Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Howard Hughes Medical Institute und der National Science Foundation zu RG, und die Mittel, um SM von den National Institutes of Health (Grants R01-HL98416) und der American Heart Association (Zuschuss 09BGIA2450014) ausgezeichnet unterstützt.

1. Kultivieren einer Zellmonolayer in Transwell-Einsätze <ol><li> In einem sterilen, Sicherheitsstufe 2 Zellkultur Kapuze, legen 0,8 mm Poren PET Transwell-Einsätze in eine 24-Well-Platte (4 Wells pro Bedingung für statistische Signifikanz) mit einer Pinzette. Alle Materialien in die Abzugshaube mit Ethanol sterilisiert werden. </li></ol> Hinweis: Die Porengröße der Filter muss in Übereinstimmung zu der mittleren Größe der verwendeten NC ausgewählt werden, um den Transport durch die Membran zu ermöglichen. Auch für statistisch signifikante Ergebnisse zu jeder experimentellen Bedingung erfordert ein Minimum von vier Wiederholungen (Vertiefungen) in dem gleichen Experiment, und mindestens 3 unabhängigen Experimenten. <ol start="2"><li> Vorbereitung Zellkulturmedium, das DMEM-Medium mit 4,5 g / l Glucose, 15% fötalem Rinderserum und 1% Pen-Strep ergänzt und Hitze auf 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Verdünnen humanen epithelialen kolorektalen Adenokarzinom (Caco-2-Zellen) in Zellmedium und Ort200-400 ul der Zell-Lösung in die obere (apikale) Kammer des Transwell-Einsatzes, bei einer Dichte von 1,5 x 10 5 Zellen / cm 2. Füllen Sie den unteren (basolateralen) Kammer mit 700 bis 900 ul Zellmedium. </li><li> Kulturzellen bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit für 16-21 Tage, Ersetzen des Mediums in der oberen und unteren Kammer alle 3-4 Tage unter Verwendung der in Schritt 1.3 angegebenen Mengen. Medium ersetzen in der folgenden Reihenfolge, um den Druck oben (statt unten) die Zellmonolayer zu erhalten: saugen das Medium aus der unteren Kammer, saugen das Medium aus der oberen Kammer, die obere Kammer mit frischem Medium zu füllen, und die untere Kammer mit füllen frisches Medium. </li></ol> 2. Validierung des GI Epithelial Durchlässigkeit Barrier Mit transepitheliale Elektrischer Widerstand (TEER) und Immunfärbung von Tight Junctions <ol><li> Für Kurzzeitspeicher (weniger als 2 Wochen), tauchen STX100 Elektroden in einem Elektrolyt Lösungennung (0,1-0,15 M KCl oder NaCl). Verbinden des Elektrodenkabels an den Anschluss auf der Elektrode EVOM Volt-Ohm-Meter, so dass das System intern kurzgeschlossen wird und die Elektrode Symmetrie beibehalten wird. Für langfristige Lagerung, spülen Sie mit dH 2 O und an einem trockenen, dunklen Zustand. </li><li> Um die Elektroden zu sterilisieren, tauchen in Ethanol für 15 min und an der Luft trocknen für 15 Sekunden. Alternativ können die Elektroden in einem UV-Haube gelagert werden. Spülen Sie die Elektroden in eine sterile Elektrolytlösung (Phosphatpuffer Kochsalzlösung, PBS) oder 0,1-0,15 M KCl oder NaCl-Lösung, vor jeder Widerstandsmessung. </li><li> Mit dem Volt-Ohm-Meter an den Widerstandseinstellung gesetzt, vertikal platzieren Elektroden in eine gut mit der Transwell-Einsatz, mit der kurzen Elektrode in der oberen Kammer und der langen Elektrode in der unteren Kammer zu berühren den Boden des Brunnens. Sobald die EVOM Wert fest den Widerstandswert (in Ohm angegeben; Ω) für jeden gut. </li><li> Berechnen Widerstand (resistanCE Bereich normalisiert; Ω × cm 2) der Proben durch Subtrahieren Hintergrund Widerstand (TEER von Transwell-Einsätze ohne Zellen) und Multiplizieren mit der Membranoberfläche. Widerstandswerte werden am häufigsten in der Literatur berichtet. (Siehe Diskussion) </li><li> Wiederholungsmessungen alle 1-2 Tage bis TEER-Werte zu einem Maximum und Plateau, was die Bildung der Permeabilitätsbarriere, was typischerweise 2-3 Wochen ab dem Zeitpunkt der Zell Flechten. Plateau TEER-Werte und Zeit notwendig, um die Integrität der Barriere erreichen können je nach Zellpassage Zahl variieren. </li><li> Um die Gegenwart von Tight Junctions in der Zellmonoschichten mit hoher TEER (gleich oder höher als der Schwellenwert für die Barrierebildung) Verifizierung fixieren Zellen durch Inkubation mit kaltem 2% igem Paraformaldehyd für 15 min. Dann waschen Zellen mit PBS und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur mit 1 &amp;mgr; g / ml Anti-Occludin. Waschen der Zellen einmal mit PBS und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur mit 7,5 ug / ml fluorescently-markierten Sekundärantikörper. Verwenden Brunnen mit niedrigen TEER als negative Kontrolle für barriere Bildung. </li></ol> Anmerkung: Als Ersatz für Anti-Occludin-Antikörper können alternativ zu tight junction-Proteine ​​verwendet werden. <ol start="7"><li> Vorsichtig herausschneiden der Filtermembran, auf dem die Festmonoschicht angebracht ist, und montieren Sie auf Objektträger für die Bildgebung mit Epi-Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie. </li></ol> 3. Auswertung transepitheliale Transport Gezielte Carriers <ol><li> Beschriftung der Targeting-Antikörper (Maus-monoklonalen Antikörper gegen ICAM-1, anti-ICAM, in diesem Beispiel) mit 125 I, wie zuvor beschrieben 7. Bradford-Test verwenden, um die Proteinkonzentration und eines Gammazählers, um zu ermitteln 125 I Inhalt des Antikörpers zu bestimmen, dann die Berechnung der spezifischen Aktivität in Zählungen pro Minute (CPM) / mg eines markierten Antikörpers. </li></ol> Hinweis: Um die Spezifität zu kontrollieren, wiederTorf, das Verfahren durch Kennzeichnung Maus-IgG, die verwendet werden, um nicht gezielte beschichteten NCs bereiten wird. Um den Transport eines therapeutischen Fracht zu untersuchen, in diesem Beispiel das Verfahren wiederholen Beschriftung der Ladung, zB alpha-Galactosidase (α-Gal). Alternativen können für das Targeting-Mittel, nicht-spezifische Kontrolle oder therapeutische Ladung verwendet werden. Alternative Verfahren können ebenfalls verwendet werden, um Verbindungen zu kennzeichnen und die Schätzung der Konzentration des markierten Gegenstücken sein. <ol start="2"><li> Paare der markierte Targeting-Antikörper (anti-ICAM in unserem Beispiel) auf die Oberfläche der Nanokristalle. In diesem Beispiel inkubieren Polystyrol Nanokügelchen (100 nm Durchmesser) 1 h bei Raumtemperatur mit 125 I-Anti-ICAM zu Oberfläche Adsorption zu ermöglichen, wie beschrieben 7. </li></ol> Hinweis: Für die nicht-spezifische Steuerung verwenden 125 I-IgG. Um den Transport einer Ladung verfolgen, verwenden eine Kombination von Targeting-Antikörper und 125 I-markiertem Ladung (α-Gal in unserem Beispiel). <ol start="3"><li> Zentrifugieren bei 13.000 g für 3 min und entfernen Sie die nicht-beschichteten Pendants in den Überstand durch Aspiration. Das Pellet enthält, beschichteten NCs mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS durch Pipettieren und beschallen bei geringer Leistung, um mögliche Partikel-Aggregate (20-30 kurze Impulse) zu stören. </li><li> Für NC-Charakterisierung, messen Größe, Polydispersität und ζ-Potential der beschichteten Partikel mittels dynamischer Lichtstreuung (nach Anbieter Anweisungen) und quantifizieren die Anzahl der 125 I-markierten Targeting-Antikörper-Moleküle (zB Anti-ICAM) auf der Partikeloberfläche mit einer Gamma-Zähler. </li></ol> Anmerkung: Diese Methoden können für die unspezifische und therapeutischen Gegen wiederholt werden. Die Größe der beschichteten Teilchen im Bereich um 200 nm auf. <ol start="5"><li> Add 125 I-Antikörper NCs (zB 125 I-Anti-ICAM NCs, 56 nCi / ml) in die obere Kammer oberhalb konfluenten Caco-2-Monoschichten mit TEER &amp;# 8805; 350 Ω x cm 2 (siehe Diskussion) über Hintergrund (16-21 Tage nach der Aussaat). Inkubieren bei 37 ° C für eine oder mehrere gewünschte Zeitintervalle. Messen TEER (Abschnitt 2.3) vor und nach Inkubation, um die Auswirkungen von Nanokristallen auf der Permeabilitätsbarriere beurteilen. </li></ol> Hinweis: Dieses Verfahren kann für die unspezifische und therapeutischen Gegen wiederholt werden. <ol start="6"><li> Sammeln Sie das Medium aus den oberen und unteren Kammern und einmal waschen Sie sie mit 0,5 ml DMEM bei 37 ° C (obere Kammer) oder 1 ml dH 2 O (untere Kammer). Sammeln Sie die Waschanlagen für die Messung der Gesamtradioisotop Inhalt mit einem Gamma-Zähler. </li><li> Zur Messung der Zellfraktion, die auszuschneiden lässigen Filter, z. B. mit einer Rasierklinge um die Kanten geschnitten, und Inkubieren in einem Gamma-Zählrohr mit 1% Triton X-100 für 10 min (um die Zellinhalte freizusetzen), bevor Messzelle -assoziierten Gesamtradioaktivität. </li><li> Zur Messung 125 I wiederNCS beim Transport oder aufgrund möglicher Abbau ersten Mischung 300 ul Probe (von der oberen, unteren oder Zellfraktionen) mit 700 ul 3% BSA in PBS und 200 ul Trichloressigsäure (TCA) vermietet. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min. Inzwischen ist diese Zeit, messen Sie die Radioaktivität dieser Probe in einem Gamma-Zähler. </li><li> Zentrifuge TCA Proben bei 3000 g für 5 min auf intakte Protein (Pellets) aus dem abgebauten Proteins oder 125 I-Fraktion (Überstand) zu trennen. Quantifizierung der Radioaktivität des freien 125 I-Fraktion und subtrahieren Sie diesen Wert von der Gesamtradioaktivität gemessen vor der Zentrifugation. Dies wird die Menge an markiertem Protein, das nicht abgebaut wird. </li></ol> 4. Mechanismus der transepitheliale Transport Gezielte Nanotransporter <ol><li> Label-Albumin mit 125 I, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben und zuvor berichtet sieben. </li></ol> Anmerkung: Albumin ist ein 66,5kDa-Protein, und daher eine relativ große Substanz. Obwohl ein gültiges Steuer für passive Transport größerer Gegenstände (welche hier z. B. 200 nm NCs), sollte mit kleineren inerten Tracer-Moleküle, wenn das Studium Transport von kleineren Wirkstoffträger ersetzt werden (siehe Diskussion). <ol start="2"><li> Zu beurteilen, parazellulären Transport mit Albumin para Leckage Kultur Caco-2-Monoschichten auf Transwell-Einsätze, wie oben beschrieben. </li><li> Um die obere Kammer Medium über der Zellschicht, fügen Sie entweder allein 125 I-Albumin (Negativkontrolle, die die Basisniveau von Leckagen) oder 125 I-Albumin und nicht-radioaktiv markierten Antikörper-bezogene NCs (wie in Abschnitt 3.5 beschrieben). Bei 37 ° C für den gewählten Zeitintervall (s), die die untersuchten bei der Prüfung von NC Transport entsprechen sollte. Messen Sie TEER (Abschnitt 2.3) vor, während und nach der Inkubation, dann sammeln Sie alle Fraktionen für insgesamt 125 I und 125 I frei Messungen wie angegeben. Abschnitt 3 Hinweis: Die gleichzeitige Zugabe von 125 I-Albumin und nicht-radioaktiv markierten Kontroll-IgG NCs kann als Kontrolle verwendet werden. </li><li> Als positive Kontrolle für die Öffnung der interzellulären Kontaktstellen, fügen Zellmedien, enthaltend 5 mM H 2 O 2 zu der oberen und unteren Kammern des Transwell-Einsatzes, und bei 37 ° C für 30 min. Dann messen TEER (Abschnitt 2.3), und fügen Sie 125 I-Albumin in die obere Kammer für die ausgewählten Zeitintervallen. Messen Sie TEER zu verschiedenen Zeitpunkten während der Inkubationszeit zu TEER Wertverfall von H 2 O 2-induzierte Öffnung der Zellverbindungen verursacht zu identifizieren. </li><li> In parallelen Experimenten, bewerten transzellulären Transport, auch Transzytose, der 125 I-bezogene NCs durch Inkubation konfluenten Caco-2-Monoschichten mit entweder 50 &amp;mgr; M monodansylcadaverine (MDC; Inhibitor der Clathrin-vermittelte Endozytose), 1 ug / ml filipin (Inhibitor caveolare vermittelte Endozytose), 0,5 &amp;mgr; M Wortmannin (Inhibitor der Phosphatidylinosit-3-Kinase [PI3K], in Makropinozytose beteiligt sind) oder 20 &amp;mgr; M [5 - (N-Ethyl-N-isopropyl) Amilorid] (EIPA, Inhibitor Makropinozytose und CAM-vermittelte Endozytose 15). </li></ol> Hinweis: 125 I-IgG NCs und 125 I-Albumin als negative Kontrollen für die Wirkung dieser Inhibitoren verwendet werden, und andere Verfahren (z. B. siRNA-Techniken) können weitere selektive Hemmung bereitzustellen. <ol start="6"><li> Messen TEER (Abschnitt 2.3) vor, während und nach der Inkubation der Zellen mit Inhibitoren und radioaktiv markierten Materialien, als zusätzliche Kontrolle für die Wirkung der Inhibitoren auf die Monoschicht Durchlässigkeit. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Unter Verwendung der oben diskutierten Verfahren kann ein Zellmodell für die Untersuchung der Zieltransport NCs über zelluläre Barrieren geschaffen werden, wie das für Caco-2-Epithelzellen, die relevant für die Bewertung der Verkehrs GI Lumen in dem Blut in dem Fall vorgesehen ist beispiels der oralen Medikamentenabgabesysteme. Kultivierung von GI epithelialen Zell-Monoschichten in Transwell-Einsätzen aktiviert Messung TEER und Fluoreszenz-Immunfärbung von tight junctions, um die Bildung einer Zelle Permeabilitä...

Zellbarrieren im Körper als Gateway zwischen der äußeren Umgebung und Innenfächer. Dies ist der Fall für die epitheliale Auskleidung Trennen des außen freiliegenden Oberfläche des Magen-Darm-Trakt (GI) und den Blutkreislauf 1-3. Zellbarrieren auch stellen die Schnittstelle zwischen dem Blutstrom und dem Parenchym und zellulären Komponenten von Geweben und Organen. Dies ist der Fall für die innere endotheliale Auskleidung der Blutgefäße, wie beispielsweise Blut-Lungen-Schranke, Blut-Hirn-Schranke, etc. 1. Die Fähigkeit, diese Zellbarrieren im Körper zu durchlaufen ist entscheidend für die effiziente Abgabe von therapeutischen und diagnostischen Mitteln in den Kreislauf und Gewebe / Organen, wo Eingreifen erforderlich ist. Die Lieferung von therapeutischen oder diagnostischen Mittel zu verbessern, können diese Verbindungen in sub-Mikrometer Nanoträger (NCS) geladen werden. Diese Arzneimittelabgabeträger kann mit einer Vielzahl von formuliert werdenChemie und Strukturen des Drogen Löslichkeit, Schutz, Pharmakokinetik, Freigabe, 4,5 und Stoffwechsel zu optimieren. Nanokristalle können auch mit Affinität oder Targeting-Einheiten (z. B. Antikörper, Peptide, Zucker, Aptamere etc.) funktionalisiert werden, um die Haftung zu Bereichen des Körpers, wo die therapeutische Wirkung benötigt wird 2,6 zu erleichtern. Targeting von NCs Determinanten auf der Oberfläche der Zellbarrieren ausgedrückt kann der Transport noch weiter zu erleichtern, in und / oder über diese Auskleidungen 2,6. Die Rolle der selektiven Transport von Stoffen zwischen zwei Umgebungen erfordert bestimmte einzigartige Eigenschaften unter Zellschichten. Eine solche Funktion ist die Zellpolarität ist, wobei die apikale Membran, die das Lumen der Hohlräume hängt von der basolateralen Membran auf das Gewebe Interstitium orientiert, in Bezug auf Membranmorphologie und Zusammensetzung von Lipiden, Transporter, Rezeptoren und 2. Ein weiteres Merkmal beinhaltet inter junctions, die benachbarte Zellen. Regulierung der Proteine, die Tight Junctions, insbesondere junctional Adhäsionsmoleküle (Staus), Occludine und Claudinen bilden, modulieren die Barrierefunktion, um selektiv zu ermöglichen oder nicht Transport von Substanzen zwischen den Zellen, wie parazellulären Transport bekannt, die den Durchgang von Material aus dem Lumen der basolateralen Raum 3. Bindung von vielen natürlichen und synthetischen Elementen (Leukozyten, Moleküle, Partikel, und Wirkstoffabgabesysteme), um Zellbarrieren im Körper Zellöffnung Übergang zu induzieren, die flüchtig und relativ harmlose oder mehr verlängert werden kann, und daher unsicher Zutritt unerwünschten Substanzen über die Barriere 2,5,7-9. Folglich kann dieser Weg durch das Messen der transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) und passive parazelluläre Diffusion von Molekülen (hierin als parazelluläre Leckage) bewertet werden, wobei verringerten Widerstand auf einen elektrischen Strom oder eine erhöhte parazelluläre Leckage eines inert Verbindung in der basolateralen Raum geben Eröffnung der Zellverbindungen, bzw. 5,10,11. Um diese Verfahren zu ergänzen, kann jeder der oben aufgeführten tight junction-Proteine ​​gefärbt werden, um ihre Integrität zu beurteilen, wo Färbung sollte an den Zell-Zell-Grenzen auf der ganzen Peripherie der Zelle konzentriert 5,10,12 erscheinen. Alternativ Arzneimittelabgabesystemen, die spezifische Zelloberflächen-Determinanten, wie diejenigen, die Clathrin-beschichteten Vertiefungen oder kolbenförmigen Einstülpungen Membran genannt Caveolae assoziiert Ziel kann vesikuläre Aufnahme in die Zellen durch Endozytose auszulösen, wodurch ein Weg für die Arzneimittelabgabe zu intrazellulären Kompartimenten 5, 13. Darüber hinaus kann die Endozytose von Vesikeln mit dem Menschenhandel über die Zellkörper für die Freigabe an der basolateralen Seite, ein Phänomen, wie transyctosis bekannt oder transzellulären Transport 14 führen. Daher kann die Kenntnis der Kinetik und Mechanismus der Endozytose verwendet, um intrazelluläre ein auszunutzennd transArzneimittelAbgabe, die einen relativ sicheren und kontrollierten Art der Verabreichung bietet gegenüber den parazellulären Weg. Der Mechanismus der Endozytose kann mit Modulatoren der klassischen Wege (Clathrin-und Caveolin-vermittelte Endozytose und Makropinozytose) oder nicht-klassischen Wege ausgewertet werden ((CAM)-vermittelte wie bei der Zelladhäsionsmolekül Endozytose) 5,13,15 . Während intrazellulären Transport ist oft in Standard Brunnen oder Deck studiert, das Fehlen einer basolateralen Fach schließt Zellpolarisation und die Fähigkeit, den Transport durch Zellschichten zu untersuchen. Um dieses Hindernis zu überwinden, hat den Transport über lange Zellmonoschichten untersucht mit Transwell-Einsätze 10,11,16,17, die aus einem oberen (apikal) Kammer, einem porösen durchlässige Membran, wo Zellen befestigen und bilden eine dichte Monoschicht bestehen, und eine untere worden (basolateralen) Kammer (Abbildung 1). In dieser Konfiguration kann der Transport in die gemessen werdenapikal-zu-basolateral-Richtung durch die Verabreichung einer Behandlung in der oberen Kammer, nach dem Transport durch die Zellmonoschicht und der darunterliegenden porösen Membran, und schließlich das Sammeln des Mediums in der unteren Kammer für die Quantifizierung des transportierten Materials. Transport in der basolateralen-to-apikal kann auch durch anfängliche Verabreichung in die untere Kammer und die anschließende Sammlung aus der oberen Kammer 5,10,12,16 gemessen werden. Es gibt verschiedene Techniken, um die Bildung der Permeabilitätsbarriere auf Transwells, einschließlich TEER und parazellulären Transport-Assays zu überprüfen, wie oben beschrieben. Darüber hinaus kann das permeable Filter auf denen Zellen kultiviert werden zur Bildanalyse (z. B. durch Fluoreszenz, konfokale, Elektronenmikroskopie) entfernt werden, wie weitere Validierung der Zellmonolayer-Modell sowie dem Transportmechanismus. Auswahl des Membrantyps, die in unterschiedlichen Porengrößen, Materialien und Oberflächen verfügbar ist, hängt von verschiedenen factors wie die Größe von Stoffen oder Gegenständen, die transportiert werden, Zelltyp und Bildgebungsverfahren 16,18-20. Transwell-Einsätze im Vergleich zu komplexen Säugersystemen als Volumina der Kammern und der Zelloberfläche sind bekannte Konstanten gesteuerte und genaue Quantifizierung der Transport erleichtert auch. Während viele Faktoren bei der in-vivo-Lieferung beteiligt sind beseitigt, einschließlich der Anwesenheit von Darmschleim-, Scher-Stress, Verdauungsenzyme, Immunzellen etc., bietet dieses kleinen Maßstab in vitro-Modell nützlich vorläufige Informationen über Transport. Als ein Beispiel, um die Anpassung dieser Verfahren an NC Transport durch Zellbarrieren 10,11,16,17 studieren zu verdeutlichen, beschreiben wir hier einen Fall, wo das Potenzial für die NC-Transport über die GI Epithel wurde durch die Beurteilung Gang eines Drug-Delivery-Modell modelliert System durch eine Monoschicht von menschlichen epithelialen kolorektalem Adenokarzinom (Caco-2-Zellen). Hierzu cEllen wurden in Transwell-Einsätze, auf einem 0,8 &amp;mgr; m Poren Polyethylenterephthalat (PET)-Filter (6,4 mm Durchmesser), die transparent ist und kann zur Mikroskopie verwendet werden. Der Status der Permeabilitätsbarriere durch Messen TEER, apikale zu basolateralen Transport einer Kontrollsubstanz, Albumin und Fluoreszenzmikroskopie Visualisierung eines Elements der tight junctions, Occludinproteins validiert. Ein Modell des Ziel NC Polymer verwendet wird, die aus 100 nm, Polystyrol nicht biologisch abbaubaren Nanopartikel. NCs durch Oberflächenadsorption mit einem Targeting-Antikörper allein oder einer Kombination aus einer Targeting-Antikörper und einem therapeutischen Ladung, wobei jede Komponente mit 125 I-Radioisotop zur Verfolgung markiert werden beschichtet. Im gewählten Beispiel erkennt interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) der Antikörper, exprimiert ein Protein auf der Oberfläche von Epithelzellen GI (und anderer Zellen), von dem gezeigt wurde, um die intrazelluläre und transzellulären Transport o erleichtern<html> f Wirkstoffträger und ihre Ladungen 21. Die Ladung ist alpha-Galactosidase (α-Gal), ein therapeutisches Enzym zur Behandlung der Fabry-Krankheit, einer genetischen lysosomalen Speicherkrankheit 22 verwendet. Die beschichteten Nanokristallen, von etwa 200 nm groß sind, um die apikale Kammer über der Zellschicht für unterschiedliche Zeiträume, gegeben und bei 37 ° C inkubiert, wonach 125 mit der Zell-Monoschicht und / oder die zugehörige kann ich auf NCs erkannt werden auf die basolaterale Kammer unter den Zellen transportiert. Zusätzliche Bestimmung von freiem 125 I ermöglicht Subtraktion des abgebauten Fraktion und Schätzung von beschichteten NC Transport. Der Transportmechanismus wird durch die Veränderungen der Durchlässigkeit der Barriere in Bezug auf den parazellulären Weg, durch den oben beschriebenen Parametern, während transzellulären Transport wird durch die Veränderungen der Transportwege bei der Modulation der Endozytose und Transzytose bestimmt beurteilt. NHALT &quot;&gt; Diese Methoden liefern wertvolle Informationen über die Zellbarriere Modelle, das Ausmaß und die Geschwindigkeit des Transports von Drug-Delivery-System, und den Mechanismus solcher Transport, insgesamt die Auswertung des Potentials für die Arzneimittelabgabe über zelluläre Barrieren.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1x</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-37TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125Iodine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ033H002MC</td>
			<td>Radioactive hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Equitech Bio</td>
			<td>BAH-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>015-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)</td>
			<td>Marlin 1987</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Galactosidase, from green coffee beans</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8507-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC latex beads, 100 nm</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>17150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>234729-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA433-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-27151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monodansylcadaverine (MDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Wizard2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt-ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrodes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX100</td>
			<td>Electrodes available for different well-plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nano-ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers

Sub-Mikrometer-Träger (Nanotransporter; NCs) verbessern die Wirksamkeit von Arzneimitteln durch Verbesserung der Löslichkeit, Stabilität, Zirkulationszeit, Targeting, und loslassen. Zusätzlich ist für sowohl die orale Verabreichung von therapeutischen NCs in den Kreislauf und den Transport von Blut in Gewebe, in denen eine Intervention erforderlich ist Laufen Zellbarrieren im Körper. NC Transport durch Zellbarrieren wird erreicht durch: (i) der parazellulären Weg, über vorübergehende Unterbrechung der Übergänge, die benachbarte Zellen oder (ii) die transzelluläre Route, wo Materialien durch Endozytose internalisiert, in dem Zellkörper transportiert und sezerniert verzahnen auf der gegenüberliegenden Zelloberfläche (transyctosis). Liefer über zelluläre Barrieren können durch Kopplung Therapeutika oder ihre Träger mit Targeting-Mittel, die spezifisch an Zelloberflächenmarker in Transport beteiligt binden erleichtert werden. Hier stellen wir Methoden, um das Ausmaß und den Mechanismus der NC-Transport über ein Modell Zellbarriere, whi messenLm besteht aus einer Monolage von gastrointestinalen (GI) Epithelzellen auf einer porösen Membran in einem Transwell-Einsatz angewachsen. Bildung einer Permeabilitätsbarriere durch Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) transepithelialen Transport einer Kontrollsubstanz und Immunfärbung von tight junctions bestätigt. Als Beispiel sind ~ 200 nm NCs Polymer verwendet, das eine therapeutische Ladung tragen und mit einem Antikörper, der ein Zelloberflächen-Determinante zielt beschichtet. Der Antikörper oder das therapeutische Ladung mit 125 I-Radioisotop zur Verfolgung markiert und etikettiert NCs mit der oberen Kammer über die Zellschicht für unterschiedliche Zeiträume zugesetzt. NCs zu den Zellen und / oder an der darunterliegenden Kammer transportiert assoziiert erkannt werden. Messung von freiem 125 I ermöglicht Subtraktion des abgebauten Fraktion. Die parazellulären Weg ist durch die potenzielle Veränderung von NC Transport zu den oben beschriebenen Sperrparameter verursacht beurteilt. Transzellulären Transport is, indem sie die Wirkung der Modulation Endozytose und Transzytose Wege bestimmt.

Validierung der Zellmodell zu transepithelialen Transport von gezielten NCs studieren, Fig. 2 zeigt, dass die Caco-2-Zellmonolayer plattiert bei einer Dichte von 1,5 × 10 5 Zellen / cm 2 Konfluenz erreichten ~ 12. Tag gehalten und Mono Integrität bis zu Tag 18, von TEER (2A) angegeben. Dies wurde durch die Anwesenheit von Occludin-positiven Tight Junctions (2B) in Monoschichten mit hohen TEER (390 Ω × cm 2, Tag 14) bestätigt, im Ver...

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Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Viele therapeutische Anwendungen erfordern sicheren und effizienten Transport von Arzneistoffträger und ihre Ladungen über zelluläre Barrieren im Körper. Dieser Artikel beschreibt eine Anpassung der etablierten Verfahren, um die Geschwindigkeit und der Mechanismus der Medikamententransport Nanoträger (NCS) über zelluläre Barrieren, wie der gastrointestinalen (GI) Epithel auszuwerten.

Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

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46.0K Aufrufe.  University of Maryland.  Viele therapeutische Anwendungen erfordern sicheren und effizienten Transport von Arzneistoffträger und ihre Ladungen über zelluläre Barrieren im Körper. Dieser Artikel beschreibt eine Anpassung der etablierten Verfahren, um die Geschwindigkeit und der Mechanismus der Medikamententransport Nanoträger (NCS) über zelluläre Barrieren, wie der gastrointestinalen (GI) Epithel auszuwerten. 

Serie: Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menschliche Plazentaperfusion Modell

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Forschung

Biotechnik

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

In - vitro - Permeation von FITC-geladen Ferritine Über eine Ratte Blut-Hirn - Schranke: ein Modell für die Lieferung von Nanoformulated Moleküle zu studieren

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

Herstellung und Drug-Delivery-Anwendungen von Silk Nanopartikel

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

Eine experimentelle und Finite-Elemente-Protokoll den Transport von neutralen und geladenen gelösten Stoffen durch Gelenkknorpel zur Untersuchung

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Creating a Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte to Study the Role of Cellular Architecture in Cardiomyocyte Systems Biology

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal microscopy, the scientific community has unprecedented access to large datasets at sub-micrometer resolution that characterize the architectural remodeling that accompanies changes in cardiomyocyte function in health and disease. However, these datasets have been under-utilized for&#160;investigating the role of cellular architecture remodeling in cardiomyocyte function. The purpose of this protocol is to outline how to create an accurate finite element model of a cardiomyocyte using high resolution electron microscopy and confocal microscopy images. A detailed and accurate model of cellular architecture has significant potential to provide new insights into cardiomyocyte biology, more than experiments alone can garner. The power of this method lies in its ability to computationally fuse information from two disparate imaging modalities of cardiomyocyte ultrastructure to develop one unified and detailed model of the cardiomyocyte. This protocol outlines steps to integrate electron tomography and confocal microscopy images of adult male Wistar (name for a specific breed of albino rat) rat cardiomyocytes to develop a half-sarcomere finite element model of the cardiomyocyte. The procedure generates a 3D finite element model that contains an accurate, high-resolution depiction (on the order of ~35 nm) of the distribution of mitochondria, myofibrils and ryanodine receptor clusters that release the necessary calcium for cardiomyocyte contraction from the sarcoplasmic reticular network (SR) into the myofibril and cytosolic compartment. The model generated here as an illustration does not incorporate details of the transverse-tubule architecture or the sarcoplasmic reticular network and is therefore a minimal model of the cardiomyocyte. Nevertheless, the model can already be applied in simulation-based investigations into the role of cell structure in calcium signaling and mitochondrial bioenergetics, which is illustrated and discussed using two case studies that are presented following the detailed protocol.

This protocol outlines a novel method to create a spatially detailed finite element model of the intracellular architecture of cardiomyocytes from electron microscopy and confocal microscopy images. The power of this spatially detailed model is demonstrated using case studies in calcium signaling and bioenergetics.

Erstellen eines strukturell realistische Finite-Elemente geometrischen Modells von einer Cardiomyocyte zur Untersuchung der Rolle von zellulären Architektur in Cardiomyocyte Systembiologie

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Oberfläche Funktionalisierung der Hepatitis E Virus Nanopartikel chemische Konjugation Methoden

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Umfassende Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung mit drei komplementäre Methoden

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Gentranskription durch Umleiten zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetische Modifikatoren zu unterdrücken

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...