Diese Arbeit wurde durch ein RO1 von NIH und Merit Bewertungen aus der VA Research Service nach C-MT unterstützt, und eine individuelle NRSA auf CWL

Allgemeine Überlegungen zum Entwurf Wenn die Wellenlänge des Foto Stimulation ist im sichtbaren Bereich, wie zum optogenetische Experimente, wird das Layout des Systems wesentlich einfacher als für UV-Photolyse-Experimenten. Man braucht nur ein Dual-Kamera-Anschluss-Modul, das zur Verfügung von allen Mikroskop Unternehmen zu erwerben. Die DMD-Ebene kann die konjugierte Bildebene entweder eine der beiden Kamera-Ports platziert werden. Aber in UV-Photolyse das Licht aus dem DMD muss durch die Auflicht-Pfad (Abb. 3A) gebracht werden, weil die Bildgebung Tubuslinse was zu der Kamera ist nicht für die UV-Wellenlänge in einem der im Handel erhältlichen Mikroskope korrigiert. Die sphärische Aberration der Bildgebung Tubuslinse bei 350 nm ist stark genug, um die Fähigkeit, Licht zu einem festen Punkt zu konzentrieren und ausreichende räumliche Auflösung zu erzeugen verhindern. Dieses Problem ist nicht in der konfokalen Mikroskopie gestoßen, weil das Rohr Linse entfernt wird, wenn einem kollimierten Laserstrahl wird in auf der gleichen optischen Achse gebracht. Das Problem der UV-Beleuchtung kann durch zu bringen in das Licht durch die epi-Fluoreszenz-Weg gelöst werden, weil die Tubuslinsen es alle sind teilweise für die sphärische Aberration bei einer UV-Wellenlänge korrigiert. Wir können uns auf die Optik des Mikroskops zu irgendeinem Grad der Zeitschrift Wünschen zu erweitern. Die wissenschaftliche Gemeinschaft ist in der Regel schnell Interesse an diesem Thema und es gibt nicht viele Quellen, die sie lehrt gut. Um Änderungen des Mikroskops zu minimieren und wegen der engen Platzverhältnisse an der Epi-Fluoreszenz-Einheit, wird die DMD bei einem neu erstellten Konjugat Bildebene durch eine Relais-Linse (Punkt die Position des DMD-Einheit in Bezug auf die erstellte platziert Mikroskop). Eine kommerzielle UV korrigiert Relais-Linse gekauft wurde (Specialty Optics) (Stelle in der Grafik und am Mikroskop). Illumination des DMD Nach Erhalt ihrer Binäreingang Mikrospiegel können zwischen einer positiven und einer negativen 12 ° Neigung relativ zur Ebene des Chips wechseln. Die Drehachse ist entlang der diagonalen Ecken jedes Spiegels (45 ° zu den Seiten des Chips). Die Ausrichtung der Spiegel Rotation wird durch eine goldfarbene Dreieck an einer Ecke auf der Vorderseite des Chips bezeichnet. Der Neigungswinkel der Mikrospiegel bestimmt die Ausrichtung der Tonhöhe und azithmus der eingehenden Beleuchtungsstrahlengang. Die Tonhöhe des Beleuchtungsstrahlengang Bedürfnisse zu 24 ° von der senkrechten Achse des DMD-Chip und azithmus muss senkrecht zur Achse der Spiegel Rotation sein. Präzise Strahlausrichtung ist von entscheidender Bedeutung für einen effizienten Betrieb. In der Prototyp-System entwickelten wir mehrfache manuelle Neigung Anpassungen, die wir für die Konstruktion und Bearbeitung Unzulänglichkeiten zu korrigieren erlaubt. Dies führte zu einem System, das wesentlich sperriger als nötig ist. Alternate, kompaktere Anordnung für die Erhebung in das Licht möglich ist (zeigen alternative Design, wenn als nützlich erachtet werden). Für Photolyse-Experimenten eine Laserquelle ist erforderlich, um zu erzeugen die hohe Lichtintensität fokussierten Strahl, die für eine schnelle Uncaging. Für optogenetische Experimente, in denen mit hoher Intensität scharf fokussiertem Licht nicht erforderlich ist, würde ein nicht-kohärenten Lichtquelle ausreichend sein. In der Photolyse hier beschriebenen Experiment verwendeten wir eine quasi-kontinuierliche diodengepumpten Festkörper (DPSS) Frequenz verdreifacht NdVO4 Laser (1 W, 355 nm). (Für eine ausführliche Diskussion über die Wahl von Lichtquellen für die Photolyse siehe Referenz 2). Ein relativ hoher Power-Laser ist in den hier beschriebenen Experimenten erforderlich, da nur ein kleiner Bruchteil der Laserleistung ist eigentlich auf die Probe abgegeben, wenn mit einem DMD-System. Die Menge des Lichts geliefert, die Probe ist proportional zum Verhältnis der Anzahl der ON / OFF Spiegel innerhalb der Region durch den Laserstrahl beleuchtet. Wenn ein Laser-Lichtquelle benötigt wird, ist es am besten auf den Ausgang des Lasers in eine Multimode-Faser zu starten, so dass es leicht Position und orientiert an der richtigen Achse zur Beleuchtung des DMD kann. Die Übertragung des Lichts durch die Glasfaser löst ein zweites Problem, wie die Speckle-Muster inhärent kohärenten Beleuchtung zu beseitigen. Die Faser ist um einen piezoelektrischen Fasern Keilrahmen (Modell 915, Canadian Instrumentation &amp; Research, Ltd), die bei ~ 40 kHz schwingt Wunde. (Punkt dieser in das Rigg) Die mikroskopische Dehnung der Faser ist ausreichend, um bewegt sich der Speckle-Muster viele Male während der Millisekunden für jedes Foto Stimulationsimpulses, so wirkungsvoll eliminiert die Wirkung von Bildrauschen. Der Ausgang der optischen Faser wird anschließend mit einer UV-Mikroskop-Objektiv (Olympus DApo20UV) kollimiert. (Punkt dieser out) Eine Kalibrierung des optischen Auflösung des Systems ist in Abb.. 3B. Die effektive physiologische Auflösung durch die Amplitude des Stromflusses in Abhängigkeit von der Position des Flecks von Foto gemessenStimulation ist in Abb.. 3C. Aktuelle Antworten auf Photostimulation verschiedener Intensitäten sind in Abb. dargestellt. 3D. Der Betrieb des Systems: Co-Registrierung der CCD-Pixel mit der DMD-Spiegel Eine Inhouse-Software geschrieben wurde, der bestimmt, die Korrespondenz der einzelnen DMD-Spiegel auf bestimmte Pixel des Imaging-CCD-Kamera. Die grafische Benutzeroberfläche (GUI) innerhalb dieser Software erlaubt es dem Benutzer, die DMD-Spiegel, die in der Region entspricht auf der CCD-Bildsensor mit der Maus markiert zuweisen. So kann die Location für Foto-Stimulation durch einfaches Bewegen Sie den Cursor über das Bild auf dem Computerbildschirm angezeigt und auf den markierten Bereich von Interesse markiert werden. (A Fluoreszenzbild eines dendritischen Dorn wird auf dem Bildschirm angezeigt werden. Studenten werden eine Reihe von Standorten auf das Bild auf dem Bildschirm zu markieren.) Die Programmierung der Muster für leichte Lieferwagen Das Muster auf dem Bildschirm durch den Betreiber markiert ist als eine Reihe von einzelnen Bildern gespeichert. Der Zeitpunkt der Laserpulse für jede räumliche Muster wird dann in die Software, die mit der Datenerfassung Programm (pClamp) integriert ist programmiert. (Demonstrieren). Die Koordination der Laserpulse auf die DMD-Muster Die Datenerfassung Programm initiiert und koordiniert das Timing der DMD-Elektronik, die Verknüpfung der Laser und der Übernahme der Patch gespannt elektrisches Signal aus dem Ziel-Neuron. (Simulation dieser Reihenfolge auf dem Computer) Experimentelle Daten: Non-lineare Summation über distalen dendritischen Verzweigungen Dendritische Integration mit Elektroden wurde traditionell durch Variation der Amplitude der Stimulation an diskreten Stellen, anstatt den Ausbau im Bereich der Stimulation bei gleichzeitig konstanter Intensität durchgeführt. Fragen in Bezug auf Sättigung electrogenesis und Rekrutierung von ortsabhängigen Kanäle können das Ergebnis beeinflussen und zum Abschluss. Distributed dendritischen Stimulation kann leicht implementiert werden mit einem DMD-basiertes System (Abb. 4A). Eingang Intensität wurde durch die Erhöhung der Anzahl der Punkte von Photostimulation vielfältig. Wir können sehen, dass die räumliche Summation kann nicht linear Verzweigungspunkte zunehmend supra-linear mit zunehmender Eingangsamplituden Ankunft auf die beiden Tochterzellen Filialen. Die supra-Linearität ist weitgehend NMDA-Rezeptoren vermittelt und nicht auf gated-Kanäle (Abb. 5) Spannung Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Bedienung der Mikrospiegel in die DMD. (Seitenansicht) Elektrostatische Kräfte an einzelnen Spiegel gerichtet sind, verursachen den Spiegel in eine von zwei möglichen Orientierungen 12 ° von der Horizontalen gekippt werden. In der ON-Position einen einfallenden Strahl entlang der optischen Achse senkrecht des Chips geleitet. In der OFF-Position des einfallenden Strahls ist 48 ° off axis gerichtet. Licht, das die dünne Lücken zwischen den Spiegeln Hits 24 ° off axis gerichtet. (Ansicht von oben) die Neigung ist 45 ° in Bezug auf den Seiten des Spiegel und Chip. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Grundaufbau des modernen Fluoreszenzmikroskop. Der Filter Würfel ist in der &quot;Unendlichen Raum&quot; zwischen dem Objektiv und der Tubuslinse positioniert. Es ist ein bildgebendes Weg, um die Kamera führt, und es gibt eine Beleuchtung Weg, der das Licht bringt, um die Probe. Die Tubuslinse für diese beiden Lichtweg sind in der Regel verschiedene in Design und in der Brennweite. Die Beleuchtung, nicht aber die Bildgebung ist Tubuslinse für den Betrieb im UV-Spektrum entwickelt. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Layout für UV basiert DMD-System. Ist die Beleuchtung in der UV-Spektrum, dann muss es durch das Rohr Objektiv, das für UV korrigiert gebracht werden. Die Tubuslinse in der Imaging-Pfad ist nicht für UV konzipiert. Ein Relais ist erforderlich, um eine leicht zugängliche Konjugat Bildebene erzeugen. Die verschiedenen konjugierten Bildebenen in das Mikroskop ist durch gestrichelte rote Linien markiert. Helle Muster in einer Bildebene sind in anderen konjugierten Ebenen projiziert. Während die Abbildung des Musters in der Probe Flugzeug ist auf dem Detektor / Kamera projiziert. Für die Beleuchtung des Musters von der DMD erzeugt wird auf die Probe projiziert. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Layout für sichtbares Licht DMD-Projektionssystem. Wenn die Beleuchtung Licht im sichtbaren Bereich, ist es möglich, die DMD erzeugten Lichtmuster durch die Bildgebung Lichtweg zu bringen. Dies kann leicht mit commerci umgesetzt werdenal Dual Kamera-Port-Anhänge und die entsprechende dichroitische Spiegel. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Laterale Auflösung des Systems. (A) Optische Auflösung auf fluoreszierende Ziel ist ~ 2 um. (B) Effektive Auflösung als durch Photolyse von caged Glutamat über eine Dendriten gemessen ~ 5 um. Die erhöhte Abstand wird durch eine Kombination von Diffusion von Glutamat und die endliche Breite des Dendriten. (C) Photolyse imitieren kann die Kinetik der synaptischen Ereignisse. Die Familie der Spannung geklemmt aktuelle Antworten ist aufgrund von Variationen in der Lichtenergie geliefert, die Dendriten. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Nichtlineare Summation über dendritischen Verzweigungen. (A) Distributed-Eingänge sind mit zwei dendritischen Verzweigungen gesondert angewandt. Ihre jeweilige Spannung Reaktionen sind unten dargestellt. (B) Die Reize werden dann gleichzeitig gegeben. Die gemessene Reaktionszeit (rote Kurve) ist anders als die arithmetische Summe der beiden einzelnen Reaktionen (graue Kurve). <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Supralinear Summation NMDA-Rezeptor-abhängige. (A) APV, blockiert eine selektive NMDA-Rezeptor-Antagonist der supralinear Summation. (B) Die Reizintensität Beziehung und ihre Empfindlichkeit gegenüber NMDA-Rezeptor-Antagonist aufgetragen ist.

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	<li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930-939 (2009).</li><li>Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+caged+neurotransmitters:+Theory+and+procedures+for+light+delivery.">Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+Technology+Feature,+Cell+imaging:+Light+activated.">Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated.</a> Nature. 456, 826-827 (2008).</li><li>Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+photolysis+of+caged+neurotransmitters.">Holographic photolysis of caged neurotransmitters.</a> Nature Methods. 5, 821-827 (2008).</li><li>Hornbeck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Digital Light Processing and MEMs: An overview. , .</li></ol>

Der Vorteil der DMD basiert Photostimulation Ansatz zeigt sich besonders deutlich in Situationen, wo das Ziel liegt in einem relativ großen Bereich. Wenn das Ziel von Interesse ist sehr klein, wie ein paar dendritische Dornen, sind sequentielle konfokalen und 2-Photonen-Systeme wahrscheinlich der bessere Ansatz sein. Eine wesentliche Schwäche des DMD-Ansatz ist die ineffiziente Nutzung der verfügbaren Licht. Der Großteil der verfügbaren Licht ist unbedingt auf die OFF Spiegel gerichtet und nicht verwendet. <p c...

Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

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<tr>
<td>Modern upright fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD camera and image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and data acquisition/interface system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DLP Discovery Developer Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ALP3 USB interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S2 + Optics w/LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dual camera port unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DPSS Laser Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser shutter Model LS6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canadian Instrument and Research, Ltd </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100 um core multimode fiber</td>
</tr>
<tr>
<td>Multimode Fiber launcher </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Oz Optics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Signal generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>up to 50 kHz</td>
</tr>
<tr>
<td>Beam collimator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>DApo20UV340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UV relay lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Special Optics</td>
<td>#: 54-25-60-355</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

patterned photostimulation with digital micromirror devices to investigate dendritic integration across branch points

Licht ist eine vielseitige und präzise Mittel, um die neuronale Erregbarkeit zu steuern. Die kürzlich erfolgte Einführung von lichtempfindlichen Effektoren wie Kanal-Rhodopsin und eingesperrt Neurotransmitter haben Interesse an der Entwicklung besseres Mittel, um Muster von Licht in Raum und Zeit, die nützlich für experimentelle Neurowissenschaften geführt hat. Eine herkömmliche Strategie, in der konfokalen und 2-Photonen-Mikroskopie verwendet wird, ist, um Licht zu einem beugungsbegrenzten Spot-Fokus und scannen Sie dann, dass einzelne Fleck nacheinander über die Region von Interesse. Dieser Ansatz wird problematisch, wenn große Flächen in kurzer Zeitfenster, ein Problem mehr für Photostimulation als für die Bildgebung stimuliert werden müssen. Eine alternative Strategie besteht darin, die komplette räumliche Muster auf das Ziel mit Hilfe eines digitalen Mikrospiegel (DMD)-Projekt. Die DMD-Ansatz ist attraktiv, weil die Hardware-Komponenten relativ günstig sind und von kommerziellen Interessen unterstützt. Da ein solches System ist nicht für aufrechte Mikroskope zur Verfügung, werden wir die kritischen Fragen in den Bau und Betrieb eines solchen DMD-System. Obwohl wir in erster Linie beschreibt den Aufbau des Systems für die UV-Photolyse, werden die Änderungen für den Bau der viel einfachere sichtbares Licht für optogenetische Experimente vorgesehen sein. Die UV-Photolyse-System verwendet wurde, um Experimente carryout um eine grundsätzliche Frage in den Neurowissenschaften studieren, sind, wie räumlich-Eingänge über distalen dendritischen Verzweigungen integriert verteilt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Integration kann nicht linear Verzweigungspunkte und der supralinearity wird weitgehend durch NMDA-Rezeptoren vermittelt.

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Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Digitale Mikrospiegel-Geräte (DMD) generieren können komplexe Muster in Raum und Zeit, mit der neuronalen Erregbarkeit zu steuern. Fragen, die für die Planung, den Bau und Betrieb von DMD Systeme diskutiert. Ein solches System ermöglicht den Nachweis von nicht-linearen Integration in distalen dendritischen Verzweigungen.

Gemusterte Photostimulation mit Digital Micromirror Devices auf Dendritische Integration über Verzweigungspunkte Untersuchen

Light is a versatile and precise means to control neuronal excitability. The recent introduction of light sensitive effectors such as channel-rhodopsin ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.5K Aufrufe.  University of Maryland School of Medicine. Digitale Mikrospiegel-Geräte (DMD) generieren können komplexe Muster in Raum und Zeit, mit der neuronalen Erregbarkeit zu steuern. Fragen, die für die Planung, den Bau und Betrieb von DMD Systeme diskutiert. Ein solches System ermöglicht den Nachweis von nicht-linearen Integration in distalen dendritischen Verzweigungen.

Serie: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Forschung

Biotechnik

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Die Herstellung einer funktionalisierter magnetischer bakterielle Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikel

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

Die Herstellung von Baumwolle Analytische Geräte

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Mit Adhesive Patterning 3D Paper Mikrofluidik-Vorrichtungen bauen

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

Eine experimentelle und Finite-Elemente-Protokoll den Transport von neutralen und geladenen gelösten Stoffen durch Gelenkknorpel zur Untersuchung

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable microfluidic devices. Here, a protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices is demonstrated, where soft lithographic techniques are used to embed transparent Calcium Fluoride (CaF2) view-ports in connection with observation chamber(s). The method is based on a replica casting approach, where a polydimethylsiloxane (PDMS) mold is produced through standard lithographic procedures and then used as the template to produce a plastic device. The plastic device features ultraviolet/visible/infrared (UV/Vis/IR) -transparent windows made of CaF2 to allow for direct observation with visible and IR light. The advantages of the proposed method include: a reduced need for accessing a clean room micro-fabrication facility, multiple view-ports, an easy and versatile connection to an external pumping system through the plastic body, flexibility of the design, e.g., open/closed channels configuration, and the possibility to add sophisticated features such as nanoporous membranes.

A protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices with transparent view-ports for visible and infrared light imaging is described.

Weichen lithografischen Verfahren zur Herstellung von Kunststoff mikrofluidischen Geräte mit Ansicht-Ports für sichtbaren und infraroten Licht durchlässig

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

Calorespirometry: Eine starke, nicht-invasive Ansatz zur zellulären Energiestoffwechsel untersuchen

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Hochauflösende gemustert Biofilm Abscheidung mittels pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...