschiedlichen Bereichen wie Tissue Engineering, Drug Delivery und biofabrication ein deutlich voranzubringen. Sie bieten Vorteile gegenüber herkömmlichen synthetischen Polymer Hydrogele einschließlich Biokompatibilität und das Potenzial, nicht-invasiv unterstützt den Einbau von Kugelstern bioaktiven Proteinen. In dieser Arbeit beschreiben wir die Entwicklung einer neuen Protein-Hydrogel über eine Split-Intein-vermittelten Protein Transspleißreaktion und seine Anwendung als ein Protein Immobilisierung Gerüst (1) ausgebildet ist. Die Bausteine ​​für diese Protein-Hydrogel zwei Blockcopolymeren, die jeweils den N-oder C-terminales Fragment eines getrennten Inteins (IN und IC) und einer Untereinheit eines multimeren Proteins Vernetzer. Die DnaE Intein aus Nostoc punctiforme (Npu) wurde als Splitinteins 2,3 und einem kleinen trimere Protein (12 kDa) CUTA aus Pyrococcus horikoshii &lt;verwendet/ Em&gt; wurde als Vernetzer Protein 4,5 verwendet. Verschiedene Vernetzer werden durch Intein katalysiert Transspleißreaktion verbunden, was zur Bildung eines stark vernetzten Proteinnetzwerk (Hydrogel). Npu Intein wurde wegen seiner schnellen Reaktionskinetik (t 1/2 = 63 sec) und hohe trans-Spleißen Ausbeute (fast 80%) 2,3 gewählt. Die CUTA Protein wurde als Vernetzungsmittel aufgrund seiner hohen Stabilität ausgewählt. CUTA Trimere eine Denaturierungstemperatur in der Nähe von 150 ° C und halten trimeren Quartärstruktur in Lösungen, die bis zu 5 M Guanidin-Hydrochlorid 4,6. Da Wechseleinheit zwischen verschiedenen Vernetzer ist ein wesentlicher Faktor der physischen Hydrogel Oberflächenerosion 7, sollte die sehr starke Wechselwirkung zwischen den Untereinheiten in CUTA wie Börsen-Untereinheit abhalten, was zu einer stabileren Hydrogel. Einer dieser Bausteine ​​enthält auch eine stark hydrophile Peptid S-Fragment als Mittelblock, um Wasser zu erleichternRetention 8. Das Mischen der beiden Hydrogel Bausteine ​​initiiert eine trans-Spleißen Reaktion zwischen dem IN-und IC-Intein-Fragmente, wodurch eine längere Polypeptidkette mit Vernetzer in beiden Terminals. Vernetzer aus mehreren solchen Moleküleinheiten miteinander interagieren, wodurch eine hochvernetzte Hydrogel-Netzwerk (1A). Ein spezifisches &quot;Dockingstation Peptid&quot; (DSP) in einem der Hydrogel-Bausteine ​​enthalten, um stabile Immobilisierung einer markierten Target-Protein in das Hydrogel &quot;Docking-Protein&quot; (DP) zu erleichtern. Die Verwendung eines getrennten Inteins zum Hydrogel Anordnung vermitteln stellt nicht nur zusätzliche Flexibilität für die Protein-Hydrogel-Synthese, sondern ermöglicht auch hoher Dichte, gleichmäßige Belastung des Zielproteins während des gesamten Hydrogel, da die Zielproteine ​​vor der Hydrogelbildung geladen. Die Intein-vermittelten Protein-Hydrogel ist sehr staBLE in wässriger Lösung mit wenig bis gar keinem nachweisbaren Erosion nach 3 Monaten bei Raumtemperatur. Stabilität in einem weiten pH-Bereich (6-10) und Temperaturen (4-50 ° C) gehalten wird, und das Hydrogel auch mit organischen Lösungsmitteln kompatibel. Das grün fluoreszierende Protein (GFP) und Meerrettich-Peroxidase (HRP): Dieses Hydrogel wird zur Immobilisierung von zwei globulären Proteinen verwendet. Hydrogel Einschließen des letzteren Proteins verwendet wird, um die Biokatalyse in einem organischen Lösungsmittel durchzuführen.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:541px;" width="541">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Name 
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Catalog Number
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:23px;">
			Phusion High Fidelity DNA polymerase
			</td>
			<td style="width:111px;height:23px;">
			New England BioLabs
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:23px;">
			M0530S
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:23px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Competent Escherichia coli BL21 (DE3)
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			New England BioLabs
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			C2527I
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Luria Bertani
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			90003-350
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Bacto Agar Media
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			<a href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=90000-760">90000-760</a>
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			kanamycin sulfate
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			<a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=97061-602">97061-602</a>
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			IPTG
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-5820
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Imidazole
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-5720
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Urea
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-9510
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Dithiothreitol (DTT)
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			BP172-5
			</td>
			<td style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Protease Inhibitor cocktail
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			11836153001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			DPBS
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			82020-066
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Brilliant Blue R
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Acros Organics
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			A0297990
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Sodium Azide
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC190380050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Horseradish peroxidase
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			P8125-5KU
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			N,N-dimethyl-p-phenylene diamine
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC408460250
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			phenol
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC149340500
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			tert-butyl hydroperoxide
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC180340050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			n-heptane
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Acros Organics
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			120340010
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;"></td>
			<td style="width:111px;height:21px;"></td>
			<td style="width:118px;height:21px;"></td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Shaker/Incubator
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Max Q 6000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Centrifuge
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Sorvall
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			RC 6
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Sonicator
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			QSonica
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Misonix 200
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Ultrafiltration Tubes
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Amicon Ultra
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			UFC903024
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			&#160;Ni Sepharose High Performance HisTrap column
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			GE Healthcare Life Sciences
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			17-5248-01
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			GE Healthcare Life Sciences
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			17-5156-01
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Plate reader
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Molecular Devices
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			SpectraMax Gemini EM
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of an intein-mediated artificial protein hydrogel

Wir präsentieren die Synthese eines hochstabilen Protein-Hydrogel von einem Split-Intein-katalysierte Protein Transspleißreaktion vermittelt. Die Bausteine ​​dieser Hydrogel zwei Protein-Blockcopolymere jeweils eine Untereinheit eines trimeren Protein, das als Vernetzer und eine Hälfte eines getrennten Inteins dient enthält. Ein stark hydrophiler Zufallsspule in einem der Blockcopolymere für die Wasserrückhaltung eingesetzt. Mischen der beiden Protein-Blockcopolymere löst eine Intein Transspleißreaktion, wodurch ein Polypeptid mit Vernetzern Einheit an jedem Ende, die schnell Selbstorganisation zu einem Hydrogel. Dieses Hydrogel ist sehr stabil unter sauren und basischen Bedingungen bei Temperaturen bis zu 50 ° C, und in organischen Lösungsmitteln. Das Hydrogel rasch Reformen nach scherinduzierten Bruch. Einbau einer &quot;Dockingstation Peptid&quot; in das Hydrogel Baustein ermöglicht die komfortable Einbindung von Tagged-Zielproteine ​​&quot;Docking-Protein&quot;.Das Hydrogel wird mit Gewebekulturwachstumsmedium kompatibel ist, unterstützt die Diffusion von 20 kDa Moleküle und ermöglicht die Immobilisierung von bioaktiven globulären Proteinen. Die Anwendung der Intein-vermittelten Protein-Hydrogel nach einem organischem Lösungsmittel kompatibel Biokatalysator wurde durch Einkapseln des Meerrettich-Peroxidase-Enzym und erhärten seine Aktivität nachgewiesen.

Ein Schema für Intein-vermittelten Protein-Hydrogel-Bildung ist in Fig. 1A dargestellt. Die Bausteine ​​des Hydrogels sind die Protein-Copolymere CUTA NpuN (N) und NpuC-S-CUTA (C) (Fig. 1A, Tabelle 1). NpuN / C sind die N-/C-fragments der natürlich aufgeteilt DnaE Intein aus Nostoc punctiforme (Npu). CUTA ist eine stabile trimere Protein aus Pyrococcus horikoshii 4,5. Mischen von gereinigtem N und C in Gegenwart des Reduktionsmittels DTT induziert die Bildung v...

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Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Wir stellen die Synthese eines Split-Intein-vermittelten Protein-Hydrogel. Die Bausteine ​​dieser Hydrogel zwei Copolymeren, die jeweils eine Protein-Untereinheit eines trimeren Protein, das als Vernetzer und eine Hälfte eines getrennten Inteins dient enthält. Das Mischen der beiden Protein-Copolymere löst eine Intein Transspleißreaktion, wodurch ein Polypeptid Einheit, die Selbstorganisation zu einem Hydrogel. Dieses Hydrogel ist stark pH-und temperaturstabil mit organischen Lösungsmitteln kompatibel sind und leicht integriert funktionellen globulären Proteinen.

Synthese einer Intein-vermittelten Protein-Hydrogel Künstliche

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

synthesis-of-an-intein-mediated-artificial-protein-hydrogel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.0K Aufrufe.  Texas A&M University, College Station.  Wir stellen die Synthese eines Split-Intein-vermittelten Protein-Hydrogel. Die Bausteine ​​dieser Hydrogel zwei Copolymeren, die jeweils eine Protein-Untereinheit eines trimeren Protein, das als Vernetzer und eine Hälfte eines getrennten Inteins dient enthält. Das Mischen der beiden Protein-Copolymere löst eine Intein Transspleißreaktion, wodurch ein Polypeptid Einheit, die Selbstorganisation zu einem Hydrogel. Dieses Hydrogel ist stark pH-und temperatur...

Serie: Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Synthesis, Assembly und Charakterisierung von Monolayer Protected Gold-Nanopartikeln Films für die Protein-Monoschicht Elektrochemie

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Forschung

Biotechnik

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Kombinatorische Synthese von und High-Throughput-Protein Release von Polymer Film-und Nanopartikel-Bibliotheken

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

Eine injizierbare and Drug belasteten supramolekulares Hydrogel für Lokale Catheter Injection in die Pig Herz

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Synthese von infektiösen Bakteriophagen in einem E. Coli -basierte zellfreie Expressionssystems

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels have simple monolithic architectures and often function as scaffolding materials for tissue engineering applications. More sophisticated structures typically take a long time to fabricate and do not contain moving components. This protocol describes a photolithography method that allows for facile and rapid microfabrication of PEG structures and devices. This strategy involves an in-house developed fabrication stage that allows for the rapid fabrication of 3D structures by building upwards in a layer-by-layer fashion. Independent moving components can also be aligned and assembled onto support structures to form integrated devices. These independent components are doped with superparamagnetic iron oxide nanoparticles that are sensitive to magnetic actuation. In this manner, the fabricated devices can be actuated using external magnets to yield movement of the components within. Hence, this technique allows for the fabrication of sophisticated MEMS-like devices (micromachines) that are composed entirely out of a biocompatible hydrogel, able to function without an onboard power source, and respond to a contact-less method of actuation. This manuscript describes the fabrication of both the fabrication set-up as well as the step-by-step method for the microfabrication of these hydrogels-based MEMS-like devices.

An additive manufacturing strategy for processing UV-crosslinkable hydrogels has been developed. This strategy allows for the layer-by-layer assembly of microfabricated hydrogel structures as well as the assembly of independent components, yielding integrated devices containing moving components that are responsive to magnetic actuation.

Zusatzstoff Herstellungstechnik für die einfache und schnelle Herstellung von Hydrogel-basierte Micromachines mit magnetisch reagieren Komponenten

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Herstellung eines Multiplex künstliche zellulären Mikroumgebung Arrays

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These issues represent drawbacks in workflows that can ultimately result in irreproducibility of research findings. Manual-based workflows are further limiting the advancement and widespread adoption of viscous materials, such as hydrogels used for biomedical applications. These challenges can be overcome by using automated workflows with standardized mixing processes to increase reproducibility. In this study, we present step-by-step instructions to use an open source protocol designer, to operate an open source workstation, and to identify reproducible mixtures. Specifically, the open source protocol designer guides the user through the experimental parameter selection and generates a ready-to-use protocol code to operate the workstation. This workstation is optimized for pipetting of viscous materials to enable automated and highly reliable handling by the integration of temperature docks for thermoresponsive materials, positive displacement pipettes for viscous materials, and an optional tip touch dock to remove excess material from the pipette tip. The validation and verification of mixtures are performed by a fast and inexpensive absorbance measurement of Orange G. This protocol presents results to obtain 80% (v/v) glycerol mixtures, a dilution series for gelatin methacryloyl (GelMA), and double network hydrogels of 5% (w/v) GelMA and 2% (w/v) alginate. A troubleshooting guide is included to support users with protocol adoption. The described workflow can be broadly applied to a number of viscous materials to generate user-defined concentrations in an automated fashion.

This protocol serves as a comprehensive tutorial for standardized and reproducible mixing of viscous materials with a novel open source automation technology. Detailed instructions are provided on the operation of a newly developed open source workstation, the usage of an open source protocol designer, and the validation and verification to identify reproducible mixtures.

Eine Open-Source-Technologieplattform zur automatisierten und standardisierten Herstellung von Hydrogel-basierten 3D-Kulturmodellen

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.

Von der Zelle zur zellfreien Proteinsynthese innerhalb von 24 Stunden mit zellfreiem Autoinduktions-Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates

Cell-free protein synthesis (CFPS) has recently become very popular in the field of synthetic biology due to its numerous advantages. Using linear DNA templates for CFPS will further enable the technology to reach its full potential, decreasing the experimental time by eliminating the steps of cloning, transformation, and plasmid extraction. Linear DNA can be rapidly and easily amplified by PCR to obtain high concentrations of the template, avoiding potential in vivo expression toxicity. However, linear DNA templates are rapidly degraded by exonucleases that are naturally present in the cell extracts. There are several strategies that have been proposed to tackle this problem, such as adding nuclease inhibitors or chemical modification of linear DNA ends for protection. All these strategies cost extra time and resources and are yet to obtain near-plasmid levels of protein expression. A detailed protocol for an alternative strategy is presented here for using linear DNA templates for CFPS. By using cell extracts from exonuclease-deficient knockout cells, linear DNA templates remain intact without requiring any end-modifications. We present the preparation steps of cell lysate from Escherichia coli BL21 Rosetta2 &#916;recBCD strain by sonication lysis and buffer calibration for Mg-glutamate (Mg-glu) and K-glutamate (K-glu) specifically for linear DNA. This method is able to achieve protein expression levels comparable to that from plasmid DNA in E. coli CFPS.

Presented here is a protocol for the preparation and buffer calibration of cell extracts from exonuclease V knockout strains of Escherichia coli BL21 Rosetta2 (&#916;recBCD and &#916;recB). This is a fast, easy, and direct approach for expression in cell-free protein synthesis systems using linear DNA templates.

Zellfreie Proteinsynthese aus Exonuklease-defizienten Zellextrakten unter Verwendung linearer DNA-Vorlagen

Cell-free protein synthesis (CFPS) has recently become very popular in the field of synthetic biology due to its numerous advantages. Using linear DNA ...